На правах рукописи
Сергеева Анна Михайловна
Особенности механизмов регуляции инотропии сердца крыс в постнатальном онтогенезе
03.03.01-физиология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Казань – 2010
Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет»
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Зефиров Тимур Львович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Волков Евгений Михайлович
доктор медицинских наук, профессор
Димитриев Дмитрий Алексеевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», биологический факультет (г. Москва)
Защита состоится «___»________________2010 г. в _______часов на заседании Диссертационного совета Д 212.078.02. при ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу:
420021, г. Казань, ул. Татарстан, 2.
Автореферат разослан «____»_______________2010 г.
Ученый секретарь
 диссертационного совета
д.м.н., профессор Зефиров Т.Л.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Механизмы регуляции деятельности сердца на протяжении нескольких последних столетий привлекают внимание отечественных и зарубежных исследователей (Павлов И.П., 1883; Курмаев О.Д., 1966; Удельнов М.Г., 1975; Ситдиков Ф.Г., 1998; Weber., 1846; Mangoni M.E., Nargeot J., 2008; van Borren M.M. et al., 2010; Stavrakis S. et al., 2010). В основе нервной регуляции деятельности сердца лежит взаимодействие между симпатическим и парасимпатическим отделами вегетативной нервной системы, которые реализуют свои влияния через адренорецепторы и холинорецепторы клеток сердца (Абзалов Р.А., 1987; Ноздрачев А.Д., 1995; Зефиров Т.Л., 2005; Robinson R.B. et al., 2003; Choate J.K., Feldman., 2003; Barbuti et al., 2009). В настоящее время доказанной является гетерогенность популяции адренорецепторов и мускариновых холинорецепторов. В организме млекопитающих и амфибий идентифицированы пять подтипов мускариновых холинорецепторов (Brodde O.E, Michel M.C., 1999). Детально изучены молекулярные и фармакологические свойства этих рецепторов, описана их хромосомная локализация у человека.
В течение многих лет многие исследователи изучали механизмы определяющие возрастные изменения работы сердца на разных этапах пренатального и постнатального онтогенеза (Адольф Э.Ф., 1971; Аршавский И.А., 1982; Зефиров Т.Л., 2003; Нигматуллина Р.Р., 2004; Cribs L.L. et al., 2001; Protas L. et al., 2001; Nouchi H. et al., 2007). На протяжении многих лет большинство исследователей считали, что в основе возрастной брадикардии лежит усиление парасимпатических и ослабление симпатический влияний на сердце (Аршавский И.А., 1982). Однако, другие исследователи доказали, что симпатическая иннервация в сердце млекопитающих развивается существенно позже, чем парасимпатическая (Швалев В.Н., 1992; Robincon R.B., 1996). В настоящее время большинство исследователей считает, что в основе особенностей возрастных механизмов регуляции сердечной деятельности лежат изменения состава, локализации и активности рецепторов клеток сердца, особенностей работы ионных каналов и систем вторичных посредников в интракардиальных нейронах, атипичных и рабочих кардиомиоцитах (Christoffels V.M. et al. 2010). Особый интерес к изучению данной научной проблемы основан на различных, а иногда, и противоречивых экспериментальных результатах, полученных разными авторами в опытах по изучению симпатических и парасимпатических регуляторных влияний на сердце. Так, достаточно давно известно, что стимуляция блуждающего нерва способна вызывать как брадикардию, так и тахикардию (Соколова Н.А., Удельнов М.Г., 1977). Некоторые исследователи считают, что хронотропный эффект блуждающего нерва можно разделить на два компонента: тормозной тонический и синхронизирующий (Покровский В.М., 2007). Известно, что перерезка блуждающих нервов, а так же блокада парасимпатических воздействий атропина способна оказывать различные эффекты действия на сердце.
Тем не менее, в настоящее время большинство исследователей сходятся на мнении, что в основе вегетативной регуляции сердечной деятельности лежат симпато-парасимпатические взаимодействия (Mori T. et al., 2004; Weiergraber M. et al., 2005; Bucchi A. et al., 2007; Stavrakis S. et al., 2010). Разные авторы различают несколько видов этих взаимодействий – антагонизм, взаимокомпенсация, акцентированный антагонизм (Аухадеев Э.И., Курмаев О.Д., 1971; Levy M.N., 1984). Что касается регуляции хронотропии сердца следует отметить, что центральным элементом системы является постганглионарный парасимпатический нейрон, локализованный в сердце и образующий тормозной синапс с мускариновыми холинорецепторами атипичных кардиомиоцитов. Эти нейроны интегрируют экстра - и интракардиальные регуляторные влияния, ингибируя спонтанную активность пейсмейкеров.
В многочисленных работах показано наличие существенных видовых особенностей механизмов регуляции работы сердца. Так, у человека на протяжении всего раннего постнатального онтогенеза наблюдается возрастная брадикардия. У крыс, наиболее распространенных в настоящее время лабораторных млекопитающих, частота сердцебиений увеличивается на протяжении всего молочного периода развития (Зефиров Т.Л., 1999). У них же ставятся под сомнение само наличие тонуса вагуса (Конради Г.П., 1980). В то же время электрическая стимуляция блуждающих нервов у данного вида животных приводит к выраженной брадикардии, которая полностью блокируется введением атропина, поэтому весьма актуальным является изучение молекулярных механизмов регулирующих формирование потенциала действия в сердечных клетках (Волков Е.М., 1983; Chen H., 2005). Согласно классическим представлениям активация парасимпатикуса ингибирует не только хронотропию, но и инотропию сердца при взаимодействии ацетилхолина с М-ХР. Однако множество исследователей получили результаты противоположные данной точки зрения. Показано, что активация М-ХР может вызывать как положительный, так и отрицательный инотропный эффект (Cui X.L. et al., 2007; Houchi H. et al., 2007; Hussain R.I. et al., 2009; Kitazawa T. et al., 2009). Существует предположение, что в основе особенностей регуляции сократительной активности миокарда лежит взаимодействие АХ с разными подтипами М-ХР, активации систем вторичных посредников и модуляции деятельности различных эффекторов (Anger T. et al., 2007; Ganzinelli S. et al., 2007; Myslivecek J. et al., 2008; Vieira C. et al., 2009; Hang P.Z. et al., 2009; Hussain R.I. et al., 2009; van Borren M.M. et al., 2010). Таким образом, весьма актуальным является изучение влияния селективной блокады разных подтипов М-ХР на инотропную реакцию миокарда после введения карбахолина.
В последние годы активно развивается изучение роли токов, активируемые гиперполяризацией в регуляции сердечного ритма (Зиятдинова Н.И., 2001; Зефиров Т.Л. и др., 2007; DiFrancesco D. et al., 2009; Barbuti. et al. 2009; Maher MP. et al., 2009; Verkerk AO. et al., 2009). В то же время малоизученной остается роль данных токов в регуляции инотропии сердца. Имеются данные о том, что стимуляция М-ХР может ингибировать активность токов, активируемые гиперполяризацией путем генерации NO (Lang N. et al., 2007). Именно поэтому изучение влияния блокады разных подтипов М-ХР и If является крайне актуальным.
Цель исследования:
Целью настоящего исследования является изучение in vitro роли разных подтипов мускариновых холинорецептров, а также токов, активируемых гиперполяризацией в регуляции инотропии сердца крыс на разных этапах постнатального развития.
Задачи исследования:
Определить дозозависимое влияние карбахолина на сократимость миокарда предсердий и желудочков крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Определить дозозависимое влияние атропина на сократимость миокарда предсердий и желудочков крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Изучить влияние неселективной блокады М-ХР атропином на эффект действия карбахолина у крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Исследовать влияние селективной блокады М1-ХР пирензипином на эффект действия карбахолина у крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Определить влияние селективной блокады М2-ХР галламином на эффект действия карбахолина у крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Оценить влияние селективной блокады М3-ХР 4-DAMP на эффект действия карбахолина у крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Изучить влияние блокады токов, активируемых при гиперполяризации, селективным блокатором ZD 7288 на силу сокращений изолированного миокарда у крыс 1-но, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста.
Научная новизна
Впервые выявлены возрастные особенности влияния блокады токов, активируемых при гиперполяризации на сократительную активность миокарда предсердий и желудочков крыс. Показано, что блокада If вызывает увеличение силы сокращения миокарда предсердий и желудочков крыс 1-но, 6-ти, 8-ми и 20-ти недельного возраста. Блокада токов, активируемых при гиперполяризации вызывает уменьшение силы сокращения миокарда предсердий и желудочков 3-х недельных животных. Впервые установлено отсутствие отрицательного инотропного эффекта карбахолина на сократимость миокарда предсердий новорожденных крысят. Впервые выявлено наличие собственного действия атропина в высоких концентрациях на сократительную активность миокарда предсердий и желудочков крыс на важнейших этапах постнатального онтогенеза. Приоритетными являются данные о том, что отрицательный инотропный эффект карбахолина не снимается селективной блокадой М1, М2 и М3 холинорецепторов.
Научно-практическая значимость
Полученные результаты расширяют представления о роли парасимпатического отдела вегетативной нервной системы в регуляции инотропной функции сердца крыс на разных этапах постнатального онтогенеза. Результаты экспериментов свидетельствуют о существенном значении токов, активируемых при гиперполяризации в регуляции сократительной активности миокарда предсердий и желудочков крыс. Результаты экспериментов с блокадой If на 3-х недельных животных свидетельствуют о наличии особенностей механизмов регуляции сократительной активности сердца на данном этапе постнатального онтогенеза. Полученные данные необходимо использовать для правильной трактовки результатов фармакологических и физиологических исследований на сердечно-сосудистой системе крыс в зависимости от их возраста.
Полученные нами результаты представляют безусловный интерес для фармакологов, изучающих влияние различных мускариновых холиноблокаторов на сердечную деятельность с использованием крыс в качестве экспериментальных животных. Материал исследований представляет интерес для специалистов по возрастной и нормальной физиологии, фармакологии и кардиологии.
Основные положения, выносимые на защиту
Селективная и неселективная блокада М-ХР не предотвращает уменьшение сократительной активности миокарда крыс под влиянием карбахолина.
Блокада If оказывает разнонаправленное влияние на инотропию сердца крыс, ингибирует – у 3-х недельных животных и увеличивает силу сокращений во всех остальных возрастных группах.
Апробация работы
Материалы диссертации представлены на итоговых научных конференциях молодых ученых и преподавателей Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (2008-2010); V всероссийской конференции с международным участием “Механизмы функционирования висцеральных систем”, Санкт-Петербург, 2007; четвёртой всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения, Москва, 2008; IХ всероссийской конференции «Физиологические механизмы адаптации растущего организма», посвященной юбилею проф. Ф.Г. Ситдикова, Казань-Яльчик, 2008; всероссийской научно-практической конференции «Инновационные подходы к естественнонаучным исследованиям и образованию», посвященной юбилею ЕГФ, Казань, 2009; международной конференция, посвященной 65-юбилею института возрастной физиологии, Москва, 2009; VII всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем», посвященной 160-летию со дня рождения И.П. Павлова, Санкт-Петербург, 2009.
Публикации
Автором опубликовано 25 печатных научных работ, в том числе 1 статья в рецензируемом журнале (из списка ВАК).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора научной литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 301 наименование, в том числе 81 отечественных и 220 зарубежных литературных источника. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 17 рисунками.
Список используемых сокращений
Ах – ацетилхолин, g – грамм, n – количество животных, нед. – неделя, М-ХР – М-холинорецепторы, М1-ХР –М1–холинорецепторы, М2–ХР -М2– холинорецепторы, М3-ХР – М3-холинорецепторы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Эксперименты проводились на 342 белых беспородных крысах в возрасте 1-ой, 3-х, 6-ти, 8-ми и 20-ти недель. В качестве наркоза использовали 25% раствор уретана, в дозе 1000 мг/кг массы животного. Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на полосках миокарда из правого предсердия и правого желудочка длиной 2-3 мм и диаметром 0,8-1,0 мм на установке Power Lab (AD Instruments, Австралия). Препарат помещали вертикально в резервуар V = 20 мл, оксигенированный карбогеном (97% O2 и 3% CO2) рабочий раствор при комнатной температуре, в состав которого входили: NaСl - 8 гр; KCl - 0,3гр; CaCl2- - 0,38 гр; MgSO4 - 0,125 гр; NaHPO4 - 0,04 гр; Глюкоза - 2 г; Trizma base- 0.25 г/л ( Sigma). Препарат стимулировался электрическим сигналом через 2 серебряных электрода (с помощью стимулятора ЭСЛ – 2 (Россия) с частотой 6 и 10 стимулов в минуту. По окончанию проработки 5 минут регистрировались исходные параметры сокращения, затем 21 минуту с добавлением в рабочий раствор специфических блокаторов: агонист холинорецепторов карбахолин, неселективный блокатор М-ХР атропин; селективные блокаторы М1-ХР пирензипин; М2-ХР галламин; М3-ХР 4-DAMP; If-каналов ZD7288. Рассчитывали реакцию силы сокращения в ответ на действие фармакологических веществ в процентах от исходного. Статистическая обработка проводилась с применением пакета программ Statgraphics, и определение достоверности различий результатов исследований по критерию Стьюдента и Вулькоксона осуществлялись в редакторе Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Дозозависимое действие карбахолина на силу сокращения миокарда крыс в постнатальном онтогенезе.
Достоверные изменения сократимости миокарда предсердий и желудочков крыс 20-ти недельных возраста наблюдались лишь при действии карбахолина в концентрации 10-5 М. Сила сокращения миокарда предсердий уменьшалась с 0,280757±0,069024 g до 0,218338±0,053804 g (р<0,05), миокарда желудочков с 0,276514±0,058016g до 0,195407±0,048672 g (р<0,001) (табл. 1).
У животных 8-ми недельного возраста реакция сократимости полосок миокарда предсердий и желудочков зависела от концентрации. Карбахолин в концентрациях 10-6 М и 10-9 М не вызывал достоверных изменений сократимости миокарда предсердий. Карбахолин в концентрации 10-5 М уменьшал силу сокращений миокарда предсердий с 0,233642±0,112475 g до 0,161583±0,085385 g (р<0,05) (табл. 1), в концентрации 10-8 М с 1,0551270,164174 g до 1,0189860,163328 g (р<0,01). Карбахолин в концентрации 10-7 М, напротив, увеличивал силу сокращения изолированных полосок миокарда правого предсердия с 1,095670,174225 g до 1,1302920,180159 g(р<0,05).
Амплитуда сокращения изолированных полосок миокарда правого желудочка уменьшалась при введении карбахолина в концентрации 10-5 М с 0,122236±0,036964 g до 0,076398±0,026005g (р<0,01). Карбахолин в концентрации 10-9 М достоверно увеличил силу сокращения изолированных полосок миокарда желудочков с 0,2206500,03779 g до 0,2412630,043179 g (р <0,05).
Амплитуда сокращения полосок миокарда желудочков крыс 6-ти недельного возраста изменялась при введении карбахолина в концентрации 10-5 М и 10-8 М. Карбахолин в концентрации 10-5 М уменьшал силу сокращения миокарда желудочков с 0,154928±0,024818 g до 0,103097±0,016064 g (р<0,001), в концентрации 10-8 М с 0,3759430,002084 g до 0,3671060,000807 g (р<0,01). Амплитуда сокращений миокарда правого предсердия уменьшалась при действии карбахолина в концентрации 10-5 М с 0,23992±0,072524 g до 0,17086±0,066585 g (р<0,001) (табл. 1).
Сила сокращения миокарда предсердий животных 3-х недельного возраста уменьшалась при введении карбахолина в концентрации 10-5 М с 0,184734±0,05854 g до 0,121994±0,041111 g (р<0,01), в концентрации 10-6 М 0,1545570,047939 g до 0,1481590,046955 g (р<0,01). Достоверное уменьшение сократимости миокарда желудочков наблюдалось при введении карабахолина в концентрации 10-5 М с 0,121646±0,024323 g до 0,07615±0,016482 g (р<0,01) (табл. 1).
У крыс 1-но недельного возраста не наблюдалось изменение сократимости миокарда предсердий при введении всех изученных концентраций карбахолина. Амплитуда сокращения миокарда желудочков уменьшалась с 0,126922±0,038668 g до 0,111338±0,034314 g (р <0,01) (табл.1).
Влияние карбахолина (10-5 М) на силу сокращения полосок миокарда предсердий крыс
Возраст (нед)
n=10
|
Исходная мин
|
1 мин
|
7 мин
|
14 мин
|
21 мин
|
1 нед
|
0,067249±0,024253
|
0,067248±0,02445
|
0,068674±0,025204
|
0,067581±0,024835
|
0,065602±0,024059
|
3 нед
|
0,184734±0,05854
|
0,174185±0,05641
|
0,15011±0,052016
**
|
0,139117±0,049869
**
|
0,121994±0,041111
**
|
6 нед
|
0,23992±0,072524
|
0,233968±0,076819
|
0,194845±0,070196
***
|
0,181727±0,069004
**
|
0,17086±0,066585
***
|
8 нед
|
0,233642±0,112475
|
0,220874±0,108752*
|
0,193678±0,096452
*
|
0,176226±0,089392
*
|
0,161583±0,085385
*
|
20 нед
|
0,280757±0,069024
|
0,264817±0,070905
|
0,226664±0,060598
**
|
0,222947±0,055694
**
|
0,218338±0,053804
*
|
Влияние карбахолина (10-5 М) на силу сокращения полосок миокарда желудочков крыс
Возраст (неделя)
n=10
|
Исходная мин
|
1 мин
|
7 мин
|
14 мин
|
21 мин
|
1 нед
|
0,126922±0,038668
|
0,124476±0,037722
|
0,118778±0,035925
**
|
0,114709±0,035047
**
|
0,111338±0,034314
**
|
3 нед
|
0,121646±0,024323
|
0,110932±0,022875
|
0,096634±0,02109
**
|
0,084288±0,018526**
|
0,07615±0,016482
**
|
6 нед
|
0,154928±0,024818
|
0,150114±0,025178*
|
0,120197±0,020471***
|
0,10996±0,018651
***
|
0,103097±0,016064
***
|
8 нед
|
0,122236±0,036964
|
0,118003±0,03512
|
0,107229±0,032826
|
0,090343±0,029463
**
|
0,076398±0,026005
**
|
20 нед
|
0,276514±0,058016
|
0,269531±0,055655
|
0,222493±0,048771
***
|
0,202729±0,047518
***
|
0,195407±0,048672
***
|
Примечание: Р≤0,05(*), Р≤0,01(**), Р≤0,001(***).
|
