Диссертация на соискание ученой степени
Скачать 1.82 Mb.
|
| Федеральное государственное бюджетное учреждение Научный центр Неврологии РАМН На правах рукописи Коновалова Евгения Викторовна Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук 03.01.04 – биохимия Научный руководитель: доктор биологических наук, Федорова Татьяна Николаевна Москва 2013 СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Окислительный стресс и антиоксиданты 1.1.1. Роль активных форм кислорода в нормальных и патологических условиях 1.1.1.2. Кислородные радикалы и их повреждающее действие на клетку 1.1.1.3. Окисление и продукция свободных 1.1.2. Антиоксидантная система клеток 1.1.3. Карнозин и родственные ему соединения 1.1.4. Нанопрепараты и их применение 1.1.5. Окислительный стресс и мозг 1.1.6. Апоптоз и некроз как возможные пути гибели нервных клеток 1.1.7. Свободнорадикальное окисление липидов и антиоксидантная терапия при заболеваниях ЦНС. 1.2. Возможности изучения механизмов развития окислительного стресса на разных биологических объектах, включая клеточные культуры. 1.2.1. Экспериментальные модели окислительного стресса. 1.2.2. Клеточные культуры для изучения ОС.1.2.2.1. Гранулярные клетки мозжечка.1.2.2.2. Клеточная культура PC-12 1.3.NMDA рецепторы и клеточный сигналинг.1.4.Индукторы окислительного стресса. 1.4.1. NMDA 1.4.2. Гомоцистеиновая кислота 1.4.3. Полиамины 1.4.4. Пероксид водорода 1.4.5. Акролеин 1.5.Проточная цитометрия ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Моделирование окислительного стресса на культуре клеток РС12 in vitro. 2.1.1. Характеристика клеточной культуры. 2.1.1.1. Культивирование клеток. 2.1.1.2. Подготовка клеток для анализа. 2.1.1.3. Дифференцировка клеточной культуры с помощью дексаметазона и NGF-β 2.1.2. Определение уровня активных форм кислорода и клеточной смерти методом проточной цитометрии 2.1.2.1. Проточная цитометрия. 2.1.2.2. Определение уровня активных форм кислорода (АФК). 2.1.2.3. Определение доли мертвых клеток 2.1.3. Определение экспрессии NMDA-рецепторов методом непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания антителами. 2.2.Способы индукции окислительного стресса 2.2.1. Пероксид водорода 2.2.2. N-метил-D-аспартат 2.2.3. Гомоцистеиновая кислота 2.2.4. Полиамины 2.2.5. Акролеин 2.3. Введение карнозина и нанолипосомальных конструкций на его основе в клеточную культуру PC-12 при моделировании ОС. 2.3.1. Схема экспериментов. 2.3.2. Приготовление нанолипосом, содержащих карнозин 2.3.2.1. Измерение размеров 2.3.2.2. Выбор оптимальной липидной композиции 2.3.3. Карнозинсодержащие нанолипосомы 2.3.4. Определение содержания карнозина в составе нанолипосом по диазореакции 2.4. Приготовление растворов. 2.5. Экспериментальные исследования in vitro и in vivo на быстро стареющих мышах линии SAM 2.5.1. Окислительный стресс in vitro 2.5.2. Выделение гранулярных клеток мозжечка. 2.5.3. Окислительный стресс in vivo 2.5.4. Устойчивость мышей к гипоксии 2.5.5. Определение общей антиоксидантной 2.6. Статистическая обработка результатов 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка защитного действия карнозина в составе нанолипосом в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo 3.1. Морфологическая характеристика клеточной культуры PC12, дифференцированной дексаметазоном и фактором роста нервов rHuNGF. 3.2. Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном или фактором роста нервов NGF. 3.3. Индукция окислительного стресса различными химическими агентами в недифференцированных и дифференцированных клетках PC12. 3.3.1. Индукция окислительного стресса при действии NMDA и Н2О2 3.3.1.1. Интактные клетки PC12. 3.3.1.2. Интактные клетки PC12 в условиях окислительного стресса. 3.3.1.3. Влияние H2O2 и NMDA на рост АФК в клетках РС12, дифференцированных по нейрональному типу 3.3.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на клетки PC-12 3.3.2.1. Влияние гомоцистеиновой кислоты на развитие окислительного стресса в недифференцированных клетках PC-12 3.3.2.2. Влияние гомоцистеиновой кислоты на рост АФК в клетках PC-12, дифференцированных по нейрональному типу 3.3.3. Влияние полиаминов на клетки PC-12 3.3.3.1. Влияние спермина, спермидина и путресцина на недифференцированную клеточную культуру PC-12. 3.3.3.2. Влияние полиаминов на рост АФК и гибель клеток РС12, дифференцированных по нейрональному типу 3.3.4.Токсическое действие акролеина на клетки РС-12 в зависимости от его дозы и времени инкубации 3.3.4.1. Влияние акролеина на рост АФК. 3.3.4.2. Влияние акролеина на гибель клеток PC-12 3.3.4.3. Влияние акролеина на морфологические изменения клеток РС-12. 3.4. Защитное действие карнозина на клетки PC-12, в условиях окислительного стресса, индуцированного акролеином. 3.4.1. Защитное влияние карнозина на рост АФК. 3.4.2. Защитное влияние карнозина на гибель клеток. 3.5. Защитное действие карнозина на клетки PC-12, дифференцированные по нейрональному типу 3.5.1. Исследование влияния карнозина на клетки РС12, инкубированные с перекисью водорода. 3.5.2. Влияние карнозина на дифференцированные клетки PC-12 в условиях окислительного стресса, индуцированного гомоцистеиновой кислотой. 3.5.3. Оценка антиоксидантной активности карнозина в составе нанолипосом. 3.6. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на дифференцированные клетки РС12 в условиях ОС, индуцированного полиаминами. 3.6.1. Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на уровень АФК клеток РС12, при инкубации их с полиаминами. 3.6.2. Влияние карнозина и нанокарнозина, включенного в состав нанолипосом на гибель клеток РС12, индуцированную полиаминами. 3.7. Защитное действие нанолипосомальных структур, содержащих карнозин на нейроны головного мозга мышей линии SAMP1/SAMR1 в условиях окислительного стресса 3.7.1. Окислительный стресс in vitro 3.7.2. Окислительный стресс in vivo 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 5. ВЫВОДЫ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АФК- активные формы кислорода ВЖ- время жизни ВПП- время до потери позы ВР- время реституции ГЦ- гомоцистеин ГЦК-гомоцистеиновая кислота ДФПГ- 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразил КСЛ- карнозинсодержащие липосомы ОГГ-острая гипобарическая гипоксия ОС- окислительный стресс ЦНС- ценральная нервная система DCF-dichlorfluoresceine NGF –nerve growth factor NMDA –N-methyl-D-aspartate PC-12-клетки феохромоцитомы PI- propidium iodide SAMP- senescence accelerated mice (prone) SAMR- senescence accelerated mice (resistant) ВВЕДЕНИЕ В настоящее время развитие окислительных реакций в различных биологических структурах рассматривается как один из основных повреждающих механизмов. Особенно значимыми эти процессы являются для нервной системы, что связано с избирательной чувствительностью клеток возбудимых тканей к окислительной деструкции. (Karnaukhov V., et al., 2008). Показано, что развитие окислительного стресса (ОС) активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза или некроза (Luk'ianova L., et al., 1989; Majno G., and Joris I., 1995; Nicotera P. and Lipton S., 1999) Окислительные повреждения мозга рассматриваются современной наукой как значимый фактор патогенеза заболеваний ЦНС. В связи с этим, разработка новых антиоксидантных препаратов сохраняет высокую актуальность и имеет хорошие фармакологические перспективы. В последние годы, как в России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности применения нанокомплексов на основе фуллеренов, ферригидрита, синтетических полимеров и липосом и других нанокострукций. Принципиально значимыми являются данные о способности различных наноструктур преодолевать гематоэнцефалический барьер, проявлять антиоксидантные и нейропротекторные свойства, а также возможность их адресной доставки в мозг. Физико-химические особенности наноразмерных структур делают их перспективными для создания новых лекарственных препаратов (Сейфулла Р.Д., 2012; Amstad, E. et al. 2011; Heng H.et al.2010) Природным протектором клеток и тканей от окислительного стресса является дипептид карнозин - антиоксидант прямого и непрямого действия. Его существенной особенностью является легкое включение в метаболические процессы с образованием используемых в обмене веществ метаболитов, гистидина и β-аланина. ( Болдырев А.А. и соавт. 2002; Boldyrev A., 2012; Boldyrev A et al. 2013). Повысить эффективность действия карнозина можно путем его модификации, обеспечивающей устойчивость дипептида к действию карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для активного центра фермента. В данной работе на биологических моделях in vitro и in vivo впервые предпринята попытка использовать карнозин, включенный в состав фосфолипидных наноструктур, для защиты от окислительного повреждения. В настоящее время для решения целого ряда научных задач в условиях in vitro используется клеточная культура линии РС-12. Опухолевая клеточная линия PC-12 была впервые получена в 1976 г. из хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечников (Greene L.,Tischier A.,1976). Особенностью этих клеток является их способность к образованию нейритов в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene L., Tischier A.,1976). Дифференцировка клеток сопровождается такими характерными признаками, как формирование нейронального фенотипа, экспрессия нейрональных маркеров и секреция нейротрансмиттеров, а также определённая последовательность событий в клетке во время пролиферации, (Vandry et.al., 2002; Wesering, Ewing, 2008). |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Список членов совета д 212. 232. 23 по защите диссертаций на соискание... Утвердить прилагаемую Стратегию развития медицинской науки в Российской Федерации на период до 2025 года | | Список членов совета д 212. 232. 10 по защите диссертаций на соискание... Целью преподавания дисциплины «Физиология человека» является овладение студентами системой знаний об основах анатомии и физиологии... |
| Пьесы исхаки на тему интеллигенции аспект «новой драмы» Диссертация... Драма утраченного идеала | | Выходные данные: Диссертация на соискание ученой степени магистра.... Министерство обазования и науки Российской федерации Санкт-Петербургский государственный политехнический университет |
 | Список членов совета д 212. 232. 02 по защите диссертаций на соискание... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов по специальности 030501. 65... | | Е. Б. Особенности гражданско-правового регулирования договора патентной... Абдакимова, Д. А. Источники международного права интеллектуальной собственности : автореферат диссертации на соискание ученой степени... |
| Информационные технологии в контексте постмодернистской философии... Именно необходимость философского осмысления этих двух знаковых для нынешней эпохи феноменов и определяет актуальность настоящего... | | Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата филологических наук. Саратов, 1974 Котюрова М. П. Лингвистическое выражение связности речи в научном стиле (сравнительно с художественным) : Автореферат диссертации... |
| Обучение рефлексии в «offline» и «online» коммуникации на курсе «Организационный... Ание ученой степени кандидата филологических наук (Иванова И. Г., Васильева Н. И., Балышева К. А., Митрофанова Т. А., Романова Е.... | | Памятка соискателю ученой степени кандидата наук Памятка предназначена для аспирантов и соискателей, готовящих диссертацию к защите на соискание ученой степени кандидата наук, а... |
| Основы криминалистического учения о потерпевшем : Диссертация на... Заочная (сокращенная) на базе среднего профессионального образования форма обучения 10 | | Бессонов правовая государственность в условиях глобализации: социально-философский... Работа выполнена на кафедре общегуманитарных наук Калужского филиала Московского гуманитарно-экономического института |
| Высшего профессионального образования «владимирский институт бизнеса»... Памятка предназначена для аспирантов и соискателей, готовящих диссертацию к защите на соискание ученой степени кандидата наук | | Шизофрения и расстройства шизофренического спектра, коморбидные сердечно-сосудистой... Автор: Жигунова Г. В., кандидат философских наук, доцент кафедры «социальных наук» |
| Гомеостатическая функция почек и состояние гемодинамики после водно-солевых... Ание ученой степени кандидата филологических наук (Иванова И. Г., Васильева Н. И., Балышева К. А., Митрофанова Т. А., Романова Е.... | | Воспитание эстетической культуры школьников в условиях дополнительного... Методические пособия 1 и 2, выданные на семинаре в мае 2011 г. (Правила международных соревнований по прыжкам на лыжах и лыжному... |
