Скачать 199.43 Kb.
|
Министерство образования и науки Российской Федерации Сибирский федеральный университет Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов Методические указания к семинарским занятиям Красноярск СФУ 2011 УДК ББК Г Рецензенты: Составитель И.Л. Милютина Г Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов: Методические указания к семинарским занятиям [Текст] / сост. И.Л. Милютина. – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2011. – 15 с. ISBN Методические указания составлены в соответствии с учебным планом и программой по дисциплине «Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов». Пособие содержит тематический план лекций и семинарских занятий. В пособие даны рекомендации для подготовки к семинарам, график занятий и список литературы по темам семинарских занятий. Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Микробиология и биотехнология». И. Л. Милютина ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», 2011 СОДЕРЖАНИЕ ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ 4 1. СОДЕРЖАНИЕ И МЕТОДИКА ПОДГОТОВКИ К СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ 5 2. ГРАФИК ВЫПОЛНЕНИЯ СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ В ТЕЧЕНИЕ СЕМЕСТРА 9 3. ПРИМЕРЫ ЗАДАЧ ДЛЯ ПРОМЕЖУТОЧНОГО КОНТРОЛЯ 10 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 11 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯСеминарские занятия направлены на расширение и детализацию теоретических знаний, на выработку и закрепление навыков профессиональной деятельности, являются средством развития культуры научного мышления. Они позволяют расширять теоретического знания, углубленно изучать разделы микробиологии и биотехнологии, связанные с актуальными направлениями молекулярно-генетических исследований. Главная цель семинарских занятий – обеспечить студентам возможность овладеть навыками и умениями использования применительно к особенностям изучаемой отрасли. Целью дисциплины «Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов» является: ознакомление студентов с объектами, методами и возможностями генной инженерии; получение современных представлений о конструировании организмов (в том числе и промышленно важных), производящих целевые продукты для фармакологии и хозяйственной деятельности человека В задачи дисциплины входит изучение общих принципов конструирования рекомбинантных организмов; получение современных представлений о способах выявления, переноса и экспрессии целевого гена, а также получения и выделения целевого продукта; изучение возможностей использования трансгенных организмов – от бактерий до растений и животных; знакомство с правовыми аспектами и проблемами биобезопасности при использовании генномодифицированных организмов. Дисциплина «Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов» входит в цикл дисциплин ООП подготовки магистров по программе «Микробиология и биотехнология» вариативная часть, дисциплина по выбору студента. Для успешного освоения курса необходима подготовка до уровня бакалавра и желательно прохождение таких биологических дисциплин как биохимия, микробиология, генетика, биотехнология. Преподавание курса «Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов» осуществляется путем чтения курса лекций и проведения семинарских занятий с контролем приобретенных знаний и умений. На семинарских занятиях более подробно обсуждаются ключевые и трудно усваиваемые моменты, проводится устный опрос студентов. К занятиям студентам необходимо ознакомиться с материалами по теме предстоящего занятия из рекомендованной литературы и Интернет-ресурсов. Подготовленные студентами в ходе самостоятельного изучения предмета рефераты также представляются на семинарских занятиях, проводится их интерактивное обсуждение с участием преподавателя и студентов в форме дискуссий, мини-конференций, диспутов. Активному формированию основных компетенций обучающихся по данной дисциплине должно способствовать проведение практических занятий в сочетании с самостоятельной работой в форме деловой игры с элементами метода развивающей кооперации. Данные технологии обучения направлены на развитие навыков командной работы, межличностной коммуникации, принятия решений, лидерских качеств. Таблица 1 - Разделы дисциплины и виды занятий в часах
1. СОДЕРЖАНИЕ И МЕТОДИКА ПОДГОТОВКИ К СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМСодержание разделов и тем лекционного курса Раздел 1. Принципы конструирования рекомбинантных организмов Лекция 1.1. (1 ч) – История генетической инженерии. Виды генетической инженерии – клеточная, хромосомная и генная инженерия. Проблемы, решение которых возможно с применением генетической инженерии. Технологии рекомбинантных ДНК и общие принципы конструирования промышленно важных продуцентов для биотехнологии. Молекулярные основы генной инженерии. Источники генов для целевых продуктов. Лекция 1.2. (1 ч) - Основные типы клонирующих векторов. Общая схема вектора на примере бактериальной экспрессионной плазмиды. Использование регуляторных элементов репликации и биосинтеза для конструирования векторов: сайты инициации репликации, маркерные гены - гены для селекции векторов и репортерные гены, регулируемые промоторы и другие регуляторные элементы экспрессии целевого гена. Использование внехромосомных элементов, подвижных генетических элементов и вирусов для конструирования векторов. Временная (транзиентная) экспрессия и интеграция в хромосому. Идентификация и изоляция рекомбинантных организмов. Раздел 2. Экспрессия и выделение целевых белков Лекция 2.1. (1 ч) - Проблемы экспрессии чужеродных генов в целевом организме. Причины использования разнообразных систем (простейшие, растения и животные) для биопродукции белков. Гетерологичная экспрессия, пострансляционные модификации и получение функционально активных аутентичных белков. Гликозилирование рекомбинантных белков в зависимости от клетки-хозяина. Стабилизация целевых продуктов в клетке. Лекция 2.2. (1 ч) - Конструирование секретирующих организмов. Активное использование регуляторных особенностей биосинтеза белка для оптимизации конструкции генно-инженерных организмов. Раздел 3. Генетически важные продуценты Лекция 3.1. (1 ч) - Генно-инженерные организмы в хозяйственной деятельности человека и перспективы их дальнейшего использования. Особенности использования генно-модифицированных микроорганизмов, животных и растений. Лекция 3.2. (1 ч) - Дрожжевые системы экспрессии. Клетки насекомых и бакуловирусы для синтеза целевых белков. Раздел 4. Трансгенные растения и животные Лекция 4.1. (1 ч) Трансгенные растения и животные как биореакторы для получения ценных для промышленности и медицины органических соединений. Конструирование трансгенных растений. Векторные системы для растений на основе Ti-плазмид и фитовирусов. Культуры растительных клеток. Биопродукция ценных для промышленности и медицины органических соединений в растениях и растительных клетках. Преимущества и проблемы биопродукции в растительной системе. Метаболическая инженерия растений. Создание растений, устойчивых к болезням, вредителям (растения, синтезирующие инсектициды), гербицидам (на примере раундапа). Изменение пищевой ценности и внешнего вида растений. Повышение продуктивности и устойчивости к внешней среде. Лекция 4.2. (1 ч) - Технологии создания трансгенных животных. Сложность и длительность создания трансгенных животных. Использование искусственных хромосом для переноса генов. Использование модифицированных эмбриональных стволовых клеток. Клонирование переносом ядра. Трансгенные животные как «биореакторы» биологически активных веществ. Содержание разделов и тем семинарских занятий Раздел 1. Принципы конструирования рекомбинантных организмов Cеминар 1.1 (2 ч) - Работа с нуклеиновыми кислотами. Требования к лаборатории. Выделение ДНК и РНК. Обработка и количественное определение нуклеиновых кислот. Мечение нуклеиновых кислот (типы меток - радиоактивные и флуоресцентные, мечение концов, трансляция ника). Гибридизация нуклеиновых кислот. Гель-электрофорез. Секвенирование ДНК. Принципы секвенирования ДНК. Подготовка фрагментов ДНК – метод контига и метод дробовика. Секвенирование Maксама-Гилберта (химическое). Секвенирование Сэнгера-Коулсона (дидезокси- или ферментативное). Электрофорез и чтение сиквенсов. Автоматизация секвенирования ДНК. Семинар 1.2. (2 ч) – Ферменты молекулярного клонирования. Биология и активность эндонуклеаз рестрикции. Системы рестрикции-модификации. Последовательности узнавания для ферментов рестрикции. Участки ДНК, разрезанные ферментами рестрикции. Разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции. Рестрикционное картирование. Создание карты путем расщепления ДНК с помощью нескольких рестриктаз. Создание карты по частичному расщеплению маркированной на конце ДНК. Использование компьютера для создания карт рестрикции. ДНК лигирование. Факторы, влияющие на активность ферментов рестрикции. ДНК полимеразы. Термостабильная ДНК-полимераза. Терминальная трансфераза. Обратные транскриптазы. Бактериофаг РНК полимераза. Нуклеазы: ДНКаза и РНКаза. ДНК-лигаза. Полинуклеотидкиназа. Раздел 2. Экспрессия и выделение целевых белков Семинар 2.1. (2 ч) – контрольный опрос, решение задач. 1. Что такое эндонуклеазы рестрикции типа II и почему они так важны для технологии рекомбинантных ДНК? 2. Опишите применение плазмиды pBR322 в качестве вектора. Какими особенностями она обладает? 3. Зачем рестрицированную плазмидную ДНК перед лигированием часто обрабатывают щелочной фосфатазой? 4. Что такое линкер и адаптер? Где их используют? 5. Что такое дидезоксинуклеотиды? Как с их помощью определяют нуклеотидную последовательность ДНК? 6. Какая реакция катализируется ферментом обратной транскриптазой? Как этот фермент используется в рекомбинантных ДНК-технологиях? 7. Что такое ДНК-микрочипы, и как они используются в функциональной геномике? Семинар 2.2. (2 ч) – Продуценты целевых продуктов Использование естественных систем биосинтеза и хранения запасных веществ организма-хозяина для конструирования продуцентов целевых продуктов. Выделение генетически-модифицированных организмов и проблема удаления маркерных генов. Метаболическая перегрузка. Тельца включения. Раздел 3. Генетически важные продуценты Семинар 3.1. (2 ч) – контрольный опрос, решение задач. 1. Почему плазмидный вектор с максимально сильным промотором не всегда является наилучшим экспрессирующим вектором? 2. Иногда стратегия синтеза белка-мишени включает получение этого белка в составе гибридного продукта. В чем преимущество такого подхода? Как создают гибридный белок? 3. Что такое тельца включения и как избежать их образования? 4. В чем преимущество локализации чужеродных белков на поверхности клеток? Какие стратегии используются для того, чтобы сделать белки секретируемыми? 5. Предложите несколько способов снижения метаболической перегрузки E. coli, синтезирующих в большом количестве рекомбинантный белок. 6. Почему для получения белков, использующихся в медицине, лучше применять эукариотические, а не прокариотические системы? 7. Что такое аффинная метка? Для чего ее используют? 8. Какие функции важны для бактериального вектора клонирования? Зачем вектор имеет более одного сайта клонирования? 9. Опишите двухгибридную систему, которая использует дрожжевой GAL4 белок, и объясните, как двухгибридная система обнаруживает взаимодействие между белками. Семинар 3.2. (2 ч) – Использование трансгенных организмов Использование рекомбинантных микроорганизмов различных систематических групп для получения коммерческих продуктов (ферменты, инсулин, гормон роста, интерфероны, моноклональные антитела и т.д.). Использование трансгенных микроорганизмов в медицине, биомассы ГМ-микроорганизмов и производимых ими ферментов и добавок в пищевой и кормовой промышленности, в качестве продуктов питания. Биоремедиация. Применение трансгенных животных: научные модели, модели для изучения болезней человека, источники для производства фармацевтических препаратов, ксенотрансплантантов и пищи. Использование трансгенных растений в фундаментальных исследованиях, создании принципиально новых сортов сельскохозяйственных культур, производство биологически активных веществ для медицины, ветеринарии и субстратов для промышленности Раздел 4. Трансгенные растения и животные Семинар 4.1. (2 ч) – Презентация и обсуждение рефератов, контрольный опрос, решение задач. 1. Что такое трансгенные организмы? Каково практическое применение трансгенных организмов? 2. Объясните роль рекомбинации в нацеливании гена в эмбриональных стволовых клеток. Как нацеливание гена может быть использовано для создания "нокаутных" мутаций? 3. Эксперимент по функциональной геномике проводится с использованием ДНК-микрочипов для анализа уровня экспрессии генов в бактерии. Какие гены вы ожидаете обнаружить избыточно экспрессируемыми в клетках, выращенных на минимальной среде по сравнению с клетками, выращенными на полной среде? 4. Вы хотите ввести человеческий ген инсулина в бактериальную клетку-хозяина в надежде на производство большого количества человеческого инсулина. Что вы используете - геномную ДНК или кДНК? Объясните ваши рассуждения. 5. В чем состоит экономическое преимущество использования генномодифицированных растений и животных в качестве «биореакторов»? Семинар 4.2. (2 ч) - Презентация и обсуждение рефератов 2. ГРАФИК ВЫПОЛНЕНИЯ СЕМИНАРСКИХ ЗАНЯТИЙ В ТЕЧЕНИЕ СЕМЕСТРАВ соответствии с учебным планом дисциплина «Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов» преподается на 2-м курсе магистратуры. Курс обучения длится один семестр. Аудиторные занятия включают 2-х часовые лекции и 2-х часовые практические занятия, проводимые один раз в 2 недели. В целях оптимизации учебного процесса возможна модульная организация дисциплины: еженедельное проведение лабораторных занятий и чтение 2-х часовых лекций один раз в 2 недели. В этом случае срок освоения дисциплины (аудиторные занятия) составит 8 недель. В течение семестра проводится промежуточный контроль в форме письменных контрольных работ по модулям дисциплины с решением задач. Такой контроль позволяет определить степень усвоения студентом учебного материала и предусматривает: самостоятельную работу с учебной литературой, раскрытие содержания вопросов предложенных вариантов заданий. Сроки проведения занятий и коллоквиумов обозначены в графике учебного процесса рабочей программы дисциплины и в табл. 2. Таблица 2 – График проведения семинарских занятий и промежуточного контроля
3. ПРИМЕРЫ ЗАДАЧ ДЛЯ ПРОМЕЖУТОЧНОГО КОНТРОЛЯ1. При обработке кольцевой двухцепочечной плазмиды pCELl различными рестриктазами и их комбинациями получаются следующие фрагменты (размеры указаны в парах нуклеотидов): EcoRI - 6,0; ВатIII - 6,0; HindIII -6,0; НаеII - 3,0; 2,0 и 1,0; EcoRI и НаеII - 2,0 и 1,0; EcoRI и HindIII - 3,5 и 2,5; EcoRI и ВатHI - 4,5 и 1,5; ВатHI и HindIII - 5,0 и 1,0; ВатШ и Haell - 3,0; 1,5 и 0,5; HindIII и НаеII — 3,0; 1,5; 1,0 и 0,5. Используя эти данные, постройте рестрикционную карту pCELl. 2. Предположим, что ваш новый ДНК-синтезатор имеет среднюю эффективность присоединения нуклеотидов 98,5%. Каким будет выход продукта, если вы синтезируете гибридизационный зонд длиной 50 нуклеотидов? 3. Какие две стратегии химического синтеза гена длиной 0,5 т. п. н. вы можете предложить? Какую из них вы предпочтете? 4. Построить карту расположения участков узнавания эндонуклеаз рестрикции на линейной ДНК, если известно, что при действии на эту ДНК ферментом EcoR1 получаются три фрагменты длиной 850, 500 и 300 пар нуклеотидов, а BamH1 разрезает эту ДНК на фрагменты 950 п. н., 600 п. н. и 100 п. н. При совместном расщеплении данной ДНК указанными рестриктазами получается следующий набор фрагментов: 600 п. н., 400 п. н., 300 п. н., 250 п. н. и 100 п. н. 5. Построить физическую карту кольцевой ДНК по сайтам рестрикции гипотетических рестриктаз R1 и R2. Фрагменты ДНК при действии R1 9.0 т. п. н. и 3.0 т. п. н.; R2 6.5, 4.5 и 1.5 т. п. н.; R1+R2 5.5., 2.5., 2.0 и 1.0 т. п. н. 6. Сколько молекул бета-галактозидазы присутствует в одной клетке кишечной палочки, если бактерии растут на лактозе? Кишечная палочка имеет цилиндроподобную форму длиной 2 мкм и диаметром 1 мкм; молекулярный вес бета-галактозидазы — 450 000. Плотность бактериальной клетки — около 1,2 г/мл. На долю растворимых белков, к которым относится и бета-галактозидаза, приходится 14% всей массы, из которых бета-галактозидаза составляет 1%. 7. Содержание лизина в рибонуклеазе составляет 10,5% по весу (мол. вес лизина — 147). Рассчитайте минимальную молекулярную массу рибонуклеазы и реальную, если известно, что она содержит 10 остатков лизина. 8. Используйте концевую трансферазу для создания гибридных кольцевых и линейных молекул ДНК, принадлежащих разным геномам. Какие еще ферменты вам понадобятся для этого? 9. Создайте конструкцию, несущую прокариотический ген устойчивости к неомицину, подходящую для переноса генов в эукариотические клетки. Опишите план клонирования с помощью такого вектора. 10. Будут ли последовательности 5’-AATT-3’ и 3’-AATT-5’ в двухцепочечной молекуле ДНК разрезаться на том же самом сайте рестрикции? БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОКа) основная литература:
http://link.springer.com/book/10.1007/978-88-470-1643-9/page/1
http://link.springer.com/book/10.1007/978-3-642-03287-5/page/1 б) дополнительная литература:
в) программное обеспечение и Интернет-ресурсы:
Учебное издание Милютина Инна Леонидовна Генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов. Методические указания к семинарским занятиям Редактор И.О. Фамилия Корректор И.О.Фамилия Компьютерная верстка: И.О.Фамилия Подписано в печать (дата) 2011 г. Формат 60х84/16. (А5) Бумага офсетная. Печать плоская. Усл. печ. л. (количество страниц/16). Уч.-изд. л. Тираж 100 экз. Заказ Редакционно-издательский отдел Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 79 Тел/факс (391) 244-82-31. E-mail rio@sfu-kras.ru http://rio.sfu-kras.ru Отпечатано Полиграфическим центром Библиотечно-издательского комплекса Сибирского федерального университета 660041, г. Красноярск, пр. Свободный, 82а |
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Микробиология и... | Российской Федерации Сибирский федеральный университет Г генная инженерия промышленно-важных продуцентов и целевых продуктов: Организационно-методические указания [Текст] / сост. И. Л.... | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... ... | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология» | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология» | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 020400. 68 «Биология» | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 020400. 68 «Биология» | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 020400. 68 «Биология» | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Микробиология и... | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Микробиология и... | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Биофизика» | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... ... | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению «Биология», магистерская программа «Микробиология и... | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... ... | ||
Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... Методические указания предназначены для студентов, обучающихся по направлению 020400. 68 «Биология», магистерская программа «Микробиология... | Методические указания составлены в соответствии с учебным планом... ... |