Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 402.73 Kb.
|
1 2
Министерство образования и науки Российской Федерации
НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 2 этапа Государственного контракта № П1706 от 23 сентября 2009 г. и Дополнение от 04 апреля 2010 № 1
Томск 2010 г. СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ по Государственному контракту П1706 от 23 сентября 2009 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт онкологии Сибирского отделения РАМН (НИИ онкологии СО РАМН)
РЕФЕРАТ Отчет 55 с., 1ч., 1 рис., 2 табл., 23 источн., 0 прил. Рак желудка, предраковое заболевание желудка, хромосомные аберрации, молекулярно-цитогенетические маркеры. В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 2 этапу Государственного контракта № П1706 «Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка» (шифр «НК-366П») от 23 сентября 2009 по направлению «Физико-химическая молекулярная и клеточная биология» в рамках мероприятия 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами» федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы и Дополнение от 04 апреля 2010 № 1. Цель работы - молекулярно-цитогенетическое профилирование эпителиальных тканей желудка при хроническом гастрите. Методы, использованные при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: метод фенольной экстракции ДНК из операционных и биопсийных образцов, ник-трансляция, сравнительная геномная гибридизация (comparative genomic hybridization, CGH). Инструментарий, использованный при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: люминесцентный микроскоп «Аxiostar» («Carl Zeiss»), установка для очистки воды «Milipore – Mili Q», микродозаторы для дозирования микрообъемов жидкостей, ПЦР-бокс «Биосан–UVT-S», низкотемпературная морозильная камера «Sanyo», флаконы для культивирования, среда RPMI 1640 «Sigma», люминесцентный микроскоп «Аxiostar» («Carl Zeiss»), CO2-инкубатор фирмы «Sanyo - MCO-5AC»,световой микроскоп «Микмед-6» фирмы «Ломо», трансилюминатор с камерой «Hi-Res EXvision» для анализа электрофореза в агарозном геле «Vilber Lourmat», амплификатор «Cordet research RotorGene-6000», термостат лабораторный ТАТ ТВЗ-25, персональный компьютер с выходом в Интернет, ГОСТ 7.32-2001, база данных Pubmed по биомедицинским публикациям. Дополнений нет. Содержание
Проведение 2 этапа исследований по проблеме: Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка ВВЕДЕНИЕ Злокачественные новообразования являются одной из главных причин заболеваемости, потери трудоспособности и смертности. В структуре смертности населения рак стоит на третьем месте, уступая лишь сердечнососудистым заболеваниям и травмам. Несмотря на огромное количество исследований, улучшение диагностических возможностей и терапии опухолей, рак остается угрозой здоровью и жизни населения. На сегодняшний день не вызывает сомнений мультифакториальная природа опухолей. Однако большинство специалистов сходится во мнении, что в основе патологических изменений в клетке и становлении ее на путь малигнизации лежат геномные нарушения. Поскольку опухолевые клетки отличаются большой гетерогенностью по типам, уровню и характеру нарушений генома, всегда существовал вопрос о первопричинности малигнизации, какого типа изменения генома являются толчком в становлении нормальной клетки на путь раковой. Следует отметить, что в настоящее время существует несколько альтернативных точек зрения на эту проблему. Кроме теорий о возникновении мутаций в генах-онкосупрессорах, генах контроля клеточного цикла, апоптоза, систем репарации ДНК, а также эпигенетической концепции канцерогенеза, существует гипотеза о возникновении в клетках нарушений хромосомного материала, что приводит к одновременному дисбалансу нескольких тысяч генов. Рак желудка является четвертой по частоте формой злокачественных новообразований и занимает второе место в структуре общей летальности от онкологических заболеваний. Опухоли данного органа представляют собой сложную структуру неоплазий, характеризующиеся различными клинико-морфологическими параметрами. В частности, одной из ключевых характеристик опухоли является ее гистологический тип. В соответствии с классификацией Лоурена выделяют два основных типа рака желудка: интестинальный и диффузный, развитие которых идет по разным патогенетическим путям, однако существуют и подтипы раковых опухолей желудка, имеющие более тонкие морфологические отличия. Кроме того, неоплазии желудка характеризуются показателями венозного и лимфогенного метастазирования, различной локализацией неопластического процесса, типом предракового заболевания, а также сложностью в диагностировании по причине отсутствия клинических проявлений на ранних стадиях. Наличие столь гетерогенной когорты опухолей данного органа с дифференциальными клинико-морфологическими характеристиками, с различным течением процесса и сопутствующих изменений в организме, наводит на мысль о потенциально различных типах нарушения хромосомного материала в опухолевых клетках, которые могут являться специфическими маркерами для определенного типа характеристики неоплазии. Однако, несмотря на то, что на сегодняшний день выявлен большой спектр хромосомных нарушений в опухолевых клетках желудка, существуют разногласия во взглядах на роль определенных хромосомных аберраций в процессах инициации и прогрессии рака желудка. Исследования с помощью стандартного метафазного анализа сфокусированы в основном на изучении происхождения неслучайных хромосомных нарушений. Однако эти исследования имеют ряд ограничений, связанных, прежде всего, со сложностью получения качественных препаратов метафазных хромосом, комплексной структурой нарушений, возможностью клональной селекции клеток с хромосомными аномалиями в условиях культивирования in vitro. Молекулярно-цитогенетические методы позволяют решать подобные проблемы путем исследования ДНК, выделенной непосредственно из опухолевой ткани, без приготовления препаратов хромосом. С развитием флуоресцентной гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) и сравнительной геномной гибридизация (comparative genomic hybridization, CGH) была получена важная информация о разнообразии нарушений хромосомного материала при раке желудка. Однако вопрос о роли аберраций хромосом при развитии данной патологии во многом пока остается дискуссионным. Целью данной обзорной статьи является обобщение и анализ структуры хромосомных аберраций при развитии рака желудка. Целью нашей работы являлось молекулярно-цитогенетическое профилирование эпителиальных тканей желудка при хроническом гастрите. Задачи исследования:
1. Аннотированная справка по научным результатам НИР, полученным на I этапе В ходе проделанной работы за 2009 год были получены следующие результаты:
2. Аналитический отчет о проведении теоретических и экспериментальных исследований 2.1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ПО ПРОБЛЕМЕ АНОМАЛИЙ ХРОМОСОМНОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ПРЕДРАКОВЫХ СОСТОЯНИЯХ И РАКЕ ЖЕЛУДКА 2.1.1 ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА С ПОМОЩЬЮ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ В настоящее время в исследованиях опухолевых тканей широкое распространение получил метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative genomic hybridization, CGH), предложенный Анне Каллиониеми с соавторами в 1992 году [9]. Метод основан на гибридизации эквимолярных количеств тестируемой и контрольной ДНК с ДНК метафазных хромосом, полученных от здорового индивида. Основным достоинством CGH в отличие от методов стандартной цитогенетики является детальное исследование числовых и несбалансированных структурных хромосомных нарушений в рамках одного эксперимента, исключающее необходимость приготовления цитогенетических препаратов из опухолевых клеток. Применение данного метода существенно расширило представления о спектре и частоте хромосомных перестроек в опухолях различных локализаций и привело к быстрому накоплению знаний о роли хромосомных аберраций в возникновении и прогрессии рака. На сегодняшний день, по данным базы «Progenetix», в различных лабораториях мира с помощью CGH было проанализировано 1022 образца опухолевых тканей желудка. Наиболее общими нарушениями хромосомного материала в опухолевых клетках желудка являются амплификации 7q, 8q, 13q, 17q, 20q, а также делеции в 1p, 4, 5q, 9p, 14q, 17p, 18q, 19, 20q [18]. Кроме того, с помощью метода array-CGH, в котором используются искусственно сконструированные матрицы, состоящие из прикрепленных к подложке клонированных районов генома, было получено большое количество новых данных о более тонких нарушениях хромосомного материала в опухолевых клетках желудка. Развитие методов лазерной микродиссекции также позволило проводить исследования рака на отдельных опухолевых клетках с определенными морфологическими характеристиками [8]. Так, с использованием комбинации методов array-CGH и лазерной микродиссекции было выполнено исследование по поиску ассоциаций хромосомных нарушений с перитонеальным метастазированием при раке желудка. В ходе проведенного анализа 34 первичных опухолей желудка были описаны амплификации 5p14, 7q21.3, 7q31 и 7q36, а также потери хромосомного материала 22q11.2 участка, которые оказались значимо связанными с перитонеальной диссеминацией и положительной перитонеальной цитологией [15]. 2.1.2 ХРОМОСОМНЫЕ АНОМАЛИИ ПРИ ПРЕДРАКОВЫХ СОСТОЯНИЯХ ЖЕЛУДКА Современное представление о развитии рака на фоне предопухолевых патологических изменений слизистой оболочки желудка (СОЖ) отражено в многоступенчатой модели гастроканцерогенеза человека, которая предполагает существование ряда последовательных этапов длительного патологического процесса в СОЖ (начинающегося с воспалительного процесса через кишечную метаплазию и дисплазию к возникновению рака), опосредованного взаимодействием факторов внешней среды и генетическими особенностями организма. Согласно концепции пошагового развития неоплазий, опухоли желудка формируются на фоне длительно существующих патологических состояний слизистой [5], которые характеризуются нарушениями пролиферативной активности клеток, апоптоза, воспалением слизистой оболочки [23]. Подобные состояния определяются как предраковые и являются ранним событием в развитии опухолей желудка. Вероятность злокачественной трансформации клеток для разных предраковых изменений варьирует от 0,5 % для гиперпластических полипов до 10-15 % для аденом. В отношении хронических эрозивных гастритов процент подобного злокачественного перехода составляет, по разным оценкам, от 3 до 50 % [1,2]. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую. Однако в желудке выявляются также различные морфологические заболевания потенциально онкогенной природы, такие как хронический атрофический гиперпластический гастрит, аденоматозные полипы, пернициозная анемия, состояния после резекции желудка, болезнь Менетрие. Поэтому ввиду своей высокой распространенности и достаточно высокого злокачественного потенциала хронические гастриты вызывают особый интерес и нуждаются в ранней диагностике, в том числе, возможно, и с применением методов цитогенетического анализа. Исследования хромосомных нарушений в предраковых заболеваниях желудка представляют большой научно-практический интерес в связи с необходимостью поиска новых генетических маркеров для ранней диагностики заболевания, а также для более глубокого понимания генетических механизмов инициации процессов канцерогенеза и, впоследствии, адекватного выбора терапии для конкретного пациента. Работ, посвященных данной проблеме, на сегодняшний день не очень много, что объясняется диагностикой рака желудка уже на поздних стадиях развития, в связи с отсутствием ранних клинических проявлений у пациентов. Исследования предраковых заболеваний в основном лежат в области изучения тканей с диспластическими изменениями эпителия, которые являются одними из главных факторов риска малигнизации тканей желудка в данной области. В ходе сравнительного анализа хромосомных нарушений в образцах тканей аденомы, являющейся предраковым заболеванием и карциномы желудка, было показано, что общий уровень хромосомных аберраций в клетках аденомы был ниже, чем уровень нарушений в клетках аденокарциномы желудка [10]. Кроме того, спектр аномалий был также различен. Наиболее общим нарушением хромосомного материала в клетках аденоматозной ткани была потеря хромосомного материала в 16p и 17p участках. Тогда как основными аномалиями в клетках аденокарциномы являлись амплификации 8q, 13q, 20p и потери хромосомного материала в 12q, 14q, 15q, 16p и 17р [10]. В другом исследовании аденомы пилорической железы была обнаружена амплификация короткого и длинного плеч хромосомы 17 и 20q и потеря хромосомного материала в 4q, 5q и 6q. В то время как основными аномалиями в клетках высокодифференцированной аденокарциномы были амплификации 1p36-pter, 9q34-qter, 17q24-qter, 20pq и 22q и потери хромосомного материала в 6q и 18q. Кроме того, с высокой частотой выявлялась амплификация участка 15q26 [12]. При исследовании данной группы патологических тканей желудка с помощью array-CGH также были выявлены не детектированные ранее нарушения хромосомного материала, что позволило более прицельно подойти к анализу возможности поиска специфических аномалий хромосом на ранних стадиях опухолевого процесса. В ходе исследования клеток тканей аденомы желудка c помощью BAC-платформ было обнаружено, что увеличение числа копий ДНК в 20q13.12-q13.33, 11q23.2, 9q33.1-q34.3 районах, трисомия по хромосоме 20, а также потеря числа копий ДНК в 6q10-q22.1, 6p21.1-q16.3, 13q21.2-21.33, 5q22.1-q23.2 и моносомия по хромосоме 10 являются основными хромосомными нарушениями в клетках тканей предраковых заболеваний желудка [3]. Также были проведены работы по сравнению хромосомных нарушений в тканях ранних и поздних стадий рака желудка. Увеличение числа копий 8q23-24.1 региона и уменьшение числа копий в 17р плече были общими в двух группах сравниваемых группах опухолей, тогда как амплификации 8p22-23, 1q25-31 были характерны для опухолей ранних стадий. Для неоплазий поздних стадий развития был типичен более широкий спектр хромосомных нарушений, в который входили увеличение числа копий в 7р, 11q, 2q и 15q26, уменьшение числа копий в 17q, 21q, 3p и 18q [17]. 2.1.3 ОТ НАРУШЕНИЙ ХРОМОСОМНОГО МАТЕРИАЛА К МУТАЦИЯМ В ГЕНАХ Опухолевые ткани желудка характеризуются различными спектрами хромосомных нарушений в связи с фенотипическими проявлениями неопластического процесса, а также в отношении клинико-морфологических параметров опухолей. В таблице 1 отображены основные нарушения хромосомного материала при раке и предраковых заболеваниях желудка, детектированные с помощью различных молекулярно-цитогенетических методов. Таблица 1. Наиболее распространенные хромосомные аберрации при предопухолевых и раковых заболеваниях желудка
Примечание: enh (enhanced) - амплификация хромосомного материала dim (diminished) - делеция хромосомного материала Наиболее часто встречающимися аномалиями хромосом в клетках предраковых заболеваний желудка являются нарушения хромосомного материала в 20q13 и 6cen-q22.1 регионах, тогда как аномалии в 7q23.3, 17q12, 20q11-q13, 8q23-q24.1 и 17p характерны для клеток опухолей рака желудка. Кроме того, в работах по исследованию клеточных линий рака желудка обнаружены наиболее общие нарушения хромосомного материала в 11q13.4-q25, 8q24.21, 20q11.2, Xq28, 18q21.2, 18q23 регионах [7, 13, 16, 22]. Детекция сходной аномалии в регионе 20q13, выявленной в клетках тканей предраковых заболеваний и непосредственно в опухолевых тканях, возможно, обусловлена тем, что нарушение хромосомного материала в данной области является первичным при развитии рака желудка и сохраняется в клетках опухолей на более поздних этапах развития. Таким образом, клон пролиферирующих клеток, несущий аномалии по данному региону, может обладать селективным преимуществом перед другими популяциями клеток и преодолеть механизмы апоптотической гибели мутантных клеток. Хромосомные нарушения и, как следствие, аномальная работа генов, участвующих в развитии рака желудка связаны с различными клиникоморфологическими параметрами опухоли и идентификация подобных генов может иметь важное значение в диагностике, прогнозе заболевания и терапии. Рассмотрим с позиций характеристики повреждаемых генов, те регионы хромосом, которые оказываются наиболее общими для двух категорий патологии желудка: предрака и рака. Как известно, в хромосомных регионах 8q24 и 17р13.1 локализованы гены c-MYC и TP53 соответственно. Амплификации и мутации данных генов обнаруживаются практически во всех типах опухолей человека и они не являются специфическими для рака желудка. Рассмотрим регион 7q21-q31, в котором локализованы гены, гиперэкспрессия которых вследствие амплификации данного участка была обнаружена при раке желудка. Например, аномальное функционирование гена, кодирующего рецептор фактора роста гепатоцитов (C-MET), расположенного в регионе 7q31, детектируется в 20 и 40% случаев для интестинального и диффузного типа опухолей, соответственно. Кроме того, экспрессия данного гена представляет собой прогностический фактор в отношении стадии опухолевого процесса, глубины инвазии и лимфогенного метастазирования [11]. В области 7q21 находится ген фактора роста гепатоцитов (HGF), уровень которого в сыворотке крови значимо коррелирует с повышением агрессивности течения заболевания [19]. Стоит обратить внимание и на то, что в данной области располагаются и другие, не менее важные гены, однако, их роль в канцерогенезе желудка до конца не выяснена. Их исследование представляется перспективным, исходя из тех функций, которые они выполняют. Так, например, рассматриваемая область содержит ген циклин-зависимой киназы 6 (CDK6), которая является важным регулятором клеточного цикла и регулирует прогрессию G1-фазы и G1/S-переход в клетке. Также она фосфорилирирует опухолесупрессорный белок Rb, тем самым регулируя его активность. Таким образом, нарушение нормальной экспрессии данного гена может приводить к серьезным нарушениям пре- и синтетической фазы клеточного цикла, индуцировать нарушения в работе одного из ключевых белков-супрессоров опухоли Rb, определяя возникновение патологических процессов, приводящих к аномальному функционированию клеток. Гиперэкспрессия гена CDK6, является прогностическим фактором при медулобластомах. Также, в регионе 7q22.1 локализуются гены MCM7, участвующий в репликации ДНК, и ген цинковых пальцев ZKSCAN1. Как было показано, данный регион часто амплифицирован при неоплазиях пищевода и верхних отделов желудка, а экспрессия рассматриваемых генов обнаружена в тканях, непосредственно прилежащих к опухолевым, показывая возможную роль данных генов в регуляции клеточного цикла [19]. Амплификации в регионе 20q13 часто обнаруживаются при опухолях желудка, однако аномалии данного региона найдены и при других локализациях, например в тканях гепатоцеллюлярной карциномы, рака яичников, а также при раке молочной железы, что показывает важность содержащихся в данном регионе генов, с одной стороны, и демонстрирует неспецифичность амплификации 20q13 при раке желудка, с другой стороны. Ген транскрипционного фактора ZNF217, локализованный в данном регионе, связан с иммортализацией клеток при развитии рака молочной железы, а другой ген CYP24 вовлечен в метаболизм витамина D и через снижение его активной формы ингибирует клеточный рост при раке прямой кишки [21]. Что касается функций гена ZNF217 при раке желудка, то обнаружена его ассоциация с интестинальным и смешанным гистотипом опухоли, тогда как при диффузном типе неоплазий экспрессия данного гена не выявлена. Ген из суперсемейства рецепторов факторов некроза опухолей TNFRSF6B, локализующийся в 20q13.3 регионе, значимо связан с метастазированием при прогрессии рака желудка, что может быть использовано при оценке характера течения заболевания у конкретного пациента. Кроме того, стоит отметить еще один ген, нормальное функционирование которого является критичным при прохождении клеткой стадии метафазы и непосредственно деления. Данный ген AURKA (aurora kinase A) находится в регионе 20q13.2-q13.3 и кодирует белок киназу регулятора клеточного цикла. Действительно, обнаружена вовлеченность продукта данного гена в формирование микротрубочек и стабилизацию веретена деления в процессе сегрегации хромосом [6]. Еще один участок, амплификация которого была обнаружена при развитии многих опухолей человека, играет не последнюю роль и при прогрессии рака желудка. Аномальная экспрессия генов региона 17q12-q21 хорошо изучена при раке молочной железы. Известно, что рассматриваемый участок содержит такие ключевые гены, как ERBB2 и TOP2A. Эти два гена являются прогностическими факторами при выборе терапии рака молочной железы. Дело в том, что данные гены играют важную роль в формировании картины лекарственной устойчивости [14]. Исходя из такой высокой значимости амплификации данного региона и прогностической значимости гиперэкспрессии локализованных в нем генов при развитии рака молочной железы и других неоплазиях, логично предположить, что для неоплазий желудка данный регион тоже может оказаться важным. Действительно, амплификация и повышенная экспрессия ERBB2 и TOP2A детектируется в 8-28% случает рака желудка, однако в отличие от рака молочной железы, эти гены экспрессируются независимо друг от друга при раке желудка и экспрессия таких молекулярных мишеней как продукт гена ERBB2 может значимо влиять на ответ на терапию TOP2A ингибиторов [20]. То есть при выборе схемы лечения рака желудка необходимо анализировать взаимное влияние экспрессии данных генов для повышения эффективности терапии. В области 17q12-q21 также расположен ген, который является, по всей видимости, специфичным для рака желудка. Ген GAS усиливает секрецию желудочного сока и стимулирует рост слизистой желудка. Продукт этого гена секретируется в антральном отделе желудка, где обычно возникают опухоли интестинального типа. Как известно развитие неоплазий желудка и, в частности интестинального типа, происходит на фоне повышенной кислотности. Таким образом, можно предположить, что одним из факторов, создающих благоприятную среду для возникновения опухолей желудка, является гиперэкспрессия этого гена, что приводит к повышению уровня секреции гастрина, который снижает pH среды желудочного сока. Что касается делеции длинного плеча 6 хромосомы, наименьшим участком перекрывания которого был регион 6cen-q22.1, то возможно этот регион выявлен неслучайно и является критичным для процессов инициации развития опухоли. Дело в том, что в 6q21 локализован ген PDSS2, который, по некоторым данным, проявляет противоопухолевую активность [4]. Повышение уровня экспрессии данного гена связано со снижением пролиферативной активности опухолевых клеток. Кроме того, с работой данного гена связана индукция апоптоза клеток с «мутантным фенотипом», вследствие остановки клеток в G0/G1 фазе, что провоцирует так называемый клеточный арест и последующий за этим апоптоз. 2.2 МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Для проведения запланированного молекулярно-цитогенетического анализа эпителия желудка при хроничеком гастрите был создан банк тканей и ДНК. За 2009-2010гг. работы было собрано 110 биоптатов тканей с предопухолевой патологией желудка. Все образцы имели гистологическую верификацию клинического диагноза. Показанием к проведению гастроскопии являются любые желудочные жалобы пациента, как например, боли после приема пищи, изжога. Во время проведения процедуры гастроскопии с помощью аппарата видеогастроскоп «GIF-Q160Z» с биопсийными щипцами, любые изменения слизистой, в частности, атрофия эпителиальной ткани, гиперплазия отдельных участков слизистой, являются показанием для взятия биоптата из патологического участка ткани. Для выделения ДНК были отобраны образцы тканей именно с предопухолевыми патологиями эпителия желудка, что согласуется с заявленной целью исследования предраковых состояний и ранних стадий рака желудка. Было выделено 30 образцов ДНК и определена концентрация для всех образцов. Однако анализ полученной группы показал, что гетерогенность предопухолевых образцов эпителия не позволит получить однозначные данные относительно портрета хромосомных нарушений для конкретных типов предрака желудка. В связи с возникшими ограничениями была создана мономорфная группа пациентов с наиболее представительной группой предрака хроническим эрозивным гастритом в количестве 10 биоптатов, для которой было проведено профилирование генома. Для всех образцов были получены морфогистологически верифицированные анамнезы течения заболеваний пациентов и создана информационная база. По итогам проведения морфогистологического анализа данным пациентам был поставлен диагноз хронический эрозивный гастрит. Первоначально пациенты обследовались в поликлинической сети города, а затем направлялись для проведения дополнительных исследований в НИИ онкологии СО РАМН. Средний возраст пациентов на момент выявления заболевания был 53,9 лет (28-76 лет). На момент проведения профилирования тканей эпителия желудка, повторных исследований по поводу развития опухолевой патологии у данных пациентов не было. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). Было получено разрешение этического комитета НИИ Онкологии СО РАМН. 2.3 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Сравнительная геномная гибридизация (CGH) представляет собой модификацию метода флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Ключевое отличие этого метода от других FISH-технологий заключается в том, что в качестве мишеней для гибридизации используется не тестируемый материал, полученный от пациента, а хромосомные препараты, приготовленные из клеточной суспензии здорового индивида с кариотипом 46,XY. В качестве зонда для проведения реакции гибридизации используется смесь эквимолярных количеств тестируемой и контрольной ДНК, которые предварительно были мечены различными флюорохромами или гаптенами. Реакция гибридизации протекает в условиях супрессии высокоповторяющимися фрагментами генома (C0t-1 ДНК). Проведение анализа сравнительной геномной гибридизации включает следующие этапы:
2.3.1 Получение суспензии метафазных хромосом Т-лимфоцитов без синхронизации клеточной культуры. Приготовление рабочих растворов осуществляется заранее: среда для культивирования Т-лимфоцитов. Стерильно смешать 450 мл среды RPMI-1640 с 50 мл эмбриональной телячьей сывороткой и 9,25 мл L-глютамина. Добавить гентамицин до конечной концентрации в растворе 50 мкг/мл. Хранить при +4оС. рабочий раствор ФГА. К 50 мг ФГА добавить 5 мл стерильной деионизованной воды. Рабочий раствор получают, смешав стерильно 1 мл исходного раствора ФГА с 9 мл физиологического раствора (0,09% NaCl). 1,25мМ Этидиум бромид 1. Собрать стерильно в вакутейнер 8-9 мл венозной крови донора мужского пола. Перемешать переворачиванием для растворения антикоагулянта (литиевая соль гепарина). 2. Оставить вакутейнер с кровью отстаиваться в вертикальном положении в штативе в течение 20-40 минут при комнатной температуре для оседания эритроцитов. Поставить в термостат (+370С) заранее приготовленную среду для культивирования Т-лимфоцитов. 3. Стерильно отобрать с помощью пипетки и груши 2-3 мл полупрозрачного лимфоцитарного слоя, стараясь, кончик пипетки держать максимально близко к эритроцитарному слою, но не захватывать его. 4. Стимулировать деление Т-лимфоцитов добавлением рабочего раствора ФГА из расчета 20 мкл раствора на 1 мл лейкоцитарной фракции крови. Хорошо перемешать взбалтыванием культурального флакона. 5. К полученному объему ФГА-стимулированной крови прибавить 6 объемов заранее приготовленной и разогретой до +370С среды для культивирования Т-лимфоцитов. (Например, к 1 мл фракции крови прибавить 6 мл среды, к 2 мл крови – 12 мл среды и так далее.) Тщательно перемешать взбалтыванием. 6. Поместить инициированную клеточную культуру в термостат с температурой +370С на 70 часов. Культуральные флаконы располагать вертикально, крышками вверх. (Желательно, во время культивирования производить периодические взбалтывания культуры. 2-3 раза в день.) 7. Перед обработкой Демиколцином приготовить свежий гипотонический раствор 0,75 М KCl: 0,56 г KCl довести деионизованной водой до объема 100 мл. Поместить в термостат при +370С до п.12. 8. По прошествии 70 часов с момента инициации клеточной культуры, добавить 1,25мМ раствор Этидиум бромида из расчета 10 мкл раствора Этидиум бромида на 1 мл культуры (конечная концентрация Этидиум бромида в культуре 1,25x10-5М). Интеркаляция этого реагента в ДНК позволяет позволяет замедлить спирализацию метафазных хромосом и получить более качественные препараты. Культуральный флакон убрать в термостат (+370С) на 50 минут. 9. По истечении 50 минут, добавить в культуру Демиколцин из расчета 60 мкл на 10 мл культуры. Культуральный флакон убрать в термостат (+370С) на 20 минут. 10. Перенести содержимое культурального флакона в чистые центрифужные конические пробирки. Центрифугировать 8 минут при 1000 об./мин. 11. Водоструйным насосом отобрать надосадочную жидкость. Осадок форменных элементов крови должен остаться в ~ 1 мл жидкости. 12. Добавить частями, чередуя с перемешиванием переворачиванием, свежеприготовленный и разогретый до +370С гипотонический раствор. 0,75М KCl добавляется в 10 x избытке, то есть на 1 мл осадка в жидкости – 10 мл гипотонического раствора. Поместить полученную клеточную суспензию в термостат на 20 минут. 13. Провести префиксацию путем добавления в пробирку с гипотоническим раствором 3-5 капель (75-125мкл) метанол-уксусного фиксатора. Центрифугировать 8 минут при 1000 об./мин. 14. Водоструйным насосом отобрать надосадочную жидкость. Осадок должен остаться в ~ 1 мл жидкости. Произвести фиксацию клеточной суспензии путем добавления метанол-уксусного фиксатора. Сначала добавить фиксатор до половины объема пробирки. Тщательно ресуспендировать осадок. Добавить фиксатор до полного объема пробирки. Перемешать переворачиванием. Поместить в морозильную камеру при -200С на 30 минут. 15. Центрифугировать 8 минут при 1000 об./мин. Повторить пункты 14 и 15 до получения прозрачного раствора надосадочной жидкости (1-2 раза). 16. Ресуспендировать осадок в 1-1,5 мл метанол-уксусного фиксатора. Перенести в 1,5 мл пробирку типа eppendorf. Хранить в морозильной камере при -200С. 2.3.2 Подготовка предметных стекол.
2.3.3 Выделение ДНК из анализируемой ткани
2.3.4 Приготовление зонда, путем введения метки в тестируемую и контрольную ДНК Мечение тестовой и контрольной ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови здорового индивида мужского пола, осуществлялось в ходе реакции ник-трансляции с помощью дизоксирибонуклеотидов, меченых соответственно флуорохромами fluorescein (зеленый) и tamra (красный). Приготовление реакционной смеси включало в себя следующую последовательность действий:
2.3.5 Проведение реакции супрессионной in situ гибридизации зонда на хромосомном препарате
2.3.6 Получение цифровых изображений метафазных препаратов хромосом в трех диапозонах спектра флюоресценции Построение профилей отношения интенсивности флюоресценции различных флюорохромов вдоль каждой хромосомы Детекцию гибридизационых сигналов проводили с использованием люминесцентного микроскопа «Axioskop 50» («Carl Zeiss», Германия) с CCD камерой с набором специфичных светофильтров. Анализ гибридизационных профилей осуществлялся с помощью программы «CGHView 3.0» («Applied spectral imaging», USA). Для повышения разрешающей возможности метода использовали опцию CGH высокого разрешения (High Resolution CGH, HR-CGH). Принцип HR-CGH заключается в использовании доверительного интервала, предварительного построенного на основе сравнительной гибридизации нескольких контрольных образцов ДНК с метафазами, полученными от здорового индивида. При проведении исследования нахождение гибридизационного профиля в пределах доверительного интервала рассматривается как норма, тогда как выход за границы интервала принимается в качестве аномалии – амплификации или делеции. Разрешающая способность такого подхода составляет около 6 млн. п.о. В анализ гибридизационного профиля для каждого пациента включалось 10 метафазных пластинок. Во избежание ложноположительных результатов прицентромерные регионы хромосом 1, 9, 15, 16, содержащих крупные гетерохроматиновые блоки, были исключены из анализа. Кроме того, в анализе не учитывались теломерные районы всех хромосом набора, в которых поведение гибридизационного профиля является чрезвычайно вариабельным. 2.4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В ходе проведенной работы были выявлены нарушения хромосомного материала в восьми из десяти образцов предракового заболевания желудка. В таблице 2 отображены все хромосомные нарушения в исследованных образцах эпителия желудка при хроническом эрозивном гастрите. Таблица 2. Хромосомные нарушения в клетках эпителиальной ткани при хроническом эрозивном гастрите
Наиболее общими аномалиями были амплификации хромосомного материала в участках 3p12-23 (30%) с минимальными перекрывающимися регионами 3p14 и 3p22, а также 3q13.1-27 (30%) с общими регионами 3q25-26.2 и 3q26.1. Далее следовали амплификации в участках 2p12-23 (20%) с минимальным регионом 2p16, 2q14.1-32 (20%) с минимальным общим регионом 2q31, 4q24-25 (20%), для которой был характерен наименьший перекрывающийся регион 4q25, а также увеличение материала в участках 6q21 (20%) и 6q22-24 (20%). Наряду с сегментными анеуплоидиями, в одном из обследованных случаев (№ 7) была выявлена трисомия по хромосоме 19. Кроме того, в двух случаях в тканях предопухолевого заболевания не было обнаружено нарушений хромосомного материала. На рисунке 1 показаны хромосомные нарушения проанализированные с помощью программы для детекции и анализа CGH профилей отдельных хромосом набора в исследованной когорте пациентов. Рисунок 1. Модель геномного дисбаланса в эпителиальной ткани желудка при хроническом эрозивном гастрите П  римечания: вертикальные линии на правой стороне хромосомных идеограмм показывают наличие амплификаций, линии на левой стороне - делеций хромосомного материала Полученные данные о нарушениях хромосомного материала с помощью сравнительной геномной гибридизации при данной патологии слизистой желудка являются первыми, поскольку подобных исследований ранее не проводилось. Отсутствие данных о цитогенетических аномалиях при хроническом эрозивном гастрите, на сегодняшний день делает невозможным сравнение выявленных нами аберраций с аномалиями при этой патологии. Однако в мировой практике существуют работы по идентификации цитогенетических нарушений при других типах предопухолевых заболеваний желудка. Одной из ранее исследованных патологий на предмет хромосомных аберраций является аденома желудка. Общим нарушением хромосомного материала в клетках аденоматозной ткани является потеря хромосомного материала в 16p и 17p, 6q10-q22.1, 6p21.1-q16.3, 13q21.2-21.33, 5q22.1-q23.2 участках, а также амплификация в 20q13.12-q13.33, 11q23.2, 9q33.1-q34.3 районах, кроме того по некоторым данным трисомия по хромосоме 20 и моносомия по хромосоме 10 являются основными хромосомными нарушениями в клетках аденомы желудка [10,3]. В исследовании аденомы пилорической железы была обнаружена амплификация короткого и длинного плеч хромосомы 17 и 20q и потеря хромосомного материала в 4q, 5q и 6q. Кроме того, с высокой частотой выявлялась амплификация участка 15q26 [14]. Из вышеизложенной информации следует, что клетки тканей различных предопухолевых состояний желудка значительно отличаются между собой по структуре нарушений хромосомного материала. Данный факт может свидетельствовать о различных патогенетических путях развития малигнизационных процессов в слизистой желудка, что может теоретически определять дифференциальные программы озлакачаствления клеток, формирование устойчивых клеточных клонов с определенным набором хромосомных аберраций, которые могут способствовать преодолению клетками эндогенных регуляторных механизмов и приводить к образованию опухоли с определенным фенотипом. Следует отметить, что в ранее опубликованных статьях, выявлены аномалии хромосом, характерные как для опухоли, так и предраковых заболеваний. Действительно, в клетках тканей аденомы и аденокарциномы желудка интестинального типа обнаружены идентичные нарушения в хромосомных регионах 17p и 20q13. Однако подобные аберрации были детектированы только в тканях, взятых от одного и того же пациента, тогда как в тканях от различных индивидов данной картины не обнаружено [10]. Кроме того, необходимо добавить, что опухолевые ткани отличаются также более высоким уровнем хромосомных нарушений в отличие от предопухолевых заболеваний. Наличие одинаковых типов хромосомных аберраций в клетках предопухолевых заболеваний и непосредственно самой неоплазии, а также различный уровень аномалий хромосом, может быть объяснено с позиции аккумуляции хромосомных аберраций в ходе развертывания программы малигнизации клеток и пошагового развития неоплазии. В ходе нашего исследования на момент проведения молекулярно-цитогенетического анализа тканей эпителия желудка при хроническом эрозивном гастрите, данных, о переходе предопухолевого заболевания в рак не было установлено, что может объясняться длительностью развития неопластического процесса. Следовательно, на сегодняшний день, мы не обладаем информацией об уровне и структуре хромосомных нарушениях в опухолевой ткани у данных пациентов. Однако следует отметить тот факт, что уровень и структура нарушений хромосомного материала, не смотря на наличие определенных общих аномалий хромосом, значительно варьирует внутри исследуемой группы. Так, отсутствие каких-либо нарушений в двух случаях предрака желудка (в таблице № 1, 3) может свидетельствовать о запуске программы регрессии заболевания, через апоптоз мутантных клеток и восстановлении нормальной слизистой ткани желудка. И напротив, значительный уровень хромосомной изменчивости, в частности амплификаций, у трех пациентов (в таблице № 5, 7, 8), показывает предположительно более высокий риск малигнизации клеток слизистой по сравнению с остальной группой. Кроме того, именно среди этих пациентов обнаружено наибольшее сходство аномалий, что наводит на мысль о возможно сходных механизмах инициации малигнизационного процесса. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что цитогенетические нарушения хромосомного материала являются ранним событием при развитии патологических процессов в клетках эпителия желудка. Отсутствие явного единообразия хромосомных аберраций во всех случаях говорит о наличии потенциально индивидуального реагирования организма на развитие патологических процессов. Однако в случае не достаточно результативной работы системы апоптотической гибели клеток с аномалиями хромосомного материала, происходит накопление клеточных клонов с «мутантным» фенотипом, для которых характерны определенные сходства в уровне и структуре аномалий хромосом. В свою очередь, факт высокого уровня цитогенетических нарушений в эпителиальных клетках желудка, может потенциально являться фактором, способствующим запуску программы малигнизации клеток. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 2
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Исполнитель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт онкологии Сибирского отделения рамн... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (Ленина)» | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Исполнитель: Учреждение Российской академии наук Институт физики микроструктур ран |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Государственный университет учебно-научно-производственный... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Государственный университет учебно-научно-производственный... |
| 1. Банковский сектор2 Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физики микроструктур Российской академии наук | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физики микроструктур Российской академии наук |
 | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... |
