Изучение гена d-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного гена-супрессора опухолевого роста
Скачать 318.44 Kb.
|
Ген-инактивирующий тест (GIT – Gene Inactivaion Test)Для изучения функциональной роли D-глюкуронил С5-эпимеразы в процессе злокачественной трансформации был использован специальный тест, основанный на эффекте инактивации супрессорных генов в растущих экспериментальных опухолях (GIT – Gene Inactivation Test). Этот тест был специально разработан для проверки способности разных генов супрессировать развитие злокачественных опухолей in vivo (т.е. быть отнесенным к классу генов, супрессирующих развитие опухоли – Tumour Suppressor Gene – TSG). Его основная идея заключается в следующем - клетки раковой линии трансфецируются плазмидой, несущей исследуемый ген (А). Затем отбирают стабильно трансфецированные клоны (Б), которые инокулируют мышам линии SCID (Severe Combined Immunodeficiency) (В). Далее проводят анализ выросших опухолей (ПЦР, Вестерн блоттинг, иммуногистохимический анализ) (Г) и сравнение экспрессии исследуемого гена в клетках до инокуляции и в выросших из них опухолях (Д) (Рис.11). Основным критерием определения гена как TSG является факт исчезновения его экспрессии в экспериментальной опухоли: если ген является супрессором, то его экспрессия в опухолевых клетках будет тормозить их пролиферацию и опухоли не должны развиваться. Если опухоли вырастают, то значит, ген каким-то образом был инактивирован (например, произошла мутация или делеция).  Целевой ген А Отбор стабильных клонов Б В SCID Г Опухоли Анализ Д Рисунок 11. GIT – Ген инактивирующий тест (Gene Inactivation Test) (Protopopov et al., 2002). Для того, чтобы изучить возможный эффект восстановления экспрессии гена эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro и развитие экспериментальных опухолей in vivo, ген D-глюкуронил С5-эпимеразы был клонирован в экспрессирующие эписомальные вектора pETE/Bsd и pCEP4. Для этого полноразмерная кДНК эпимеразы была амплифицирована с плазмиды KIAA-00836-pBluescript (Kazusa DNA Research Institute, Japan), содержащей фрагмент кДНК эпимеразы, укороченный с 5'-конца. Для реакции амплификации был синтезирован длинный олигонуклеотид, который использовался в качестве прямого праймера при наработке ДНК эпимеразы методом ПЦР (Рис. 12).  Pисунок 12. Схема клонирования D-глюкуронил С5-эпимеразы в векторa pETE/BSD и pCEP4. Далее проводилась рестрикция вектора pETE и наработанного фрагмента ДНК эпимеразы по сайтам NotI и BglII и их лигирование. Для переклонирования гена эпимеразы из вектора pETE/BSD в вектор pCEP4 фрагмент ДНК эпимеразы нарабатывался с использованием ПЦР с матрицы epi-pETE/BSD, далее проводилась рестрикция вектора pCEP4 и ДНК эпимеразы, и их лигирование. Последовательность D-глюкуронил С5-эпимеразы в конечных конструкциях была подтверждена секвенированием. Полученные конструкции со вставкой гена D-глюкуронил С5-эпимеразы обозначались как epi-pETE и epi-pCEP4. Влияние экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы на рост стабильно трансфецированных клонов.Полученные конструкции epi-pETE/Bsd и epi-pCEP4 были использованы для восстановления экспрессии эпимеразы в клетках мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и клетках карциномы предстательной железы линии LCNaP. Была проведена трансфекция клеточных линий U2020 и LNCaP конечной конструкцией epi-pETE/Bsd, полученные клоны были обозначены как epi-U2020 и epi- LCNaP. Трансфекцию клеточной линии MCF7 проводили конструкцией epi-pCEP4, полученные клоны были обозначены как epi-MCF7. В качестве контроля проводили трансфекцию пустыми векторами pETE/Bsd и pCEP, полученные клоны обозначали как pETE-U2020, pETE-LCNaP, pCEP-MCF7. После трансфекции были отобраны стабильные клоны, наличие экспрессии эпимеразы в которых было проверено методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Рис. 13А). А. Б.   Клетки рака молочной железы линии MCF7  pETE-LNCaP  Epi-LNCaP, кл.4 Epi-LNCaP, кл.5 Epi-LNCaP Клетки рака предстательной железы линии LNCap   pETE-U2020 pETE-U2020, клоны Epi-U2020, клоны Epi-U2020 Клетки рака легкого линии U2020 Рисунок 13. Влияние D-глюкуронил С5-эпимеразы на пролиферацию опухолевых клеток in vitro. А. Электрофореграмма экспрессии гена эпимеразы в стабильных клонах по сравнению с иходными клеточными линиями. Наибольшей экспрессией обладают epi-MCF7 клон 3, epi-LNCaP клон 5, epi-U2020 клоны 4, 7, 8. Б. Кривые пролиферации стабильных клонов epi-MCF7 1, 3, 4, pCEP4-LCNaP, 5, epi-U2020 4, 7, 8 с использованием CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Восстановленный уровень экспрессии эпимеразы в клонах epi-MCF7 кл.3, epi-LNCaP кл.5 и epi-U2020 кл. 4 , кл.7 и кл.8 был значительно выше, чем в контрольных клонах с пустыми векторами (Рис. 13 А). Стабильные клоны с наивысшей экспрессией эпимеразы были использованы для определения пролиферативной активности клеток методом CyQUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen), позволяющим определять содержание клеточной ДНК при связывании ее со специфическим флуоресцентным красителем. Измерения флуоресценции проводились каждые 24 часа и по полученным данным строили прямую линию, угол наклона которой и определяет скорость клеточного деления (Рис. 13 Б). Из приведенных графиков видно, что во всех клеточных линиях эпимераза тормозила скорость деления клеток in vitro, хотя и в разной степени. Поскольку снижение пролиферации наблюдалось в клеточных линиях различного гистохимического происхождения (мелкоклеточного рака легкого линии U2020, клетках карциномы молочной железы линии MCF7 и карциномы предстательной железы линии LCNaP), то можно предположить, что D-глюкуронил С5-эпимераза может обладать ткане-неспецифичным антипролиферативным эффектом. Для подтверждения возможной антипролиферативной активности D-глюкуронил С5-эпимеразы необходимо было провести эксперименты in vivo. |
Похожие:
 | Реферат по проекту рнп 2 4186 Отчет 55 с., 8 ч., 15 рис., 2 табл., 124 источников, 1 прил Ортологи гена sbr имеются у всех исследованных на этот предмет эукариот. Мутантные аллели гена | | Рнп 2 16050 “Изучение экспрессии гена sup35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae” реферат Рнп 2 16050 “Изучение экспрессии гена sup35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae” |
| Тестовые задания по специальности Существенность гена у патогенного организма кодируемый геном продукт, необходимый для | | Фенилкетонурия Этиология и патогенез. В результате мутации гена, контролирующего синтез фенилаланингидроксилазы, развивается метаболический блок... |
 | 2 полка (1 ряд) (2 ряд) Отечественные мультфильмы: «Крокодил Гена и Чебурашка», «Бременские музыканты», «38 попугаев» | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Познакомить и вспомнить произведение Э. Н. Успенского “Крокодил Гена и его друзья” |
| Получение и характеристика трансгенных мышей с генами гемопоэтических... Получение и характеристика трансгенных мышей с генами гемопоэтических факторов человека (г-ксф и гм ксф) под контролем 5’-регуляторной... | | Урок чтения в 1 классе по теме: Э. Успенский «Крокодил Гена и его друзья» Вспомните, у кого из героев нашего учебника Чебурашка – любимая игрушка? (у Кати Персиковой) |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Тема урока: Э. Н. Успенский «Чебурашка» ( из сказки «Крокодил Гена и его друзья») | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Э. Успенский «Крокодил Гена и его друзья», «Вера и Анфиса», «Вниз по волшебной реке» |
| Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений ... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Пока два ученика рисуют на доске схему рефлекса кашля, которую они приготовили дома, вспоминаем механизм рефлекса. Гена с Димой показывают... |
| Классный час во 2-3 классах «Царевна-лягушка», «Конёк-Горбунок», «Сказка о царе Салтане», «Сивка-бурка», «Волк и семеро коз лят», «Колобок», «Гуси-лебеди», «Крокодил... | | Фармакогенетическое значение полиморфизмов гена β2-адренергического... Работа выполнена в гбоу впо первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России |
| Роль аномалий гена bcr-abl в развитии резистентности к терапии иматинибом... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный... | | Общая характеристика работы Целью настоящей работы является изучение взаимодействия производных хлорофилла а с бис (N,N-диметиламино)метаном как возможного метода... |
