Влияние микрогравитации на межклеточное взаимодействие иммунокомпетентных клеток человека с клетками-мишенями (К-562) in vitro
Скачать 475.22 Kb.
|
На правах рукописи Григорьева Ольга Владимировна Влияние микрогравитации на межклеточное взаимодействие иммунокомпетентных клеток человека с клетками-мишенями (К-562) in vitro 14.00.32 – авиационная, космическая и морская медицина А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2007 Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Ларина Ирина Михайловна, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Воложин Александр Ильич Ведущая организация: Российский государственный научно-исследовательский центр подготовки космонавтов им. Ю.А.Гагарина Защита диссертации состоится « 9 » ноября 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета K 002.111.01 в Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ – ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76-а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН Автореферат разослан « 8 » октября 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.П. Пономарева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В результате проведенных многолетних исследований на космических кораблях и орбитальных станциях было установлено, что космические полеты оказывают существенное влияние на функциональное состояние всех систем организма человека [Газенко О.Г., 1984; Григорьев А.И., 2001; Moore D., Bie P. et al., 1996]. В том числе, в этих условиях и система иммунитета подвергается воздействию факторов, негативно сказывающихся на резистентности организма человека к различным инфекционным агентам [Константинова И.В., 1988; Мешков Д.О., 2001; Konstantinova I.V., Fuchs B.B., 1991; Sonnenfeld G., Shearer W.T., 2002]. Исследование иммунной системы космонавтов после завершения полетов различной продолжительности выявило ряд изменений функциональных свойств и количества иммунокомпетентных клеток. Так воздействие микрогравитации проявлялось качественными и количественными сдвигами в популяциях клеток белой крови, включая нейтрофилию, эозинопению и лимфоцитопению [Taylor G.R., Dardano J.R., 1983; Cogoli A., Tschopp P., 1985; Kaur I., Simons E.R. et al., 2004; Stowe R.P., Sams C.F. et al., 1999]. Наиболее существенным изменениям в условиях космического полета подвергается клеточный иммунитет человека, ответственность за который несут Т-лимфоциты. Исследования, проведенные после длительных космических полетов, позволили выявить ряд закономерностей в изменениях Т-системы иммунитета [Константинова И.В., 1988; Kimzey S.L., 1977; Konstantinova I.V., Sonnenfeld G. et al., 1991]. Воздействие факторов космического полета приводит к снижению функциональной активности (ФГА-реактивности) Т-лимфоцитов. У части космонавтов отмечали также снижение количества этих клеток в периферической крови [Константинова И.В., 1972; Leach С.L., Rambaut P.C., 1974; Kimzey S.L., 1977; Taylor G.R., 1993]. Эксперименты in vitro подтвердили, что микрогравитация может сама по себе изменять функциональный статус Т-клеток, нарушая проведение сигнала и ремоделируя цитоскелет [Lewis M.L., Reynolds J.L. et al., 1991; Cogoli A., Bechler B., 1993]. Снижение цитотоксической активности лимфоцитов – естественных киллеров было показано многими исследователями как после длительных космических полетов, так и после кратковременных экспедиций [Vorobyov Ye.I., Gazenko O.G. et al., 1983; Konstantinova I.V., Sonnenfeld G. et al., 1991; Konstantinova I.V., Rykova M.P. et al., 1993; Mehta S. K., Kaur I. et al., 2001]. Отмечена высокая степень вариабельности данного показателя у различных космонавтов (астронавтов), однако тенденция к снижению была явно выражена после завершения космического полета. Анализ системы естественных киллеров позволил установить, что в результате воздействия факторов космического полета угнетаются такие функции, как способность распознавать и образовывать конъюгаты с клетками-мишенями, способность к повторным взаимодействиям с чужеродными клетками, а также интегральная цитотоксическая активность популяции естественных киллеров [Константинова И.В., 1988; Мешков Д.О., 1989; Лесняк А.Т., Рыкова М.П. и др., 1998]. Такие изменения могут явиться пусковым фактором не только для развития злокачественных новообразований, но и заболеваний инфекционной, в первую очередь, вирусной природы у космонавтов, как во время космического полета, так и после его завершения, поскольку лимфоциты – естественные киллеры (ЕК) являются первой линией обороны против инфекционных агентов и трансформированных клеток [Herberman R.B., Ortaldo J.R., 1981]. Основу механизма взаимодействия лимфоцитов – естественных киллеров с клетками-мишенями, согласно современным представлениям, составляет распознавание "потерявших себя клеток", под которыми подразумеваются клеточные мишени с нарушениями структуры или экспрессии классических и неклассических молекул главного комплекса гистосовместимости I класса (МНС-1) [Ljunggren H.G., Karre K., 1990; Trinchieri G., 1994; Yokoyama W.M., 2002]. Было установлено, что названные молекулы вступают во взаимодействие с особыми рецепторами, присутствующими на мембране ЕК и определяющими как подавление, так и активацию эффекторных функций этих клеток [Warren H.S., Campbell A.J. et al., 2001; Ying H.Y., Shen X. et al., 2000]. В результате возникает баланс активирующих и ингибирующих сигналов, следствием которого является функциональное состояние ЕК в каждый конкретный момент. Однако, несмотря на интенсивно проводимые исследования системы естественной цитотоксичности, многие механизмы ее иммунорягуляторных и цитотоксических эффектов остаются во многом неясными. Исследование влияния микрогравитации на лимфоциты – естественные киллеры in vitro позволяет приблизиться к более глубокому пониманию процессов взаимодействия этих иммунокомпетентных клеток с клетками-мишенями и выяснению механизмов изменений в системе иммунитета, регистрируемых после космического полета. Цель работы: исследование влияния микрогравитации и ее моделирования на межклеточное взаимодействие лимфоцитов человека и клеток-мишеней in vitro. Основные задачи исследования:
Научная новизна работы Впервые проведено изучение цитотоксической активности изолированных лимфоцитов – естественных киллеров периферической крови человека in vitro в условиях космического полета на борту Международной космической станции. Показано, что микрогравитация не подавляет межклеточные взаимодействия лимфоцитов и клеток-мишеней, в качестве которых использовалась суспензионная линия человеческих эритролейкемических лимфобластоидных клеток К-562. Полученные результаты анализа синтеза цитокинов изолированными иммунокомпетентными клетками, экспонированными в условиях микрогравитации, при совместном культивировании с клетками-мишенями показали, что условия микрогравитации оказывают разнонаправленное действие на изменение уровня цитокинов (TNF-α, IL-1α, IL-2, IL-4, IL-6) у различных доноров. Практическая и научная значимость работы Проведенные исследования позволили разработать новый подход к исследованию роли регуляторных стимулов в функционировании иммунокомпетентных клеток in vitro в условиях микрогравитации. Результаты работы дополняют теоретические представления о влиянии условий микрогравитации на межклеточные взаимодействия лимфоцитов-естественных киллеров и клеток мишеней линии К-562. Полученные данные могут иметь и определенное практическое значение, так как позволят обосновать методологические подходы к исследованию состояния противовирусного иммунитета космонавтов непосредственно во время космического полета, что является основанием для разработки средств медицинского контроля на различных этапах длительных экспедиций. Основные положения, выносимые на защиту:
Апробация работы и публикации Основные результаты и положения работы были доложены и опубликованы в материалах III и IV Конференции молодых ученых, специалистов, аспирантов и студентов, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005); 13-ой конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006); International Society of Gravitational Physiology (ISGP) Joint Life Science Conference (Германия, Кельн, 2005). По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» (протокол №9 от 7 сентября 2007 г.) Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 140 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов и выводов. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 138 литературных источников, в том числе 89 иностранных. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками, 10 фотографиями и 35 таблицами. Связь работы с научными программами Исследования выполнены в рамках Российской федеральной космической программы, при финансовой поддержке Роскосмоса, Российской академии наук и гранта НШ-2225.2003.4 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалом для исследований служили культура лимфоцитов человека, выделенных из периферической крови, и суспензионная культура опухолевых миелобластов человека (К-562). Клетки-мишени К-562 были получены из коллекции Института вирусологии РАМН им. Д.И.Ивановского. В качестве культуральной среды использовали среду RPMI-1640 (Gibco, США) с 5% или 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США) с добавлением 2мМ L-глутамина, 25 мМ HEPES буфера и 1% антибиотика Антимикотика (Sigma, США). Для проведения исследований на борту МКС была разработана и испытана специальная укладка «Фибробласт-1», в состав которой входят шесть комплектов, в которых размещены шприцы с лимфоцитами и клетками-мишенями линии К-562, а также специальные мембранные фильтры (Millipore). Эксперимент «Межклеточное взаимодействие» был выполнен российскими космонавтами в период смены экипажей на МКС-7 – МКС-12 в течение первых и вторых суток после стыковки. Снаряжение укладки «Фибробласт-1» производилось в лаборатории Байконура за 19 часов до старта транспортного корабля «Союз». Для выделения лимфоцитов в асептических условиях проводился забор 50 мл крови из кубитальной вены у здоровых людей, прошедших предварительное обследование на отсутствие в крови специфических антител против HIV1, HIV2, HTLV1, HTLV2, вируса гепатита А, В и С, Treponema pallidum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma homenis, Chlamidia trachomatis, Chlamidia pneumoniae, Chlamidia psittaci и HbsAg. Мононуклеары выделяли на градиенте плотности фиколл-пак (Amersham Biosciences) согласно стандартной методике. Взвесь мононуклеаров помещали в культуральную среду с 5% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки, подсчитывали количество выделенных лимфоцитов в 3% растворе уксусной кислоты (ДиаэМ, Россия) в камере Горяева под световым микроскопом с помощью объектива х20 и доводили концентрацию клеток до 1х106 кл/мл. В день заправки шприцов укладки «Фибробласт-1» предварительно меченные 3Н-уридином и зафиксированные в 0,1% растворе формалина клетки К-562 помещали в культуральную среду в количестве 1х105 кл/мл. В данной концентрации суспензия клеток К-562 была использована в эксперименте и помещалась в шприцы. Шприцы с биологическим материалом размещались на панелях комплектов «Фибробласт-1». Каждый комплект «Фибробласт-1» был помещен в пакет ZIPLOCK. Полностью снаряженная укладка передавалась представителям РКК «Энергия» за 10 часов до старта для доставки на транспортный корабль «СОЮЗ ТМА». В течение 1-2 суток после стыковки транспортного корабля с МКС российские космонавты выполняли ряд последовательных манипуляций эксперимента «Межклеточное взаимодействие» в перчаточном боксе (БиоТехСис, Россия). Инкубация шприцов производилась в течение 24 часов в термостате КРИОГЕМ-03, работающем в режиме 370С. После инкубации клеточную суспензию пропускали из шприцов через фильтры в вакутейнеры (Vacuette). Вакутейнеры с культуральной жидкостью замораживали в морозильнике КРИОГЕМ-03 (-200С). После завершения полета фильтры, помещенные в специальный спускаемый вкладыш «Фильтры», и замороженные пробы с места приземления доставлялись в лабораторию Института. Для оценки цитотоксической активности лимфоцитов – естественных киллеров периферической крови человека фильтры, извлеченные из фильтрующих насадок, помещались в сцинцилляционные флаконы с 5 мл толуолового сцинтиллятора (для приготовления толуолового сцинтиллятора использовались следующие реактивы: ППО (5,0 г), ПОПОП (0,1 г) и 1000 мл толуола (Россия)). Измерение радиоактивности клеток-мишеней, осажденных на фильтры, проводилось в жидкостном сцинтилляционном β-счетчике (Hidex, Финляндия). Индекс цитотоксичности (ИЦ) рассчитывался по следующей формуле: ИЦ= 1 – имп/мин фильтра с клетками К-562 и лимфоцитами х 100 имп/мин фильтра с клетками К-562 Оценка жизнеспособности и изучение экспрессии главных поверхностных маркеров лимфоцитов – CD3, CD4, CD8, CD14, CD16 и CD56 (Immunotech, Франция), производились на цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter). Для определения жизнеспособности использовались Аннексин V и пропидий йодид (Immunotech, Франция). Содержание интерлекинов TNF-α, IL-1α, IL-2, IL-4 и IL-6 в среде культивации после взаимодействия суспензии лимфоцитов и клеток-мишеней измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием наборов “Human TNF-α”, “Human IL-1α”, “Human IL-2”, “Human IL-4” и “Human IL-6” (Biosource, Бельгия) на иммуноферментном анализаторе Bio-Rad PR2100. Клиностатирование осуществляли в СО2 инкубаторе при температуре 37оС на горизонтальном клиностате со скоростью вращения 6 об/мин. Контрольные пробы находились в стационарных условиях, однако применялся дополнительный динамический контроль на шейкере. Время совместной инкубации суспензии лимфоцитов и клеток-мишеней также составляло 24 часа, как и для полетных экспериментов. Статистическую обработку полученных результатов выполняли с помощью программ «Exel» и «Statistica 5.0». Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали, используя непараметрические критерии Фридмана и Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05. Данные представлены в виде средних значений + стандартное отклонение среднего. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Павел Михайлович Влияние моделирования эффектов микрогравитации на... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических... | | Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Межклеточное вещество – вещество, которое находится между оболочками соседних клеток |  | Кружная межведомственная программа «найдем общий язык!» По профилактике... Взаимодействие индивидуума с психологической средой и влияние среды на поведение человека |
| Исследование in vivo Влияние различных доз препарата «ga-40» на накопление... Влияние различных доз препарата «ga-40» на накопление антитело образующих клеток (аок) и массу и клеточностьезенки у мышей 5 | | «Влияние вибрации на организм человека» Теперь мы осознали, что любая деятельность человека оказывает влияние на окружающую среду, а ухудшение состояния биосферы опасно... |
| Реферат По физике На тему: «Влияние электромагнитного излучения на организм человека» Влияние электромагнитных лучей, исходящих от сотовых телефонов, на организм человека | | Вкусовой, обонятельный и кожный анализаторы. Возрастные особенности Вкусовой анализатор представлен рецепторными вкусовыми клетками, которые сосредоточены на вкусовых сосочка языка в виде вкусовых... |
| Темы рефератов Взаимодействие человека и среды обитания. Эволюция... Основные составляющие здорового образа жизни и их влияние на безопасность жизнедеятельности личности | | Исследовательская работа по физике на тему: Звук. Влияние звука на... Целью семинара является обсуждение и проработка лучших мировых практик и современных моделей реализации проектного подхода в инженерном... |
| Первая Области применения и историческое развитие метода Историческая справка Культивирование клеток (эксплантация) метод длительного сохранения в живом состоянии клеток, тканей, небольших органов или их частей,... | | Реферат п о биологии На тему: «наследственные заболевания человека» Организация наследственного аппарата клеток человека (уровни организации: генный, хромосомный, геномный) |
| Биологические науки влияние условий культивирования и фазы роста... Геологическая съемка, поиски и разведка месторождений твердых полезных ископаемых | | Экология и эдоровье человека Колодезников Артем ученик 9 класса Колодезникова Людмила Теперь мы осознали, что любая деятельность человека оказывает влияние на окружающую среду, а ухудшение состояния биосферы опасно... |
| Способ криосохранения клеток морских беспозвоночных Дмсо. Способ позволяет повысить степень сохранности клеток морских беспозвоночных без нарушения их функциональной активности после... | | Конкурс «Азбука здорового человека\ Исследовательский проект по физике... Уровни шумов от различных источников и реакция организма на акустические воздействия |
