Принципы полимеразной цепной реакции





Скачать 207.28 Kb.
НазваниеПринципы полимеразной цепной реакции
Дата публикации29.05.2015
Размер207.28 Kb.
ТипДокументы
100-bal.ru > Литература > Документы
ГБОУ города Москвы Гимназия №1505

«Московская городская педагогическая гимназия-лаборатория»

Реферат

Принципы полимеразной цепной реакции

Автор: ученица 9 класса «А»

Генерозова Анна

Руководитель: Шалимова Е.Г.

Москва

2014
Оглавление


Введение……………………………………………………………… стр.3
Глава 1. Предпосылки для разработки метода ПЦР.………………. стр.4

Глава 2. История разработки ПЦР ………………………………..... стр.5

Глава 3. Механизм полимеразной цепной реакции………………… стр.7

3.1.Компоненты реакционной смеси………………………………….. стр.8

3.2.Стадии полимеразной цепной реакции………………………….. стр.9

3.3. Циклы ПЦР реакции……………………………………………… стр.12

Глава 4. - Анализ ПЦР - продуктов………………………………….. стр.14

Глава 5. - Области использования ПЦР…………………………….. стр.17

Заключение……………………………………………………………. стр.18

Список литературы……………………………………………………. стр.19


Структура работы. Реферат состоит из введения, пяти глав, заключения и списка литературы. Список литературы содержит 6 научных и научно-популярных источников.

Введение.

С момента открытия структуры молекулы ДНК и установления ее роли в наследовании признаков перед молекулярной биологией встал вопрос разработки адекватных лабораторных методов, которые позволяли бы эффективно анализировать ДНК. Очень часто прежде чем выполнять какие-либо манипуляции с исследуемым участком ДНК его необходимо иметь в достаточном количестве. В лабораторной практике выделить много ДНК из исследуемых образцов удается не всегда. С другой стороны, выделять всю геномную ДНК, содержащую все гены организма тоже большого смысла нет, если запланировано исследование вполне определенного участка генома. На помощь приходит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), открытый в 1985 году. Он позволяет в лабораторных условиях специфически «умножить» (синтезировать) нужный фрагмент ДНК и получить его в достаточных количествах для последующих аналитических процедур. В настоящее время этот метод широко применяется во многих областях, как в научных экспериментах, так и для проведения медицинских анализов: в диагностике инфекционных и генетических заболеваний, криминалистике и в персонализированной медицине.

Тема моего реферата посвящена методу ПЦР. Полимеразная цепная реакция — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий значительного увеличить концентрацию определённых фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Актуальность темы. Введение ПЦР в арсенал научных методов в свое время послужило основой для интенсивного развития других технологий генетического анализа, таких как секвенирование (чтение структуры) ДНК, методов генной инженерии. В области медицины внедрение технологии ПЦР, стало, безусловно, знаменательным событием, так как оно радикально расширило возможности изучения патогенеза заболеваний, принципиально усовершенствовало диагностику и даже обозначило новые подходы к лечению. Всё более распространённым становится метод молекулярной диагностики, основанный на ПЦР, дающей оптимальное сочетание высокой чувствительности и специфичности. Таким образом, эта тема является актуальной для современной науки и медицины.

Целью моего исследования является изучение принципов метода ПЦР, условий его проведения, способов его использования.

Проблема моего проекта заключается в том, что для большинства учащихся средней и старшей школы исследования в области молекулярной биологии являются одной из сложных тем для понимания. И уж точно, большинство современных школьников вряд ли хорошо разбираются в методах молекулярной биологии, поскольку научная литература, рассказывающая об этих методах, написана тяжёлым, для понимания школьниками, научным языком.

Задачей моей работы является изложение основных принципов метода полимеразной цепной реакции простым и доступным языком, чтобы тема одного из самых популярных методов в молекулярной биологии стала ясной и понятной для каждого, кто в этом заинтересован.
Глава 1. Предпосылки для разработки метода ПЦР.

Предпосылками для разработки метода ПЦР стали, безусловно, предыдущие научные достижения, которые охарактеризовали структуру ДНК и доказали ее значение и роль как универсального среди всех живых организмов носителя генетической информации с уникальным четырехбуквенным кодом.

И. Мишер впервые выделил и описал дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) еще в 1869 году, но биологическая функция нового вещества была не ясна. Вплоть до середины 50-х годов 20 века способы хранения и передачи наследственной информации оставались неизвестными. Предполагалось, что за эту функцию отвечают белки. Но про ДНК уже было известно, что это полимер, состоящих из четырех типов мономеров - дезоксирибонуклеотидов. В 1949-1951 годах группой биохимика Э. Чаргаффа было даже сформулировано правило про количественные соотношения между разными типами азотистых оснований, так называемое «правило Чаргаффа». Согласно этому правилу соотношения четырех мономеров аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), оказались следующими: количество аденина равно количеству тимина, а гуанина — цитозину: А=Т, Г=Ц. Это правило существенно помогло позже при расшифровке структуры ДНК и определении принципа комплементарности, который был открыт в 1953 году учёными Дж. Уотсоном и Ф. Криком.

Уотсон и Крик опубликовали свои данные не только о структуре ДНК, которую они представили в виде двойной спирали, удерживаемой комплементарными основаниями в соседних цепочках ДНК. Пары аденин-тимин (А-Т) и гуанин-цитозин (Г-Ц), но и высказались о возможном механизме копирования ДНК путём матричного синтеза. В частности, они указали на то, что определённая последовательность оснований является кодом, который несёт генетическую информацию. Чуть позже, окончательно к 1965 году и этот вопрос был решен. Было установлено, что для кодирования всех 20 аминокислот, представленных в белках как животных, так и растений достаточно последовательности из трёх нуклеотидов. Такой набор получил название триплет. В конечном итоге, выяснилось, что всего существует 64 варианта смысловых триплетов, кодирующих все аминокислоты. То есть код является даже избыточным, что, в прочем, делает его более надежным.

После этих краеугольных событий в молекулярной биологии встал вопрос о необходимости разработки эффективных методов анализа ДНК. Это в первую очередь касалось методов анализа последовательности нуклеотидов, то есть «чтения» текста ДНК. Ведь были изучены только принципы структурной организации ДНК. А методы анализа последовательности были очень трудоемкими и непроизводительными. Но не было не только методов «чтения», не было и других удобных способов работы с таким материалом, как ДНК. Его надо было научится хорошо выделять, фрагментировать («резать»), соединять фрагменты друг с другом. И, самое главное, не было метода, который бы позволил увеличить искусственным путем какой-либо фрагмент ДНК для последующей работы.

В этом отношении, уместно сравнить работу с ДНК с работой над текстом книги. Ведь ДНК является носителем информации, так же, как и текст в книге. Предположим, что мы работаем над определенной главой редкой книги, единственный экземпляр которой лежит в библиотеке. Мы можем взять книгу, отксерокопировать нужную главу в нескольких копиях и дальше взять эти копии домой или раздать для работы ученикам в классе. При этом ценная книга остается в библиотеке – мы просто скопировали и умножили текст. То же самое было необходимо и для работы с ДНК. Если мы изучаем («читаем», «режем», «склеиваем», разрушаем и т.д.) какой-нибудь определенный участок ДНК, то его, как правило, нужно на все эти процедуры достаточно много. Для этого не требуется брать всю «книгу» (геномную ДНК). Хотелось бы взять только нужный фрагмент и в большом количестве копий. Именно эту задачу и решил разработанный позже метод полимеразной цепной реакции. Об истории его разработки в следующей главе.
Глава 2. История разработки метода ПЦР.
Итак, необходимость метода для получения большого количества специфических фрагментов молекулы ДНК к концу 1960-х годов была как никогда актуальна. Следует отметить, что разработки метода полимеразной цепной реакции существовали и другие способы, направленные на увеличение количества копий фрагментов ДНК. Например, метод клонирования ДНК в бактериальные плазмиды. Но эти способы были хотя и точными, но достаточно сложными, а потому не эффективными.

Стало очевидно, что для работы с таким естественным природным полимером, как ДНК, лучше использовать те же методы, которые использует и живая клетка. В живом организме ДНК увеличивается/размножается в ходе естественной реакции – ДНК полимеризации, за которую отвечает специальный фермент, открытый в 1955 году - ДНК-полимераза. ДНК-полимераза «строит» новые нуклеотиды по матрице ДНК с учетом принципа комплементарности. Есть в арсенале клетки и другие «инструменты» для работы с ДНК. Ферменты рестрикции – для того, чтобы «резать», ДНК-лигаза – для того чтобы «сшивать» и другие. Однако использовать ДНК-полимеразу для наработки большого количества копий нуклеотидных кислот в первое время не удавалось. Сам фермент еще не научились получать в достаточном количестве и были проблемы с его стабильностью.

Были и другие проблемы. Известно, что ДНК-полимераза не может синтезировать ДНК просто так на «пустом» месте. Ей необходимо указать с какого участка надо начать синтез новой цепочки. В ходе репликации в живой клетке ДНК-полимераза ориентируется на затравки – небольшие фрагменты ДНК, которые уже «сидят» в нужном месте, откуда и начинается синтез. Для того, чтобы заставить ДНК-полимеразу заработать в искусственных условиях надо было научиться готовить такие затравки. Эти затравки называют праймерами, и они представляют из себя одноцепочечные искусственно синтезированные короткие молекулы ДНК с заданной последовательностью. Такие праймеры, диной в 15-20 нуклеотидов научились химическим способом получать в 1970 году. И уже в 1971 г. они были использованы для первой реакции, в ходе которой удалось построить заданный участок ДНК.

Но для того, чтобы получить не одну, а много копий ДНК необходимо реакцию синтеза повторить много раз. И тут возникла еще одна проблема. Реакция полимеризации проходит в пробирке. Для того чтобы праймеры «сели» на комплементарный им участок необходимо сначала поднять температуру до 94-95 градусов, чтобы нити двухцепочечной исследуемой ДНК расплелись, а затем охладить пробирку до 65 градусов, чтобы праймеры «сели» на свою мишень. ДНК-полимераза, которую использовали в то время не выдерживала нагрева до такой температуры. Поэтому ее добавляли уже после гибридизации праймеров и ее хватало только на один цикл синтеза. Если же еще раз нагреть пробирку, то фермент погибал.

Ситуация принципиально изменилась в 1975 году, когда была открыты термофильные бактерии, в частности бактерия Thermus aquaticus. Эти бактерии успешно выживают в горячих термальных природных источниках, таких как гейзеры и очевидно их ферменты были приспособлены к высоким температурам. Именно из Thermus aquaticus в 1976 году была впервые выведена термостабильная ДНК-полимераза, которая не боится нагрева до 95 градусов по Цельсию и используется в методе ПЦР.

Итак, к 1976 году уже были готовы все элементы конструктора, из которого можно было бы сделать метод ПЦР, но метода в том варианте, в котором он существует сейчас еще не было. Идея зациклить синтез, то есть повторять его много раз на одном и том же месте пришла в голову американскому учёному Кэрри Мюллису в 1983 году. По воспоминаниям ученого, идея циклической реакции родилась, когда он смотрел в дождливую погоду на работу стеклоочистителя своей машины. Если представить, что праймеры – затравки для реакции, расположены на краях лобового стекла, то щетки (ДНК-полимераза) будут протирать стекло только в этой области (от края до края) и этот процесс повторяется много раз. Для пробы Кэрри Мюллис использовал недавно открытую термостабильную ДНК-полимеразу и метод заработал! Всего за 30-35 циклов такой реакции удалось получить микрограммы специфического фрагмента ДНК. В 1985 году журнал Science опубликовал статью, об открытии ПЦР, а спустя четыре года (1989) объявил термостабильную ДНК-полимеразу молекулой года, поскольку она позволила добиться автоматизации ПЦР-реакции. Метод был успешно запатентован, а его разработчик Кэрри Мюллис в 1993 году стал лауреатом Нобелевской премии по химии именно за заслуги в разработке метода ПЦР.
Глава 3. Механизм полимеразной цепной реакции.
Полимеразная цепная реакция имеет ряд отличий от естественной репликации ДНК. Она осуществляется в пробирке, и позволяет получить не такие длинные фрагменты как в природе (до нескольких тысяч нуклеотидов), что в прочем удовлетворяет потребностям исследователей. Но ее преимущество в высокой копийности, так как позволяет за 1,5 часа получить из одной молекулы ДНК до 100 млрд. сходных по структуре молекул. Поскольку происходит многократное умножение числа копий, то эту реакцию часто называют реакцией амплификации (от англ. amplification – умножение), а приборы, в которых проводят ПЦР называют амплификаторами. Для удобства исходную ДНК (ту, которую мы собираемся умножать) называют матрицей или мишенью, а фрагменты ДНК, получившиеся после амплификации – ампликонами. Эта реакция очень проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и программируемый термостат - амплификатор.

3.1. Компоненты реакционной смеси.

В реакционной смеси содержатся все необходимые компоненты для проведения реакции. Первый самый необходимый компонент – это собственно исходная ДНК (матрица), которую мы анализируем. При его отсутствии специфический продукт амплификации не образуется, то есть реакция не пройдет.

Второй обязательный компонент - это олигонуклеотидные праймеры. Эти праймеры синтезируются искусственно в химической лаборатории на основе той последовательности ДНК, которая нужна исследователю. В реакции обязательно используются два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. Фактически праймеры, не только являются затравками для синтеза, но и физически ограничивают тот регион ДНК, который будет синтезироваться.

Третий компонент реакционной смеси – представляет из себя «строительный материал», используемый термостабильной ДНК-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК. Это дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, все четыре типа оснований: аденин, гуанин, тимин и цитозин, из которых и будет полимеризоваться новая цепь.

Четвертый компонент это Термостабильная ДНК — уже упомянутый фермент, обеспечивающий синтез новых цепей. Кроме «классической» Taq-полимеразы, выделяемой из Thermus aquaticus на сегодняшний день имеется выбор и других ферментов, получаемых биотехнологическим путем.

И, наконец, для эффективной работы ДНК-полимеразы, необходимо создать ей оптимальный солевые условия. Для этого готовится буферный раствор, содержащий оптимальную смесь катионов и анионов в определённой концентрации, со стабильным значением кислотности (pH).

Схематично все компоненты реакционной смеси можно представить на рисунке 1.

pcr1.gif

Рисунок 1. Основные компоненты реакционной смеси для ПЦР.

3.2. Стадии полимеразной цепной реакции.

ПЦР представляет из себя циклический процесс, насчитывающий, как правило, около 30-34 повторяющихся циклов. При этом каждый цикл состоит из трех последовательных этапов. Сама реакция проходит в одноразовой пластиковой миропробирке объемом 0,2-0,5 мкл., которую помещают в программируемый термостат – амплификатор. Задача амплификатора – поддерживать и быстро менять заданный температурный режим. На сегодняшний день выпускается очень много моделей амплификаторов для ПРЦ. Но на заре разработки метода ученые довольствовались набором кастрюль или других подходящих емкостей, с водой, нагретой до нужной температуры. При этом требовалась определенная сноровка для быстрого переноса пробирки из одной в другую кастрюлю.

Разберем подробнее те этапы, которые происходят в пробирке на каждом цикле реакции.

Этап 1 - денатурация ДНК.

В ходе этого этапа происходит расплетение цепей двунитевой ДНК. Это происходит из-за краткосрочного нагрева реакционной смеси до температуры в 94—96 °C. Денатурацией этот этап называется потому, что разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. При последующем охлаждении смеси будет происходить обратный процесс – ренатурация, в ходе которого комплементарные цепи «схлопнутся» обратно (рис.2). Но, если в смеси будут находится специфические праймеры, то они будут тоже гибридизоваться на комплементарные им участки. То есть будут, в какой-то степени конкурентами длинным цепям ДНК.

d:\gen\image031.jpg

Рисунок 2. Схематическое изображение процессов денатурации и ренатурации ДНК при нагреве и охлаждении.

Этап 2 - отжиг праймеров.


Отжиг праймеров – это устоявшийся в лабораторной практике термин, (англ. эквивалент - annealing) обозначающий гибридизацию олигонуклеотидных праймеров на комплементарную им область ДНК. Этот этап проходит при понижении температуры с 94 до 62-65 градусов Цельсия. Следует отметить, что как денатурация, так и отжиг – это достаточно быстрые этапы, занимающие около 30 секунд, но так как прибор не может моментально поменять температуру, то время между соседними этапами может достигать 1-1,5 минуты, в зависимости от модели амплификатора.

В результате присоединения праймеров образуются гибридные структуры (исходная ДНК-матрица + праймер), которые и будут являться местами затравки для синтеза новых цепей ДНК (рис.3).

d:\gen\pdi_s04_m01_02_c.png

Рисунок 3. Схематическое изображение процесса отжига праймера на матрицу ДНК,

Как уже отмечалось ранее, праймеры конкурируют с цепями исходной ДНК за место гибридизации. Но при правильном подборе концентрации праймеров всегда будет какое-то количество «нужных» гибридов, на основе который и пойдет синтез ДНК на следующем этапе. Эта стадия не является ферментативной, то есть происходит из-за физико-химических свойств тех молекул ДНК, которые добавлены в смесь. Но на самом деле фермент – термостабильная ДНК полимераза изначально уже добавлена в реакционную смесь, но пока не участвует в реакции. Можно сказать, что она мужественно «терпит» высокую температуру и вступает в игру на следующем этапе – этапе элонгации.

Этап 3 – элонгация цепей ДНК.

Элонгацией (удлинением) называют собственно процесс синтеза (репликации) ДНК. Этом этап инициируется понижением до оптимальной температуры, при которой начинает работать фермент термостабильная ДНК-полимераза. Синтез новой цепи ДНК осуществляется именно от того места, куда «отжегся» праймер, который ДНК-полимераза использует в качестве затравки. Полимераза всегда синтезирует вторую цепь от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Время этого этапа зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.

Таким образом, по завершении этапа элонгации в реакционной смеси будут присутствовать, как молекулы исходной ДНК, то и вновь синтезированные фрагменты, которые ограничены по своей длине местами, посадки двух праймеров. Иными словами, если представить, что до амплификации у нас в пробирке была одна молекула ДНК, по после первого цикла ПЦР в пробирке будут две копии этой молекулы: исходная и новая. Причем новая будет такого размера, который соотносится с зоной посадки праймеров на исходную матрицу ДНК.

Схематически все три этапа, проходящие в течении первого цикла ПЦР показаны на рис.4.

pcr2.gif

Рисунок 4. Схематическое изображение трех этапов ПЦР, в ходе первого температурного цикла реакции. Сферами условно обозначен фермент – термостабильная ДНК-полимераза.

3.3. Циклы ПРЦ реакции.

Огромным преимуществом и характерной чертой полимеразной цепной реакции является ее цикличность. Если последовательно повторить все три этапа первого цикла еще раз (запустить реакцию на второй цикл), то есть еще раз нагреть до 94 гр.(денатурировать), охладить до 65 гр. (отжиг праймеров) и подержать на температуре 72 гр. (элонгация цепей), то в ходе второго цикла ПЦР образуется уже не 2 копии ДНК, а четыре! А если продолжить циклы и дальше, то после 3-го цикла в пробирке будет восемь копий нужного фрагмента ДНК. То есть, с каждым циклом реакции, количество синтезируемых фрагментов увеличивается в геометрической прогрессии. Любители математики могут рассчитать, что если ПЦР будет проходить в идеальных условиях, то эффективность этой реакции можно будет описать следующей формулой:

А = М*(1+Е)n

Где А - количество ампликонов, М - начальное количество ДНК-мишеней, Е - эффективность реакции, n - число повторяющихся циклов амплификации. График накопления ампликонов такой идеальной ПЦР представлен на рис. 5.


Рисунок 5. График накопления продуктов ПЦР реакции. По оси х указано число циклов амплификации; по оси y – количество синтезированных ампликонов.
Такая цикличность реакции и обуславливает ее взрывной характер накопления продуктов. Даже если исходной для ПЦР была только одна молекула ДНК (что на практике почти никогда не бывает), то в течение 25 – 40 циклов происходит значительная их амплификация, т.е. проходит синтез большого количества специфических фрагментов ДНК. В практическом применении – это несколько десятков микрограмм ДНК, что более чем достаточно для всех последующих процедур. Тем не менее, следует помнить, что приведенная формула ПЦР основана на идеальных условиях. В реальности выход ПЦР продуктов может быть существенно ниже, но вполне достаточным для исследователя.

Таким образом, по своим физическим характеристикам – полимеразная цепная реакция представляет последовательный и многократно повторенный цикл смены температуры, а по биохимическим характеристикам – многократно повторяющийся синтез одних и тех же фрагментов ДНК. Типичный температурный график ПЦР реакции показан на рис.6.

Рисунок 6. Пример температурного графика типичной ПЦР реакции. Видно последовательное трехступенчатое изменение диапазона температур. (Снимок с экрана компьютера, управляющего ДНК-амплификатором).


Глава 4. Анализ ПЦР - продуктов.
После успешного прохождения ПЦР в пробирке находится большое количество специфичных фрагментов ДНК. Далее эти образцы могут использоваться для самых разных аппликаций: чтения последовательности ДНК (секвенирование), получения генно-инженерных конструкций и т.п. А в ряде случаев, например, в некоторых медицинских тестах ПЦР – является последним этапом анализа. Например, когда при помощи ПЦР анализируют есть ли в образце, полученном от больного бактериальная ДНК специфичная для каких-либо бактерий – возбудителей заболевания. В таких случаях надо «посмотреть» результат ПЦР, то есть убедиться, что у нас синтезировался или не синтезировался искомый фрагмент. Для этого существуют достаточно простые способы анализа или детекции ПЦР продуктов. Формально эти способы уже не относятся непосредственно к ПРЦ. Это пост аналитический этап. Но так как они широко применяются и достаточно просты, то в качестве примера можно рассмотреть наиболее распространенный в практике метод анализа ПЦР продуктов при помощи процедуры электрофореза в агарозном геле.

Принцип электрофореза основан разделении молекул ДНК по размеру. Так как исследователь заранее знает размер амплифицируемого фрагмента ДНК, то вместе с исследуемыми образцами он может провести процедуру электрофореза набора искусственных маркеров ДНК с известной длиной. Ориентируясь на показатели подвижности маркеров и сравнивая их с показателями подвижности в гель-электрофорезе полученных ампликонов можно сделать выводы о том, прошла ли реакция и насколько она прошла специфично.

Для процедуры гель-электрофореза часто используют природный полисахарид – агарозу, получаемую из агара. При нагревании и последующем остывании раствор агарозы полимеризуется в гель, напоминающий по своей структуре и пластичности мармелад. Для процедуры электрофореза агарозу полимеризуют в специальной форме, в которую вертикально вставляют гребенку (рис. 7). После полимеризации гребенку извлекают. В итоге получается пластина полимеризованной агарозы с лунками, оставшимися в тех местах где стояла гребенка.
d:\gen\загруженное.jpg d:\gen\загруженное (1).jpg
Рисунок 7. Подготовка агарозного геля для электрофореза. Справа показаны гребенки, необходимые для формирования лунок.
Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Аппарат представляет из себя ванночку с двумя электродами, заполненную токопроводящим буфером (рис.8).

d:\gen\загруженное (2).jpg

Рисунок 8. Прибор для горизонтального электрофореза.
Перед погружением в буфер в лунки агарозы, образовавшиеся после удаления гребенки аккуратно при помощи пипетки наносят несколько микролитров образца, получившегося в ходе ПЦР. Так же в одну из лунок наносят ДНК-маркеры с известными размерами. После этого прибор подключают к источнику постоянного тока и устанавливают небольшое напряжение на электроды (из расчет 10-15 Вольт на 1 см длины геля). Так как молекулы ДНК имеют отрицательный заряд, они начинают двигаться в геле от минуса к плюсу. Застывшая агароза образует пространственную решетку, которая тормозит передвижение молекул ДНК. Более короткие фрагменты ДНК двигаются быстрее («убегают» вперед), а длинные испытывают большее сопротивление и «притормаживают». Таким образом, через некоторое время, обычно 15-20 минут фрагменты ДНК в агарозном геле разделятся в соответствии со своим размером. После этого остается только посмотреть кто из них и насколько далеко убежал.

Но несмотря, на то, что после ПЦР по меркам молекулярной биологии мы имеет дело с гигантскими количествами ДНК в несколько микрограммов, просто так невооруженным глазом мы их не увидим. Для того чтобы визуализировать (увидеть) результаты электрофореза пластинку геля погружают в раствор красителя, который неспецифически связывается с ДНК. Чаще всего для этого используют 1-2% раствор бромистого этидия (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид). Бромистый этидий связывается с ДНК и при освещении ультрафиолетовым светом флюоресцирует ярким оранжевым цветом. Таким образом, для того чтобы увидеть ДНК в агарозном геле надо положить гель на источник ультрафиолетового излучения или посветить на него ультрафиолетовой лампой. Типичный пример электрофореза продуктов ПЦР реакции представлен на рисунке 9.


d:\gen\uoh_dna_lesson02_image2.gif

М 1 2 3 4

Рисунок 9. Электрофореграмма продуктов ПЦР реакции в агарозном геле. Слева указана шкала размеров фрагментов ДНК в нуклеотидных основаниях (bp), основываясь на маркере мол.веса. М – маркер молекулярного веса; 1 – образец ДНК с размером около 750 нт.; 2 образец ДНК с размером около 230 нт.; 3 – образец ДНК отсутствует (ПЦР-амплификация не прошла); 4 - образец ДНК с размером около 750 нт.
Так как исследователю заранее известен размер ожидаемого в ходе ПЦР фрагмента, то ориентируясь на полоски ДНК маркера с известными размерами фрагментов можно легко проинтерпретировать результат (см. пояснение к рис. 9).

Следует отметить, что электрофорез в агарозном геле является только одним из множества возможных способов оценки результатов ПЦР. Очень часто, если исследователь работает по отработанному протоколу, то результаты ПЦР не оцениваются и ампликоны сразу используются для дальнейших аналитических процедур. Но для тех методов, где ПЦР является конечным продуктом анализа, то есть используется как детектор в образце определенных ДНК мишеней (например, для анализа ДНК возбудителей заболеваний в медицине), гель-электрофорез в агарозном геле может служить простым и надежным способом оценки результата.
Глава 5. Области использования ПЦР.

На сегодняшний день метод ПЦР получил широкое распространение как в сугубо научных, так и прикладных технологиях анализа ДНК. С его помощью были реализованы масштабные исследования в области медицины и биологии. Подобно ксерокопированию печатного текста, метод полимеразной цепной реакции позволяет получить требуемое количество копий любого генетического текста, даже с его единичных копий.

В научных исследованиях – ПЦР это практически незаменимая технологическая ступенька при любых работах с ДНК. Разработаны модификации метода, позволяющие анализировать молекулы РНК, осуществлять количественный анализ ДНК в пробе. Разработаны модификации метода, использующие флуоресцентные метки непосредственно в ходе прохождения реакции. Метод ПЦР до сих пор является абсолютным лидером по цитированию в научных публикациях.

В областях более близких к повседневной практике метод ПЦР нашел широкое применение в медицине. В первую очередь в диагностике инфекционных заболеваний как бактериального, так и вирусного происхождения. Для ряда заболеваний, таких как вирусный гепатит С – ПЦР диагностика является единственным и безальтернативным способом диагностики. Для диагностики других заболеваний, ПЦР является хорошим дополнением других методов: микробиологических, иммунологических. Например, при диагностике туберкулеза ПЦР позволяет не только проверить в образце, полученном от больного наличие ДНК возбудителя (туберкулезной палочки), но и оценить его патогенные свойства (устойчивость к лекарствам). По сравнению с традиционными микробиологическими методами ПЦР – очень быстрый способ, позволяющий получить результат через несколько часов. ПЦР – так же и производительный метод. В одном клиническом образце можно одновременно определять наличие более 20 возбудителей. Так же метод активно используется при диагностике генетических заболеваний.

Неважно откуда выделена ДНК. Если есть хоть одна копия специфичного фрагмента, последовательность которого нам известна, ее наличие можно проверить методом ПЦР. Это обуславливает применение метода ПЦР и в криминалистике. В частности, для установления родства при анализе даже очень старых образцов, например, костной ткани.

Существует и много немедицинских областей применения метода ПЦР. В ветеринарии и растениеводстве. В пищевой промышленности: определение биологического загрязнения, анализ генно-модифицированных продуктов, оценка качества семян гибридных растений и другие области применения.

В заключении можно с уверенностью сказать, что разработка метода полимеразной цепной реакции является, безусловно, одним из самых важных открытий в области молекулярной биологии 20 века. Подобно изобретению микроскопа Левенгуком в 16 веке, эта разработка позволяет «посмотреть» невооруженным глазом на невидимый для всех мир ДНК.

Заключение

В своем реферате я выполнила все задачи, которые ставила перед собой. В исследовании о способе постановки ПЦР я рассказала об этапах, условиях протекания полимеразной цепной реакции. В работе я показала значение и перспективы использования одного из самых значительных методов в молекулярной биологии.

Таким образом, цели и задачи моей работы можно считать выполненными. Технология ПЦР является неотъемлемой частью рутинной лабораторной практики, продолжая при это совершенствоваться и развиваться. В дальнейшем я хотела бы на практике понять, как протекает и как используется данный метод.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


  1. «Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР)». Методическое пособие. ООО «ДНК-технология», Москва, 2012.

  2. «Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами». Календарь Р.Н., Сиволап Ю.М., Биополимеры и клетка. N11(3-4): 55-65. (1995).

  3. Генетическая инженерия. Щелкунов С.Н. Сиб. унив. изд-во, — 496 с.;илл. Новосибирск, 2004.

  4. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Глик Б., Пастернак. Пер. с англ. — Москва 2002.

  5. Искусственные генетические системы. Патрушев Л. И. Наука. Москва 2005.

  6. Ресурсы Интернет: Википедия (http://ru.wikipedia.org/wiki/ПЦР); сайт научно-производственной фирмы «Литех» (www.lytech.ru).

Добавить документ в свой блог или на сайт

Похожие:

Принципы полимеразной цепной реакции iconПринципы полимеразной цепной реакции
Структура работы. Реферат состоит из введения, пяти глав, заключения и списка литературы. Список литературы содержит 6 научных и...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПринципы полимеразной цепной реакции
Структура работы. Реферат состоит из введения, пяти глав, заключения и списка литературы. Список литературы содержит научных и научно-популярных...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПринципы полимеразной цепной реакции
Структура работы. Реферат состоит из введения, пяти глав, заключения и списка литературы. Список литературы содержит научных и научно-популярных...
Принципы полимеразной цепной реакции iconТема : «Цепная ядерная реакция деления урана. Ядерный реактор» Ролевой проект
Образовательная: объяснить механизм цепной ядерной реакции и условия ее протекания. Дать представление об устройстве и работе ядерного...
Принципы полимеразной цепной реакции iconРекомендации к уроку 23 Запись химической реакции (§ 17)
Цель урока. Научить записывать схемы химической реакции с использованием формул веществ и различать реагенты и продукты реакции,...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПринципы муниципального избирательного права
«принципы избирательной системы», «принципы выборов», «принципы организации и проведения выборов», «принципы избирательных прав»....
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Дайте определение скорости гомогенной реакции. Напишите формулу скорости гомогенной реакции. (скорость реакции, которая идёт в однородной...
Принципы полимеразной цепной реакции icon+2 их акцептором. В реакции (2) происходит перемещение электронов...
Окислительно-восстановительные реакции – реакции, протекающие с изменением степени окисления атомов, входящих в состав реагирующих...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
«Растворение. Растворы. Реакции ионного обмена и окислительно–восстановительные реакции»
Принципы полимеразной цепной реакции icon"Ионные уравнения"
Основные понятия темы: реакции ионного обмена, ионные реакции, ионные уравнения, молекулярные уравнения реакций, полные и сокращённые...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Реакции обмена – такие реакции, в которых электролиты обмениваются своими ионами
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Растворение. Растворы. Реакции ионного обмена и окислительно-восстановительные реакции, урок 7
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Ядерные реакции и термоядерные реакции. Ядерная энергетика. Биологическое действие радиоактивных излучений
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Эквивалент – это реальная или условная частица вещества, которая в кислотно-основной реакции эквивалентна одному иону водорода или...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Скорость гомогенной химической реакции определяется изменением количества вещества реагентов (или продуктов реакции) в единицу времени...
Принципы полимеразной цепной реакции iconПрограмма по формированию навыков безопасного поведения на дорогах...
Цель урока: создать условия для систематизации и углубления знаний учащихся о скорости химической реакции, факторах, влияющих на...


Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2013
контакты
100-bal.ru
Поиск