Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 345.83 Kb.
|
1 2
Федеральное агентство по образованию
НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П1706 от 23 сентября 2009 г.
Томск 2009 г. РЕФЕРАТ Отчет 37 с., 1ч., 0 рис., 0 табл., 40 источн., 0 прил. Рак желудка, предраковое заболевание желудка, молекулярно-цитогенетические маркеры. В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 1 этапу Государственного контракта № П1706 «Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка» (шифр «НК-366П») от 23 сентября 2009 по направлению «Физико-химическая молекулярная и клеточная биология» в рамках мероприятия 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами» федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы. Цель работы - анализ спектра и уровня хромосомных аберраций в тканях ранних стадия рака желудка и предраковых заболеваний эпителия желудка. Методы, использованные при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: метод фенольной экстракции ДНК из операционных и биопсийных образцов. Инструментарий, использованный при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: морозильная камера «Sanyo», видеогастроскоп «GIF-Q160Z» с биопсийными щипцами, термостат лабораторный ТАТ ТВЗ-25, наборы для выделения ДНК из тканей человека «QIAamp DNA mini Kit» фирмы «Qiagen», лабораторная центрифуга с охлаждением для микропробирок «Эппендорф 5415R», микротермостат «БИС-205», миницентрифуга-вортекс для микропробирок «Biosan Microspin FV-2400», микродозаторы для дозирования микрообъемов жидкостей, установка для очистки воды «Milipore – Mili Q», низкотемпературная морозильная камера «Sanyo», pH-метр «Hanna Intrument - pHer+», персональный компьютер с доступом в интернет, ГОСТ 7.32-2001, база данных Pubmed по биомедицинским публикациям. Результаты, полученные при выполнении отдельных видов работ по Государственному контракту: проведен аналитический обзор литературы по вопросу хромосомных нарушений в тканях предраковых заболеваний желудка и опухолевых тканей данного органа, исследованы вопросы эпидемиологии, патоморфологии и клинических-морфологических характеристик рака желудка. На базе клинического отдела НИИ онкологии СО РАМН был собран биопсийный и операционный материал ранних раков и предраковых заболеваний желудка (n=103). Сформированы две выборки: 34 образца опухолевых тканей и 69 образцов тканей предраковых заболеваний эпителия желудка. В ходе проделанной работы за 2009 год методом фенольной экстракции было выделено 65 образцов ДНК из опухолевых тканей и тканей предраковых заболеваний желудка, определена концентрация ДНК во всех 65 образцах. Подготовлена отчетная документация за первый этап выполнения научно-исследовательской работы. Дополнений нет. СОДЕРЖАНИЕ Введение 3 1. Аналитический обзор 7 1.1 Некоторые эпидемиологические, патоморфологические и молекулярно-генетические аспекты рака желудка 7 1.2 Хромосомные нарушения в клетках линий рака желудка 10 1.3 Исследование хромосомных нарушений при раке желудка с Помощью сравнительной геномной гибридизации 13 1.4 Новые технологии исследования хромосомных нарушений при раке желудка 19 2. Выбор обоснованного варианта направления исследований 25 3. План проведения экспериментальных и теоретических исследований 27 4. Результаты экспериментальных и теоретических исследований 28 Заключение 29 Список литературы 31 Проведение 1 этапа исследований по проблеме: Молекулярно-цитогенетический профиль хромосомной изменчивости на ранних этапах злокачественной трансформации клеток эпителия желудка ВВЕДЕНИЕ Злокачественные опухоли являются одной из главных причин заболеваемости, потери трудоспособности и смертности человека. Сегодня рак занимает третье место в мире по количеству вызываемых смертей после сердечно-сосудистых заболеваний и травм. Особенностями рака являются высокая частота возникновения, большой процент летальных исходов, а также наличие социального и экологического аспектов, влияющих на его возникновение и распространение. Несмотря на значительное количество исследований данной патологии, улучшению диагностических возможностей и терапии опухолей, рак остается угрозой здоровью и жизни населения. На сегодняшний день благодаря изучению канцерогенеза, не вызывает сомнений мультифакториальная природа опухолей. Однако в основе патологических изменений в клетке и становлении ее на путь малигнизации лежат нарушения генома. Поскольку опухолевые клетки отличаются большой гетерогенностью по типам, уровню и характеру геномных нарушений, всегда существовал вопрос о первопричинности малигнизации клетки организма, какого типа изменения генома являются толчком в становлении нормальной клетки на путь раковой. Следует отметить, что в настоящее время существует несколько альтернативных точек зрения на эту проблему [12]. Согласно одной из них, наиболее популярной, опухолевые клетки возникают в результате накопления нескольких мутаций в генах-онкосупрессорах, белковые продукты которых обеспечивают поддержание стабильности генома, либо в онкогенах, ответственных за пролиферацию клеток. С другой стороны, есть мнение, что для возникновения опухоли должны произойти мутации в особых клеточных генах, ответственных за регуляцию таких ключевых процессов, определяющих стабильность генома, как регуляция клеточного цикла, репарация ДНК, апоптоз. При этом клетки приобретают так называемый «мутаторный фенотип», который характеризуется высоким уровнем геномной нестабильности. В результате подобные клетки становятся неспособными к репарации полученных повреждений и сами начинают индуцировать новые мутации [7]. В последнее время широкое распространение получила эпигенетическая концепция канцерогенеза, согласно которой в основе первичных процессов злокачественной трансформации клеток лежат нарушения эпигенетической организации хроматина - аномалии метилирования ДНК или ковалентных модификаций гистоновых белков [14]. Наконец существует гипотеза, согласно которой к множественным изменениям на геномном уровне может привести индуцированная различными канцерогенами анеуплоидия в соматических клетках, при которой одновременно возникает дисбаланс нескольких тысяч генов [11]. Рак желудка занимает особое место среди новообразований человека. Как причина смертности, данный тип неоплазии занимает четвертое место после рака легкого, опухолей молочной железы и рака кожи. Особенностями рака желудка являются высокая частота возникновения, отсутствие клинических проявлений на ранних стадиях заболевания, гетерогенность по гистологическим подтипам и наличие большого спектра хромосомных нарушений. В большинстве случаев рак желудка развивается на фоне длительно существующих предопухолевых изменений слизистой. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую. Однако в желудке выявляются также различные морфологические заболевания неонкогенной природы, такие как хронический атрофический гиперпластический гастрит, аденоматозные полипы, пернициозная анемия, состояния после резекции желудка, болезнь Менетрие. Установлено, что более 80% случаев дистального рака желудка связаны с инфекцией Helicobacter pylori и последующим гастритом [26]. Поэтому ввиду своей высокой распространенности и достаточно высокого злокачественного потенциала хронические, особенно атрофические, гастриты, спровоцированные Helicobacter pylori, вызывают особый интерес и нуждаются в ранней диагностике. Такие «фоновые» патологии могут способствовать появлению очага опухолевой инициации. Пациентов с такими заболеваниями включают в группы риска, ставят на диспансерный учет. Однако при этом, никакой превентивной предопухолевой терапии не проводится из-за отсутствия диагностических маркеров опухолевой трансформации для клинической диагностики предраковых заболеваний. Кроме морфологических изменений предраковые заболевания характеризуются нарушениями хромосомного материала. Исследования хромосомных нарушений в клетках предраковых заболеваниях желудка, являющихся фактором риска развития опухоли, представляют большой научно-практический интерес, в связи с необходимостью более глубокого понимания процессов канцерогенеза желудка и, в последствие, адекватного выбора терапии для конкретного пациента. Исследования тканей предраковых заболеваний желудка, таких как атрофический гастрит, аденома с помощью молекулярно-цитогенетических методов также актуальны в связи с поисками генетических маркеров для ранней диагностики заболевания. Одним из используемых методов для исследования хромосомных нарушений является метод стандартной геномной гибридизации (Comparative genomic hybridization, CGH) разработанный в 1992 году A. Kallioniemi [15]. Данный метод представляет собой конкурентную гибридизацию эквимолярных количеств тестируемой и контрольной ДНК на нормальных метафазных пластинках здорового индивида. CGH обеспечивает детальное исследование всех несбалансированных структурных и числовых хромосомных нарушений в солидных опухолях в одной реакции гибридизации, исключая этап приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани. Таким образом, выполнение данного научно-исследовательского проекта, позволит получить общую картину нарушений хромосомного материала в клетках данных патологических состояний с диспластическими изменениями, а также будет способствовать накоплению новых знаний о канцерогенных процессах на ранних стадиях развития неоплазии желудка до клинических проявлений опухоли. Кроме того, сравнение уровня и спектра хромосомных аберраций в клетках предраковых заболеваний желудка и зрелых опухолей, возможно, откроет механизмы клонального отбора диспластических клеток с определенным генетическим портретом, обеспечивающим быстрый рост и развитие опухоли, что определит выбор необходимой предопухолевой терапии для своевременного воздействия на морфологически измененные ткани эпителия желудка. Решение этих вопросов является актуальным направлением исследований в области изучения цитогенетики как злокачественных новообразований в целом, так и рака желудка в частности. Целью настоящей работы является анализ спектра и уровня хромосомных аберраций в тканях ранних стадия рака желудка и предраковых заболеваний эпителия желудка. Задачи данного исследования:
В ходе выполненной работы будут впервые охарактеризованы хромосомные аберрации в клетках тканей предраковых заболеваний желудка, получены данные об уровне и спектре нарушений хромосомного материала и описан генетический портрет предопухолевых состояний эпителия желудка. Будет установлен вклад различных аномалий хромосом в процессы инициации и прогрессии рака желудка. Реализация данного проекта позволит провести поиск возможных генетических маркеров для однозначной интерпретации латентной онкогенной трансформации клеток для ранней диагностики рака желудка. Кроме того, выполнение данного исследования позволит получить новые данные в области механизмов канцерогенеза желудка, клеточной и молекулярной биологии, онкогенетики и медицинской генетики. 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 1.1 НЕКОТОРЫЕ ЭТИОЛОГИЧЕСКИЕ, ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАКА ЖЕЛУДКА На сегодняшний день большой научно-практический интерес представляют исследования рака желудка, который, несмотря на снижение заболеваемости, остается одной из наиболее распространенных неоплазий в мире. Наиболее высокие показатели заболеваемости и смертности отмечены в Японии, Китае, Скандинавии и европейских странах, низкие – в США, Австралии, Канаде. По данным последнего обзора «Gastrointestinal cancers in Europe», ежегодно в Европе диагностируется около 2 000 000 новых случаев рака желудка, которые ответственны почти за 150 000 случаев смертей в год (Gastrointestinal cancers in Europe, 2003). Данный тип неоплазии, как причина смертности населения России, занимает четвертое место (8,8%) после рака легкого (12%), молочной железы (11,9%) и рака кожи (10,6%). В структуре онкологической заболеваемости среди мужчин опухоли желудка занимают третье место (10,8%), среди женщин – второе (7,1%). Ежегодно в России регистрируется более 50 тыс. новых случаев опухолей данной локализации [1]. Патогенез рака желудка является примером генносредового взаимодействия. Некоторые эпидемиологические исследования показывают, что факторами риска развития рака желудка являются атрофия слизистой желудка, связанная с инфекцией Helicobacter pylori, курение, алкоголь, соленая пища, недостаточное употребление в пищу овощных продуктов [26, 33]. Таким образом, географические различия в частоте встречаемости данной патологии могут быть связаны как с генетическими, так и со средовыми факторами. Опухоли желудка отличаются сложностью в диагностировании по причине отсутствия клинических проявлений на ранних стадиях и большим спектром генетических изменений. Канцерогенез желудка представляет собой сложный многоступенчатый процесс малигнизации клеток, в основе которого лежит множество генетических и эпигенетических факторов. В структуру геномных нарушений клеток рака желудка входит потеря гетерозиготности в специфических хромосомных регионах [36], микросателлитная нестабильность [32], мутации в онкогенах и опухолесупрессорах [27, 35] и эпигенетические модификации хроматина [37, 9]. Одной из характеристик малигнизированных клеток являются также хромосомные аберрации. Данный тип нарушения хромосомного материала клетки является одним из признаков канцерогенеза и возможно связан с активацией онкогенов и инактивацией опухолесупрессорных генов. Однако, несмотря на то, что на сегодняшний день обнаружено большое количество хромосомных нарушений в опухолевых клетках желудка, существуют разногласия во взглядах на роль определенных хромосомных аномалий в процессах инициации и прогрессии рака желудка. В большинстве случаев рак желудка развивается на фоне длительно существующих предопухолевых изменений слизистой. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую. Однако в желудке выявляются также различные морфологические заболевания неонкогенной природы, такие как хронический атрофический гиперпластический гастрит, аденоматозные полипы, пернициозная анемия, состояния после резекции желудка, болезнь Менетрие. Такие «фоновые» патологии могут способствовать появлению очага опухолевой инициации. Пациентов с такими заболеваниями включают в группы риска, ставят на диспансерный учет. Однако при этом, никакой превентивной предопухолевой терапии не проводится из-за отсутствия диагностических маркеров опухолевой трансформации для клинической диагностики предраковых заболеваний. Кроме морфологических изменений предраковые заболевания характеризуются нарушениями хромосомного материала. Исследования хромосомных нарушений в клетках предраковых заболеваниях желудка, являющихся фактором риска развития опухоли, представляют большой научно-практический интерес, в связи с необходимостью более глубокого понимания процессов канцерогенеза желудка и, в последствие, адекватного выбора терапии для конкретного пациента. Работы по изучению хромосомных аномалий хромосом в диспластических и непосредственно раковых клетках желудка проводятся с использованием различных методик и модельных объектов. Исследования с помощью стандартной цитогенетики сфокусированы в основном на изучении происхождения повторяющихся хромосомных нарушений. Однако эти исследования имеют ряд ограничений, связанных, прежде всего, со сложностью получения качественных препаратов метафазных хромосом, комплексной структурой нарушений, возможностью клональной селекции клеток с хромосомными аномалиями в условиях культивирования in vitro. Молекулярно-цитогенетические методы позволяют решать подобные проблемы путем исследования ДНК, выделенной непосредственно из опухолевой ткани, без приготовления препаратов хромосом. С развитием методов флуоресцентной гибридизации (fluorescence in situ hybridization, FISH) и сравнительной геномной гибридизация (comparative genomic hybridization, CGH) была получена важная информация о разнообразии нарушений хромосомного материала, вовлеченных в канцерогенез рака желудка. 1.2 ХРОМОСОМНЫЕ НАРУШЕНИЯ В КЛЕТКАХ ЛИНИЙ РАКА ЖЕЛУДКА Первые исследования хромосомных аномалий при раке желудка были проведены на линиях опухолевых клеток с помощью методов стандартной цитогенетики в начале 60-х годов прошлого столетия. Первая линия (CaVe) была получена в 1963 году Добрыниным [23]. С того времени создано более 70 стабильных клеточных линий рака желудка, большинство из которых получили японские ученые. Наиболее широко используемыми являются линии серии MKN (MKN-1, MKN-7, MKN-28, MKN-45 и MKN-74), KATO-III и TMK-1, а также линии серии SNU, полученные Корейскими учеными в 1997 году. Клетки для культивирования данных линий были взяты от опухолей желудка человека различных гистологических типов, включая интестинальный и диффузный типы рака. В области молекулярной генетики рака линии MKN-7 и KATO-III занимают особое место, поскольку именно из них были впервые клонированы гены erbB-2 и K-sam [23]. Одной из первых методик для анализа хромосомных нарушений в опухолевых клетках явилось стандартное G-окрашивание метафазных хромосом. С его помощью в клетках линии SNU были выявлены аномалии 17 хромосомы, в частности делеция p плеча и частичная дупликация q плеча [10]. Наиболее частой аномалией была амплификация хромосомы 7 с точками разрыва в 7q22 и 7q31 участках. Хромосомные перестройки были также обнаружены в 1q32, 5q11-q22, 8q, 14q22, 14q34 и 15q15 участках [10]. Исследования на других линиях показали большое количество числовых и структурных хромосомных аберраций, включая перестройки хромосом 3, 11, делецию 6q21, трисомию по хромосоме 8, моносомию и транслокации по хромосоме 13 [28, 31]. Работы более поздних лет с применением методов стандартной цитогенетики также выявили структурные аберрации хромосом 7, 8, 14 и 17. Однако были обнаружены аномалии, затрагивающие и хромосомы 1, 6, 11 и 13. Кроме того, была выявлена амплификация 11p15 и транслокации t(1;7), t(7;14), t(6;17), t(5;14) [37]. Таким образом, с помощью методов классической цитогенетики впервые были охарактеризованы некоторые хромосомные нарушения в линиях опухолевых клеток рака желудка. Однако следует констатировать, что исследований хромосомных аномалий опухолевых клеток с применением методов стандартной цитогенетики было проведено сравнительно мало, что обусловлено, в первую очередь, отмеченными выше ограничениями метода. Это обстоятельство во многом затрудняло получение данных о структуре хромосомной изменчивости при раке желудка. Появление технологий молекулярной цитогенетики позволило преодолеть ограничения классических методов цитогенетического анализа. С развитием метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), предложенного Пинкелем с соавторами в 1986 году [30], и его модификаций, появилась возможность выявления тонких структурных перестроек и стабильных хромосомных аберраций, которые невозможно было точно охарактеризовать методами рутинного или дифференциального окрашивания хромосом. В 2004 году была получена новая линия рака желудка ACP01 [22]. Ее основой явились клетки аденокарциномы желудка интестинального типа. В нескольких исследованиях хромосомных нарушений на интерфазных клетках линии ACP01 с помощью FISH техники была обнаружена анеуплоидия по 8 хромосоме [22, 13]. Сегодня работы на линиях проводятся в основном с применением метода спектрального кариотипирования (spectral kyryotyping, SKY). Суть метода состоит в окрашивании хромосом набором флуоресцентных красителей, связывающихся со специфическими областями хромосом. В результате такого окрашивания гомологичные пары хромосом приобретают идентичные спектральные характеристики, что не только существенно облегчает выявление таких пар, но и облегчает обнаружение межхромосомных транслокаций, поскольку транслоцированные участки имеют спектр, отличающийся от спектра остальной хромосомы. Данная методика позволяет уточнить природу хромосомной аномалии. Также SKY применяется для выявления происхождения «маркерных хромосом» в геноме. Спектральное кариотипирование позволяет более детально описать аномальный кариотип опухолевой клетки [5]. Исследования линий рака желудка, проведенные с использованием SKY, выявили наличие большого количества транслокаций. Хромосомы 8 и 11 оказались наиболее часто вовлеченными в перестройки. Затем по числу аномалий следовали хромосомы 1, 7, 13, 17, 20. Наибольшая частота разрывов локализована в 8q24.1 участке, далее следовали регионы 11q13, 13q14, 20q11.2, 7q32, 17q11.2, 18q21, 17q23, 18q11.2 [40]. Таким образом, совершенствование методов исследований привело к накоплению определенного багажа знаний о структуре нарушений хромосомного материала в малигнизированных клетках. Появились представления о типах генетических аномалий и их ассоциации с определенными фенотипическими проявлениями неоплазий. Однако появление методов полногеномного анализа хромосомных аберраций в опухолевых клетках позволило встать на новую ступень в исследовании данной патологии и получить принципиально новые данные, позволяющие сделать большой шаг к разработке новых программ диагностики, терапии и лечения рака желудка. 1.3 ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА С ПОМОЩЬЮ СРАВНИТЕЛЬНОЙ ГЕНОМНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ В настоящее время в исследованиях опухолевых тканей широкое распространение получил метод сравнительной геномной гибридизации (Comparative genomic hybridization, CGH), предложенный Анне Каллиониеми с соавторами в 1992 году [15]. Метод основан на гибридизации эквимолярных количеств тестируемой и контрольной ДНК с ДНК метафазных хромосом, полученных от здорового индивида. Тестируемая (опухолевая) и контрольная ДНК метятся различными флуорохромами. Мечение осуществляется, как правило, в реакции ник-трансляции, в ходе которой в последовательность ДНК включаются дезоксирибонуклеотиды, к которым прикреплены либо непосредственно флуорохромы (например, Fluorescein, Tamra), либо гаптены – репортерные молекулы (биотин, дигоксигенин), с которыми впоследствии в реакции иммунохимического окрашивания связываются антитела, имеющие в своем составе флуорохромные группировки. Далее с помощью специального программного обеспечения рассчитывается отношение интенсивности свечения флуорохромов вдоль каждой хромосомы набора. Полученное флуоресцентное отношение показывает содержание последовательностей ДНК в исследуемом образце по сравнению с эуплоидным контролем. При отсутствии хромосомного дисбаланса между тестируемой и контрольной ДНК отношение флуоресцентного свечения одного флуорохрома к другому (как правило, зеленого – маркирующего тестируемый образец, к красному – маркирующему контрольную ДНК) будет равно единице. В случае амплификаций хромосомного материала будет регистрироваться увеличение флуоресцентного отношения и его сдвиг в зеленую область спектра. При делециях флуоресцентное отношение, напротив, будет равно 0. Основным достоинством CGH является детальное исследование числовых и несбалансированных структурных хромосомных нарушений в рамках одного эксперимента, исключающее необходимость приготовления цитогенетических препаратов из опухолевых клеток. Применение данной методики расширило знания о спектре и уровне хромосомных перестроек в опухолях различных локализаций, позволило идентифицировать тонкие аномалии хромосом и привело к быстрому накоплению знаний о роли хромосомных аберраций в возникновении и прогрессии рака. На момент написания настоящего аналитического обзора по данным базы «Progenetix» с помощью CGH было проанализировано 979 образцов опухолевых тканей желудка. Наиболее общими нарушениями хромосомного материала в опухолевых клетках желудка являются амплификации 8q, 20q, 13q, 3q, 7q и 17q, а также уменьшение числа копий ДНК в 17p, 19p, 18q, 1p и 5q [2]. Рак желудка характеризуется различными клинико-морфологическими параметрами, такими как гистологический тип, венозное и лимфогенное метастазирование, тип предракового заболевания, в основе проявления которых лежат определенные хромосомные аберрации, эпигенетические, генетические и молекулярные события. Однако в соответствии с целью настоящего обзора рассмотрим ассоциацию именно хромосомных нарушений с некоторыми фенотипическими проявлениями данных характеристик. Большинство проведенных исследований были направлены на поиск специфических «повторяющихся» перестроек, сопоставление которых с генами, экспрессия которых изменилась в ходе возникновения этих перестроек, а также со степенью прогрессии опухоли, локализацией и гистологией, можно было бы использовать при выборе адекватных способов ранней диагностики и терапии опухоли. На сегодняшний день с помощью молекулярно-цитогенетического анализа описано множество хромосомных нарушений, ассоциированных с патологической картиной, стадией прогрессии опухоли, прогнозом заболевания. Кроме того, возможность исследования нативных и архивных образцов тканей данной патологии с известным патоморфологическим диагнозом, схемой химеолучевого лечения и результатом течения заболевания позволила получить новую ценную информацию по этим вопросам. Некоторые исследования показали ассоциацию изменений числа копий ДНК с характером метастазирования. Так установлена связь между потерей хромосомного материала в 4q и 21q и лимфогенным метастазированием, амплификацией в 7р и делециями в 4q и 18q с венозной инвазией, а также потерей хромосомного материала в 18q со стадией патологического процесса [20]. Опухоли желудка отличаются высокой гетерогенностью по гистологическим подтипам. В соответствии с классификацией Лоурена выделяют два основных гистологических типа рака желудка: интестинальный и диффузный [21]. Развитие интестинального типа опухоли происходит ступенчато, через предраковые состояния. Изначальным патологическим изменением является атрофический гастрит, затем интестинальная метаплазия, дисплазия и карцинома. Диффузный тип рака желудка, напротив, не характеризуется ступенчатым развитием. В основе его возникновения лежит хронический гастрит, ассоциированный с инфекцией Helicobacter pylori [33]. Данные о связи хромосомных нарушений с гистологическим типом опухоли противоречивы. В некоторых работах показано отсутствие корреляций между специфическими хромосомными изменениями и гистотипом опухоли [4], тогда как в других работах публикуются данные о наличии подобных ассоциаций [17]. Так, по данным японской исследовательской группы, общим нарушением хромосомного материала в опухолях желудка интестинального типа является потеря генетического материала в 8p плече, в то время как амплификация хромосомного материала 8p плеча характерна для диффузного типа опухолей. Наиболее частыми нарушениями для интестинального типа являются также амплификации 20q и 9p районов. Амплификация 12q плеча является более общим нарушением в опухолях желудка диффузного типа [18]. В другом исследовании были описаны амплификации 18q и 20q, как аномалии характерные для интестинального типа рака, в то время как амплификации в 8q, 13q и 17q участках были основными для диффузного типа [19]. В исследовании 53 образцов опухоли желудка было показано, что аномалии 8q, 17q, 3p и 5q более часто выявляются в интестинальных опухолях желудка, а аномалии хромосомы 13, в частности амплификация 13q характерна для опухолей диффузного типа [24]. С другой стороны, в некоторых исследованиях не обнаружено корреляций между спектром хромосомных аномалий и гистологическим типом опухоли [25]. Выявленные в ходе исследований общие аномалии хромосомы 8 в двух различных гистологических типах рака желудка могут быть объяснены с локализацией на данной хромосоме онкогена C-MYC, аномальная экспрессия которого регистрируется в широком спектре опухолей. Амплификации в 20q также обнаружены при многих типах рака, в частности, при раке груди и раке прямой кишки. Амплификации 17q плеча часто детектируются в различных неоплазиях человека, таких как рак гортани и рак легкого. Наблюдаемые различия в типах хромосомных нарушений, характерных для двух гистотипов опухолей желудка, возникают, предположительно, вследствие разных генетических путей патогенеза данных гистотипов рака и, соответственно, вовлечения специфических аномалий хромосом. Интересно, что наличие корреляций между хромосомными нарушениями и гистологическим типом неоплазии желудка показано в основном для так называемых популяций высокого риска заболеваемости, таких как Япония и Корея. Таким образом, отсутствие подобных ассоциаций в некоторых работах можно объяснить некоторыми популяционными особенностями, определяющими, возможно, другую генетическую модель канцерогенеза желудка. Эти данные показывают, что нарушения хромосомного материала могут играть важную роль в канцерогенезе различных гистологических подтипах желудка и применяться как прогностические и диагностические маркеры в клинической практике. В большинстве случаев рак желудка развивается на фоне длительно существующих предопухолевых изменений слизистой. Предраковые изменения представляют собой морфологические повреждения эпителия и замещение нормальной слизистой на диспластическую. Исследования хромосомных нарушений в предраковых заболеваниях желудка представляют большой научно-практический интерес, в связи с необходимостью поиска генетических маркеров для ранней диагностики заболевания, а также для более глубокого понимания генетических механизмов инициации процессов канцерогенеза и, впоследствии, адекватного выбора терапии для конкретного пациента. Работ, посвященных данной проблеме на сегодняшний день не очень много, что объясняется диагностикой рака желудка уже на поздних стадиях развития, в связи с отсутствием ранних клинических проявлений у пациентов. В ходе проведенного сравнительного анализа хромосомных нарушений в образцах аденомы и карциномы желудка, было показано, что общий уровень хромосомных аберраций в клетках аденомы был ниже, чем уровень нарушений в клетках аденокарциномы желудка [25]. Кроме того, спектр аномалий был также различен. Наиболее общим нарушением хромосомного материала в клетках аденоматозной ткани была потеря хромосомного материала в 16p и 17p участках. Тогда как основными аномалиями в клетках аденокарциномы являлись амплификации 8q, 13q, 20p и потери хромосомного материала в 12q, 14q, 15q, 16p и 17р. В другом исследовании была обнаружена амплификация короткого и длинного плеч хромосомы 17 и 20q и потеря хромосомного материала в 4q, 5q и 6q аденомы пилорической железы. В то время как основными аномалиями в клетках высокодифференцированной аденокарциномы были амплификации 1p36-pter, 9q34-qter, 17q24-qter, 20pq и 22q и потери хромосомного материала в 6q и 18q. Кроме того, с высокой частотой выявлялась амплификация участка 15q26 [20]. Данные работы показывают наличие большего спектра хромосомных аберраций в клетках опухолевых тканей желудка по сравнению с клетками тканей предраковых состояний желудка. Различия в уровне и спектре аномалий в клетках предраковых заболеваниями и опухолевых клетках желудка свидетельствуют об аккумулировании в ходе канцерогенеза хромосомных нарушений, что по видимому, способствует развитию опухоли и отбору клеточных клонов с определенными типами хромосомных нарушений. Несомненно, что исследования нарушений хромосомного материала у пациентов разных возрастных категорий имеют важное научно-практическое значение для более глубокого понимания механизмов канцерогенеза, определения программ развития опухоли, идентификации специфических маркеров опухолевого процесса в отношении возрастного критерия пациентов. Усовершенствование метода CGH основано на использовании вместо препаратов метафазных хромосом искусственно сконструированной матрицы, состоящей из прикрепленных к подложке клонированных районов генома. Данная модификация метода получила название матричной CGH (array-CGH). 1.4 НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИССЛЕДОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ РАКЕ ЖЕЛУДКА В основе метода array-CGH лежат основные принципы классической CGH с использованием окрашенной разными флуоресцентными красителями тестируемой и контрольной ДНК. Анализируемая и контрольная ДНК гибридизуются с фрагментами клонированной ДНК, помещенной на стекло (ДНК-платформа). Изменение в числе копий ДНК определяется по разнице в интенсивности свечения тестовой и контрольной ДНК. Стоит отметить, что чувствительность и специфичность array-CGH анализа практически полностью зависят от типа ДНК-платформы, а именно от количества клонов в матрице и вида клональной амплификации. На сегодняшний день большинство данных array-CGH анализа получены с использованием BAC (Bacterial Artificial Chromosome) клонов, которые обеспечивают достаточную интенсивность сигналов для детекции однокопийных изменений. Современные BAC-платформы варьируют по плотности от 2400 до 30000 клонов на биочип. Размер данных клонов колеблется в пределах от 150 до 200 kb. Другой подход связан с конструированием олигонуклеотидных платформ. Данные платформы характеризуются одноцепочечными олигонуклеотидными элементами протяженностью от 25 до 85 нуклеотидов. Изначально подобные платформы были изготовлены для определения олигонуклеотидных полиморфизмов, однако затем они стали использоваться для высокоразрешающего анализа числа копий ДНК. Платформы конструируются в зависимости от целей исследования. Например, одноканальная платформа фирмы Affymetrix (Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0) характеризуется возможностью анализа 1800000 генетических маркеров, включая 906.600 однонуклеотидных полиморфизмов и 946000 проб для детекции изменений числа копий ДНК [3] Таким образом, разрешающие способности метода array-CGH ограничивается только размерами клонов ДНК. Следовательно, можно сконструировать микрочип, покрывающий интересующий хромосомный регион с необходимой плотностью. Array-CGH широко используется в исследованиях опухолей человека. Основной областью применения данного метода является идентификация диагностических и прогностических генетических маркеров, маркеров опухолевой прогрессии, полногеномный скрининг числа копий ДНК. Использование данного подхода в исследованиях процесса канцерогенеза желудка позволило обнаружить более тонкие, ранее не детектированные, аномалии хромосом в малигнизированных клетках, связанные с различными параметрами опухолевого процесса, а также клинико-морфологическими характеристиками неоплазий. Одним из направлений исследований рака желудка с помощью данного метода является ассоциация изменения числа копий ДНК с фенотипическими и морфофункциональными характеристиками данного типа опухоли, что является важным при разработке стратегии лечения. Так, была обнаружена корреляция амплификации 1q32.3 и 18q22 хромосом с более агрессивным ростом опухоли и плохим клиническим прогнозом [28]. В исследовании 28 аденокарцином желудка была выявлена корреляция между амплификацией некоторых районов хромосом и клиническим статусом неоплазии. Также было показано, что потери хромосомного материала в 9p23 и 14q31 ассоциированы со статусом лимфатических узлов, а потери хромосомного материала в 4q23 и 4q28 связаны с метастазированием. [16]. В другом исследовании была выявлена связь между потерей хромосомного материала в 3p13 участке и перитонеальным метастазированием [39]. Таким образом, обнаруженные ассоциации нарушений хромосомного материала с биологическими параметрами опухоли потенциально могут быть использованы в клинике для характеристики опухолевого роста с последующим составлением индивидуальной схемы терапии опухоли. Кроме того, данные о потере хромосомного материала в определенных регионах могут использоваться в оценке метастатического потенциала опухоли желудка, что является важным аспектом при выборе объема оперативного вмешательства. В области исследований канцерогенеза желудка проводятся работы с использованием array-CGH по картированию кандидатных генов, которые могут играть важную роль в процессах развития опухоли. Так, по данным недавних исследований были обнаружены амплификации 16q21, 19q13.1, 5p15.1 и 3q26.31 участков и потери хромосомного материала в 3p21.32, 3p22.2, 19q13.33 и 19p13.3 участках. Наиболее частой аномалией оказалась потеря хромосомного материала в 19p13.3. Дальнейшее исследование одного из кандидатных опухолесупрессорных генов ZIPK (ZIP kinase), локализованного в 19p13.3 районе с помощью иммуногистохимических методов и применения тканевого биочипа, содержащего 172 первичные опухоли желудка, показало снижение экспрессии данного гена в 64,5% случаев, что значимо было связано с инвазией, метастазированием и плохим прогнозом [6]. Таким образом, анализ опухолесуппрессорного гена ZIPK может быть использован при оценке выживаемости, глубины инвазии и характере метастазирования опухоли желудка. Начальный этап развития неоплазии желудка характеризуется определенными изменениями эпителия, а именно очаговой пролиферацией клеток. Данное состояние эпителия характерно для предраковых заболеваний желудка. Пролифераты из молодых мономорфных клеток и пролифераты из молодых клеток с наличием среди них анаплазированных, недифференцированных клеток характерны для факультативного и облигатного предраков соответственно. Исследования диспластических изменений в тканях желудка на ранних стадиях процесса малигнизации и предраковых заболеваний желудка, направлены на поиск маркеров для ранней диагностики заболевания, а также способствуют углублению знаний о процессах малигнизации клеток и канцерогенеза желудка. В ходе исследования клеток тканей аденомы желудка c помощью BAC-платформ было обнаружено, что увеличение числа копий ДНК в 20q13.12-q13.33, 11q23.2, 9q33.1-q34.3 районах, трисомия по хромосоме 20, а также потеря числа копий ДНК в 6q10-q22.1, 6p21.1-q16.3, 13q21.2-21.33, 5q22.1-q23.2 и моносомия по хромосоме 10 являются основными хромосомными нарушениями в клетках тканей предраковых заболеваний желудка [8]. Были проведены работы по сравнению хромосомных нарушений в тканях ранних и поздних стадий рака желудка. Увеличение числа копий 8q23-24.1 региона и уменьшение числа копий в 17р плече были общими в двух группах сравниваемых группах опухолей, тогда как амплификации 8p22-23, 1q25-31 были характерны для опухолей ранних стадий. Для неоплазий поздних стадий развития был типичен более широкий спектр хромосомных нарушений, в который входили увеличение числа копий в 7р, 11q, 2q и 15q26, уменьшение числа копий в 17q, 21q, 3p и 18q [29]. Array-CGH используется и в экспериментах на клеточных линиях. Исследование 31 клеточной линии рака желудка с использованием 800 BAC клонов, содержащих последовательности генов, потенциально играющих важную роль в канцерогенезе желудка, показало увеличение числа копий в 8q24.21, 20q13.13, 20q13.2, 20q11.21, 20q11.23, Xq28, 11q13.4, 7q21.2 и уменьшение числа копий ДНК в 9q21.3, 9q24.1, 18q21.1, 18q21.2, 18q23 районах. В данной работе была обнаружена амплификация гена CDK6, локализованного в 7q21.2 регионе. Нарушения в работе данного гена при раке желудка ранее никогда не были детектированы. Ядерная экспрессия CDK6 характерна для ранних стадий рака желудка, что может оказаться диагностическим фактором при раке желудка [34]. Благодаря высокой специфичности, чувствительности и быстроте обработки данных, array-CGH позволяет оптимизировать и ускорить процесс диагностики рака, что важно для клинической практики. Использование ДНК-клонов позволяет практически неограниченно расширить исследования специфических генов, связанных с канцерогенезом рака желудка. С появлением данной методики стало возможным намного более детальное исследование генома опухолевых клеток. Накопление и систематизация знаний о хромосомных нарушениях в опухолевых клетках рака желудка позволят выбирать наиболее адекватные и действенные методы терапии опухолей, диагностировать малигнизацию клеток на ранних стадиях процесса, еще до проявления клинических признаков. Развитие и прогрессия рака желудка происходит вследствие аккумуляции хромосомных, генетических и эпигенетических аберраций. С развитием новых молекулярно-генетических технологий нарушения хромосомного материала, генная дерегуляция и другие цитогенетические изменения могут быть детально исследованы в тканях рака желудка. Молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе канцерогенеза желудка, включают активацию онкогенов, снижение регуляции опухолесупрессорных генов, нарушения функционирования генов-регуляторов клеточного цикла, молекул клеточной адгезии и генов репарации ДНК. Однако именно хромосомные аберрации являются одной из основных характеристик рака желудка. Таким образом, потеря или амплификация хромосомного материала является одним их механизмов развития рака желудка, поскольку следствиями данных нарушений могут быть изменения в дозе генов, являющихся критичными для канцерогенеза данного органа. Изменение в экспрессии генов, приводит к аномальным событиям в клетке и нарушает ее нормальнее функционирование. Хромосомные нарушения и, как следствие, аномальная работа генов, участвующих в развитии рака желудка связаны с различными клиникоморфологическими параметрами опухоли и идентификация подобных генов имеет важное значение в диагностике, прогнозе заболевания и терапии. Процесс канцерогенеза характеризуется аккумуляцией определенных хромосомных нарушений в малигнизированных клетках. Развитие опухоли характеризуется накоплением хромосомных аберраций, которые определяют такие свойства неоплазии как агрессивный рост, неопластический ангиогенез, метастазирование и устойчивость к защитным системам организма. Предраковые заболевания желудка являются первой начальной стадией развития опухолевого процесса. Таким образом, получение общей картины нарушений хромосомного материала в клетках данных патологических состояний с диспластическими изменениями будет способствовать накоплению новых знаний о канцерогенных процессах на ранних стадиях развития неоплазии желудка до клинических проявлений опухоли. Кроме того, сравнение уровня и спектра хромосомных аберраций в клетках предраковых заболеваний желудка и зрелых опухолей, возможно, откроет механизмы клонального отбора диспластических клеток с определенным генетическим портретом, обеспечивающим быстрый рост и развитие опухоли, что определит выбор необходимой предопухолевой терапии для своевременного воздействия на морфологически измененные ткани эпителия желудка. Решение этих вопросов является актуальным направлением исследований в области изучения цитогенетики как злокачественных новообразований в целом, так и рака желудка в частности. 2. ВЫБОР ОБОСНОВАННОГО ВАРИАНТА НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ В связи с вышеприведенными фактами анализа научно-практической литературы представляется актуальным вариант научно-исследовательской работы по проблеме канцерогенеза желудка, касающийся полногеномного профилирования хромосомных нарушений в тканях эпителия желудка на ранних стадиях трансформации и в клетках тканей предраковых заболеваний данного органа. Как уже было описано выше, предрак является начальным изменением эпителия желудка и определение спектра и структуры хромосомных аберраций на данном этапе онкогенной трансформации позволит более глубоко понять механизмы канцерогенеза желудка. Выбор для исследования биопсийного и операционного материала позволит анализировать ДНК, выделенную непосредственно из диспластических тканей. Данный подход обеспечит детекцию хромосомных нарушений, непосредственно в тканях с предраковыми заболеваниями желудка и позволит избежать ложноположительных результатов, как это возможно в случае работы с клеточными линиями. Формирование выборок на данном этапе работы, а также составление базы данных пациентов с гистологически подтвержденным диагнозом, позволяет структурировать материал и обеспечить чистоту эксперимента и исследовать образцы с уже известным исходом заболевания. Метод фенольной экстракции, выбранный для выделения ДНК на первом этапе научно-исследовательской работы, является стандартной методикой, позволяющей получить достаточное количество необходимого материала высокой степени чистоты, что является критичным для проведения дальнейших исследований. С помощью методики ник-трансляции на основе выделенной ДНК из предраковых тканей и ДНК из крови здорового индивида (контрольная ДНК) будут получены будут синтезированы полногеномные зонды, меченные различными флуорохромами. Данные зонды необходимы для проведения дальнейшей сравнительной геномной гибридизации и получения полногеномных профилей тканей с предраковыми изменениями желудка. В ходе дальнейшего выполнения работы с помощью современной молекулярно-цитогенетической методики CGH будут определены профили хромосомных нарушений в диспластических тканях желудка. CGH обеспечивает детальной исследование всех структурных и числовых нарушений хромосомного материала в одном эксперименте, полностью исключая этап приготовления препаратов метафазных хромосом из исследуемой ткани. Использование данной методики является широко применяемым подходом во многих молекулярно-генетических лабораториях, является оптимальным подходом для проведения данной работы и полностью соответствуя задачам исследования. 3. ПЛАН ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ТЕОРИТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ На первом этапе проведения научно-исследовательской работы планируется провести аналитический обзор научно-практической литературы по вопросу исследований молекулярно-генетических, клинико-морфологических, эпидемиологических характеристик опухолей и предраковых состояний желудка. Изучить базы данных по хромосомным нарушениям при раке желудка, полученные с помощью CGH и других молекулярно-цитогенетических методик. Кроме того, необходимо провести набор материала и сформировать выборки биопсийного и операционного материала тканей эпителия желудка с предраковыми заболеваниями, ранними стадиями рака желудка, а также сбор анамнеза пациентов и оформление базы данных с гистологически подтвержденным диагнозом, что является критичным при анализе полученных результатов полногеномного профилирования. Также планируется провести выделение ДНК из биопсийного и операционного материала тканей эпителия желудка методом фенольной экстракции, выбранных для выполнения цели работы. После выполнения всех запланированных этапов первого года работы необходимо подготовить отчетную документацию по итогам работы. Второй этап работы начинается с проведения сравнительная геномная гибридизация (CGH) образцов с предраковыми заболеваниями желудка, ранними стадиями малигнизации эпителия желудка. Далее планируется провести анализ полученных профилей с целью получения полногеномных данных о цитогенетических нарушениях в тканях предраковых заболеваний желудка и ранних стадий данной неоплазии. Получение информации о цитогенетических нарушениях в тканях с предраковыми заболеваниями и ранними стадиями рака желудка. Кроме того, данные об уровне и спектре хромосомных аномалий в тканях с предраковыми заболеваниями и ранними стадиями рака желудка являются значимыми при построении генетического портрета предраковых состояний эпителия желудка. Далее планируется подготовка статьи к публикации в журнале, рекомендованном ВАК со ссылкой на проведение НИР в рамках реализации ФЦП. Конечным этапом проведения исследования является резюмирование результатов, полученных в течение всего периода исследования, в виде итогового научно-технического отчета, а также подготовка отчетной документации. 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ И ТЕОРИТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ходе | |||||||||||||
1 2
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... ... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кабардино-Балкарский государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (Ленина)» | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Исполнитель: Учреждение Российской академии наук Институт физики микроструктур ран |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Государственный университет учебно-научно-производственный... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Государственный университет учебно-научно-производственный... |
| 1. Банковский сектор2 Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... |
| Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физики микроструктур Российской академии наук | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физики микроструктур Российской академии наук |
 | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... | | Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... |
