Р
Гистоморфологические исследования
ис. 2 – Алгоритм исследований
Для изучения гормональных, морфологических и биохимических показателей крови были подобраны семь групп коров. В одну (n=6) из которых входили здоровые коровы с нормальным половым циклом, пришедшие после отела в половую охоту, что было установлено визуально по рефлексу неподвижности при проявлении всех феноменов присущих стадии полового возбуждения и наличия фолликула в яичнике (ректально). В остальные шесть групп коров (n=36) были отобраны животные, находящиеся в состоянии анафродизии спустя 45 дней после отела по причине задержавшегося желтого тела яичника, что было подтверждено ректальными исследованиями.
В первой серии опытов было проведено изучение биохимических и морфологических показателей крови коров опытных групп с целью определения характера обменных процессов и степени влияния на них тимогена.
В 1-ю (контрольную) группу (n=6) были подобраны здоровые коровы с нормальным половым циклом, пришедшие после отела в половую охоту, у которых для исследований кровь отбирали из яремной вены – 1-й раз на 1-е, 2-й раз на 10-е и 3-й раз – на 20-е сутки полового цикла.
Во 2-ю (контрольную, n=6) группу отобрали животных, проявляющих признаки анафродизии (не более 60 суток) после отела по причине наличия задержавшегося желтого тела яичника. Исследования в этой группе животных проводили без применения препаратов (интактные животные).
Затем для установления оптимальной кратности введения тимогена были сформированы 3-я, 4-я и 5-я группы (n=6) коров которых подбирали по тем же критериям, что и во 2-ю группу. Коровам вводили 0,01% раствор тимогена внутримышечно в дозе 15 мл/гол/сут в течение 3-х суток в 3-й группе, 6-ти – в 4-й и 9-ти – в 5-й группе.
С целью выявления оптимального сочетания иммуномодулятора тимогена с базисно применяемыми при задержавшемся желтом теле яичника препаратами: сурфагоном и магэстрофаном были сформированы 6-я и 7-я опытные группы по 6 коров в каждой. Так как предварительно было установлено, что наилучшие гематологические показатели имеет 5-я опытная группа животных, которой тимоген вводили в течение 9 суток, исходя из этого, тимоген вводили этим группам в течение 9 суток в аналогичной дозе. После чего на 10–е сутки 6–й группе вводили сурфагон 50 мкг/гол однократно внутримышечно, а 7–й магэстрофан 2 (0,5 мг) мл/гол однократно внутримышечно. Кровь для проведения исследований отбирали так же из яремной вены – 1–й раз до начала исследований, 2–й раз на 10-е сутки и 3–й раз – на 20-е сутки исследований. Причем, кровь в 6-й и 7-й группе отбирали на 10-е сутки до введения соответственно сурфагона и магэстрофана. У всех опытных групп контролировали время прихода в охоту и количество осеменений.
Исследования количественного содержания стероидных гормонов в сыворотке крови опытных коров, вырабатываемых в яичнике: прогестерона, тестостерона, эстрадиола–17β, а также кортизола, проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (Головаченко В.А., Полыцев Д.Г., 2000). Определение общего белка проводили в соответствии с методикой, основанной на взаимодействии белков с ионами меди в щелочной среде (окраска синего цвета) (Титов В.Н., Творогова Т.Г., 1995; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987). Определение альбуминов, α, β, γ–глобулинов в сыворотке крови проводили с помощью метода учета протекания электрофореза на бумаге (Kohn J., 1975; Сентебова Н.А., Медведьева Л.А., Александровская Т.Н., 1978). Концентрацию глюкозы в сыворотки крови определяли энзиматическим колориметрическим методом без депротеинизации (Trinder P., 1969; Городецкий В.К., Селиванив И.А., 1969; Лабораторное дело, 1976; Кондрахин И.П., 2004). Триацилглицерины определяли энзиматическим колориметрическим методом с помощью катализирования липазной реакции гидролиза триацилглицерина с образованием жирных кислот и эквимолярного количества глицерина (Trinder P., 1969; Кондрахин И.П., 2004). Для определения концентрации холестерола использовали энзиматический колориметрический метод гидролиза эфиров холестерола холестеринэстеразой (Zlatkis A., Zak B., Boyle A.I., 1958; Trinder P.,1969; Кондрахин И.П., 2004). Определение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) проводили с помощью унифицированного метода Райтмана-Френкеля. (Вилкинсон Д., 1981; Reitman S., Frankel S.,1957; Лабораторные методы исследования в клинике, 1987). Для определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) использовали унифицированный метод (Bessey O.A.,1940). Лизоцимную активность сыворотки крови (ЛАСК) определяли с помощью фотоэлектроколометрического метода в модификации отдела зоогигиены УНИИЭВ (1979) с применением суточной культуры Micrococcus lysodeiticus, содержащей 500 млн. микробных тел в 1 мл (Храбустовский И.Ф., и др. 1974). Бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) определяли фотонефелометрическим методом так же по методике отдела зоогигиены УНИИЭВ (1979) с использованием суточной агаровой культуры E. Coli, содержащей в 1 мл 2 млрд. микробных тел (Чумаченко В.Е., 1990). Определение фагоцитарной активности нейтрофилов сыворотки крови (ФАНСК) осуществляли по методу, основанному на учете числа бактерий, захваченных нейтрофилами в процессе их совместного инкубирования в термостате (Чумаченко В.Е., 1990). Содержание гемоглобина в крови определяли с помощью гемиглобинцианидного метода (метод Drabkin) (Смирнов И.В., Контуганов Н.Н., Майорова В.В., 2000). Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) осуществляли с помощью унифицированного микрометода Панченкова (Коблов Л.Ф., 1979). Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов проводили в счетной камере Горяева (Кондрахин И.П., 2004). Дифференциальный подсчет лейкоцитов (лейкограмму) проводили согласно общепринятой методике (Бажибина В.Я., 1974).
Полученный цифровой материал был статистически обработан (Лакин Г.Ф., 1990). Результаты рассматривались как достоверные, начиная со значения р<0,05.
Вторая серия опытов включала проведение исследований по изучению гистоструктурных изменений в половых и вторичных иммунокомпетентных органах подопытных коров. Для исследования гистопрепаратов органов были подобраны две группы животных по 3 коровы в каждой с задержавшимся желтым телом яичника. Первой группе (n=3) животных вводили тимоген в дозе 15 мл/гол/сут. 0,01% р-ра внутримышечно в течение 9-ти суток. Второй группе (n=3) животных препарат не вводили (контрольная). В первой группе по окончанию курса введения препарата (на 12-й день), а во второй спустя 12 дней после начала исследований производили забой и отбор органов (яичники, матка, лимфоузел, селезенка, печень) для приготовления гистопрепаратов. Окрашивание гистосрезов согласно методам классической гистотехники проводили гематоксилин-эозином (Гудков Д.Д., 2001). Микроскопическое исследование и фотодокументирование полученных материалов проводили на микроскопе ЛОМО и микрофотонасадке ФН-11.
Третью серию опытов проводили с целью определения эффективности применения иммуномодулятора тимогена в качестве средства коррекции половой цикличности у коров с задержавшимся желтым телом яичника. Были подобраны 5 групп коров. Животным 1-й (n=32) группы вводили внутримышечно 0,01% раствор тимогена в дозе 15 мл/гол/сут. в течение 9 суток; 2-й (n=26) группе вводили сурфагон 50 мкг/гол однократно, внутримышечно, 3-й (n=26) группе – магэстрофан 2 мл/гол однократно, внутримышечно. А в 4-й (n=32) и 5-й (n=67) группах коров комплексно применяли тимоген в течение 9 суток в аналогичной с 1-й группой дозе с однократным введением на 10–е сутки 4–й группе сурфагона (50 мкг/гол) и 5–й группе магэстрофана (2 мл/гол).
Учет эффективности применения тимогена контролировали после курса обработки по следующим показателям: времени наступления половой цикличности, количеству осеменений, проценту оплодотворенных животных и индексу осеменения.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Содержание стероидных гормонов в крови коров
Полученные данные изменения уровня стероидных гормонов, формирующих половую цикличность, показали (рис.3, 3а), что у коров 1-й группы при нормальном половом цикле в период наступления половой охоты уровень прогестерона был минимальным (0,46±0,08 нмоль/л). При сравнении с уровнем прогестерона на начало исследований во 2-й группе (наличие активного желтого тела яичника) при анафродизии у коров, где он составил 2,58±1,05 нмоль/л, концентрация гормона была ниже в 5,5 раза. Аналогичная картина повышения уровня в начале исследований по сравнению с количеством прогестерона в 1-й группе отмечена у коров 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й групп соответственно в: 9,2; 5,4; 22,9; 9,2 и 23,9 раза. Повышенный уровень прогестерона приводит к секреторной трансформации пролиферирующего под влиянием эстрогенов эндометрия, блокирует гипоталамо-гипофизарно-яичниковые связи по механизму обратной связи, способствует активизации катаболических и других процессов, блокирующих наступление половой цикличности (антиэстрогенный эффект).
Через 10 суток исследований у коров 1-й группы повышается уровень прогестерона в 17,3 раза от первоначального значения, что соответствует лютеальной фазе полового цикла. В крови интактных коров 2-й группы при анафродизии эта тенденция повышения была выражена в 1,7 раза, а у животных 3-й, 4-й, 5-й, 6-й и 7-й групп после введения тимогена к 10-м суткам отмечено снижение уровня прогестерона соответственно в: 1,6; 3,5; 1,6; 1,8; и 4 раза. Данные изменения уровня гормона после введения тимогена характеризуют биокорригирующую направленность действия препарата, что проявляется в лизисе клеток желтого тела, вырабатывающего прогестерон и тормозящего наступление половой цикличности.
Концентрация эстрадиола–17β в опытных группах за весь период исследований не имела значимых изменений. Однако у коров 1-й группы прослеживаются три периода изменения концентрации эстрогенов: 1-й период – во время половой охоты, 2-й – в середине цикла и 3-й – к концу цикла при наступлении следующей половой охоты (Сысоев А.А., 1978). Эти данные согласуются с результатами исследований других авторов (Henricks D.M., 1972; Mason B.D. et al., 1972). В группах № 3-7 коров, где вводили тимоген, отмечена аналогичная тенденция уменьшения к 10-м суткам уровня эстрадиола–17β.
Полученные результаты изменения концентрации кортизола в сыворотке крови коров опытных групп показали, что при нормальном половом цикле в 1-й группе идет нарастание уровня гормона. У коров 2-й группы с активным желтым телом повышение колебаний кортизола в течение 20-и дней исследований крайне незначительно. У животных 3-й и 4-й групп, где вводили тимоген соответственно в течение 3-х и 6-и дней, так же отмечена тенденция повышения кортизола к 20-м суткам. Иную картину изменения гормона наблюдали в 5-й, 6-й и 7-й группах, где концентрация кортизола в сыворотке крови наоборот снизилась к 10-му и последующим дням (очевидно, вследствие введения тимогена в течение 9-и дней). Снижение кортизола указывает на уменьшение ответной реакции организма на стресс и увеличение выработки АКТГ по принципу обратной связи. Кроме того, достоверное снижение к 10-м суткам кортизола у коров 6-й группы и тенденция его снижения у животных 7-й группы указывают на повышение активности гиалуронидазы, являющейся активным соединением синтеза гиалуроновой кислоты и в последующем простагландинов (Зайцев С.Ю. с соавт., 2005).
Уровень тестостерона в крови коров 1-й группы имел тенденцию незначительного повышения к 10-м суткам (на 21,7%) и достоверно увеличился в 1,6 раза к 20-м суткам исследований. Аналогичная картина изменений отмечена у коров 5-й группы, где к 10-м суткам повышение тестостерона было в 4,7 раза. Учитывая это, возможно предполагать, что фермент ароматаза, содержащийся в печени, жировой ткани и клетках гранулезы яичников, превращает некоторое количество тестостерона в эстрадиол и тем самым способствует запуску половой цикличности (Gortner R., 2001; Snyder P.J., 2001; Nieschlag E., 2005).
Рис. 3 – Содержание гормонов в крови коров за период исследований
Рис. 3 а – Содержание гормонов в крови коров на 20-е сутки исследований
3.2. Содержание глюкозы и белковых компонентов в крови коров
Содержание глюкозы в крови коров опытных групп соответствовало физиологическим значениям и имело малозначимые изменения за период исследований. Отмечена тенденция незначительного снижения количества глюкозы к 10-м суткам исследований у коров 3, 4 и 5-й групп.
У животных 1-й (контрольной) группы к 20-м суткам исследований наблюдали тенденцию снижения количества общего белка в крови на 5,1%. Во 2-й группе коров его содержание мало изменилось. А вот в 3-й, 4-й, 6-й и 7-й группах отмечено незначительное повышение его уровня от пониженного в начале исследований до пределов физиологической нормы на 20-е сутки, что характеризует биокорригирующий характер действия тимогена.
Среди изменений в белковых фракциях на 10 – 20-е сутки следует выделить повышение альбуминов, α – и β – глобулинов у коров 4-й группы. Отмеченные изменения согласуются с ранее проведенными исследованиями других авторов, где установлен наиболее оптимальный курс применения тимогена с целью вызывания иммуномодулирующего эффекта – 7 дней. Повышение уровня альбуминов от изначального на 7,0%, очевидно, связано с активизацией его синтеза в печени под действием пептидов тимогена.
3.3. Содержание липидных компонентов в крови коров
Концентрация липидных компонентов в крови коров 1-й группы на 1-е сутки исследований была следующей: триацилглицеринов – 0,46±0,05 ммоль/л и холестерола – 1,55±0,15 ммоль/л. Через 10 суток концентрация изучаемых показателей практически не изменилась и составила: триацилглицеринов – 0,47±0,06 ммоль/л; холестерола – 1,55±0,20 ммоль/л. По окончанию периода наблюдений к 20-м суткам был отмечен подъем уровня липидов в крови коров: триацилглицеринов на 12,8% – 0,53±0,07 ммоль/л, а холестерола на 5,2% – 1,63±0,16 ммоль/л.
Схожее содержание липидов отмечено и у коров других групп. Однако, в отличие от 1-й и 2-й группы, в остальных группах наметилась тенденция снижения уровня триацилглицеринов к концу исследований. Хотя эти изменения были незначительными и находились в пределах физиологических значений, возможно полагать, что происходит усиление обменных процессов под действием пептидов тимогена.
3.4. Ферментативная активность крови коров.
Результаты активности ферментов в крови коров опытных групп показали, что наиболее значимыми следует считать снижение АсАТ к 10-м суткам в 3-й группе коров (в 2 раза) и повышение к этому времени АсАТ у коров 6-й группы (на 25,5%). Тенденция незначительного повышения АсАТ отмечена уже у 4-й и последующих групп. Курс введения тимогена в течение 3-х суток показал наиболее сильное влияние препарата на скорость выведения ферментов. Таким образом, снижение активности АсАТ у коров 3-й группы отражает биокоррегирующее влияние тимогена. Отмеченная тенденция снижения активности ЩФ после введения тимогена в 3 – 7-й группах так же свидетельствует о нормализации обменных процессов и функции печени в организме животных.
3.5. Лейкоцитарная формула крови коров
Содержание отдельных видов лейкоцитов в крови коров показало, что в основном эти значения были в пределах физиологической нормы. У коров 1-й группы отмечено снижение к 10-м суткам уровня лимфоцитов на 22,0%, такое снижение было кратковременным, и к 20-м суткам уровень лимфоцитов вернулся к исходным показателям. Снижение количества лимфоцитов возможно вследствие смены физиологического состояния животных в лютеальную фазу полового цикла.
3.6. Показатели естественной резистентности
Изучение гуморальных факторов неспецифического иммунитета показало (рис. 4), что наиболее выраженными были изменения у коров 3-й – 7-й групп. В 3-й группе, где вводили один тимоген (3 дня), превышение к 10 – 20-м суткам исследований от первоначального уровня по бактерицидной активности составило в 2,4 раза. В 4-й группе, где вводили тимоген в течение 6-и дней, отмечено уже повышение бактерицидной (на 45,6%) активности крови и фагоцитарной активности нейтрофилов на 13,1% от исходного состояния. В 5-й группе тимоген вводили 9 дней, активизация факторов неспецифического иммунитета отмечена по бактерицидной (повышение на 66,8%), фагоцитарной (повышение на 15,9%) и лизоцимной (повышение на 50,8%) активностям. Подобная динамика изменений ответной иммунной реакции организма сохранилась к 10-м – 20-м суткам у коров 6-й и 7-й групп.
|
