1. Исследовать сывороточную концентрацию ММП-2, активность ММП-2,7, концентрацию ТИМП-1, ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз, универсального ингибитора протеаз – α2-макроглобулина у больных ХВГ С в зависимости от активности и стадии заболевания. 2. Оценить активность лизосомных ферментов – хитотриозидазы и β-D-галактозидазы в сыворотке крови пациентов с ХВГ С в зависимости от стадии заболевания.
3. Изучить изменения концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови и ткани печени, сывороточную активность β-D-галактозидазы и активность лизосомных протеаз в печени при развитии фиброза на модели хронического ССl4-гепатита у мышей;
4. Сопоставить изменения протеаз и ингибиторов протеаз, полученные в эксперименте, с изменениями у больных ХВГ С.
5. Оценить влияние ИФН-α на исследованные ферменты и ингибиторы при остром и хроническом токсическом гепатите у мышей.
Научная новизна
Впервые проведено сравнительное изучение сывороточных маркеров развития фиброза у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени в исходе вирусного гепатита С, в результате которого как наиболее информативные выделены ММП-2 и ТИМП-1; выявлено значительное снижение сывороточной активности лизосомного фермента β-D-галактозидазы на разных стадиях ХВГ С, а также увеличение концентрации ингибитора цистеиновых протеаз – цистатина С.
На основании изучения различных классов протеаз и их ингибиторов (металлопротеаз, цистеиновых и сериновых протеаз) установлено, что наибольшим изменениям подвержена ММП-2, тесно связанная с формированием фиброза.
Для больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С характерны нарушения регуляции ММП, сопровождающиеся повышением активности ММП-2,7 и концентрации ММП-2 и ТИМП-1, связанные с нарушением функционирования компонентов внеклеточного матрикса (синтез коллагена и увеличение внеклеточного матрикса) в печени. Отмечено повышение активности α1-протеиназного ингибитора и хитотриозидазы, отражающих процесс воспаления и формирование фиброза.
Клинические исследования, проведенные у больных ХВГ С, подтверждаются данными, полученными в эксперименте. Так, при хроническом токсическом гепатите в сыворотке крови мышей обнаружено снижение активности β-D-галактозидазы и повышение содержания ТИМП-1. Аналогичные изменения отмечены в сыворотке крови пациентов с ХВГ С. Выраженная инактивация β-D-галактозидазы обусловлена прямым действием повреждающих факторов (вируса гепатита С у больных и метаболитов CCl4 у мышей) на клетки печени. Эти изменения свидетельствуют об универсальности механизмов хронического повреждения печени при ХВГ С у больных и в эксперименте. Таким образом, модель хронического токсического гепатита у мышей позволяет изучать механизмы развития хронического повреждения печени и оценивать эффективность препаратов, используемых в лечении вирусных гепатитов у человека.
Практическая значимость
Повышение активности ММП-2,7, соотношения ММП-2:ТИМП-1 и хитотриозидазы, наблюдающиеся в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом С, являются признаками развития фиброза печени и могут быть использованы как неинвазивные маркеры прогрессирования заболевания..
Положения, выносимые на защиту:
1. Среди сывороточных ингибиторов протеаз различных классов (сериновых, цистеиновых, металлопротеаз) для ХВГ С характерно повышение концентрации цистатина С, при отсутствии изменений других ингибиторов (ТИМП-1, α1 -протеиназного ингибитора и α2-макроглобулина).
2. Развитие фиброза характеризуется повышенной активностью ММП-2,7, нарушением соотношения ММП-2:ТИМП-1 в сыворотке крови, повышением активности хитотриозидазы – маркера стимуляции макрофагов, которые можно рассматривать в качестве неинвазивных сывороточных показателей развития фиброза.
3. Развитие хронического токсического ССl4-гепатита у мышей сопровождается повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности цистеиновой протеазы катепсина L в ткани печени и снижением активности β-D-галактозидазы в сыворотке крови. Однократное введение ИФН-α повышает активность цистеиновых - катепсинов B и L и аспартильной протеазы катепсина D, участвующих в деградации компонентов внеклеточного матрикса.
4. Острый токсический ССl4-гепатит у мышей характеризуется повышением сывороточной активности хитотриозидазы.
Внедрение. Основные результаты настоящей работы используются в лекционном курсе для студентов лечебного факультета ГОУ ВПО НГМУ по пропедевтике внутренних болезней.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» - Новосибирск, 2004; V Сибирском физиологическом съезде – Томск, 2005; Х Российской конференции «Гепатология сегодня» – Москва, 2005; I Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока – Новосибирск, 2005; ХII Российской Гастроэнтерологической Неделе – Москва, 2006; VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием – Красноярск, 2006; VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине - Новосибирск, 2006; Falk Symposium 157 «Chronic Hepatitis: Metabolic, Cholestatic, Viral, and Autoimmune», Freiburg, 2006.
Публикации: по материалам диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе 5 статей, 4 публикации в зарубежной печати.
Объем и структура диссертации Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста, содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, обсуждение, выводы, список литературы. Работа иллюстрирована 37 рисунками и 15 таблицами. Список цитируемой литературы включает 46 отечественных и 125 зарубежных источников.
Материалы и методы исследования
Общая характеристика больных. Исследование проведено у 106 больных хроническим вирусным гепатитом С (67 мужчин, средний возраст 36,78 ± 11,62 лет и 39 женщин, 43,26 ± 15,81 лет) и у 27 больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С (13 мужчин, средний возраст 49,69 ± 10,48 лет и 14 женщин 60,50 ± 11,90 лет). Все пациенты обратились за медицинской помощью в МУЗ МКБ № 7 г. Новосибирска по поводу астенического синдрома и/или болей билиарного характера. Ранее заболеваний печени у них диагностировано не было. Диагноз ХВГ С подтвержден на основании определения маркеров методами ИФА и ПЦР-диагностики с определением РНК вируса гепатита С полуколичественным методом с генотипированием. У части больных (25,5%) диагноз подтвержден морфологическим методом при пункционной биопсии печени.
Диагноз цирроза печени в исходе вирусного гепатита С верифицирован с использованием полного клинического обследования больных, лабораторной диагностики и инструментальных методов обследования (фиброгастродуоденоскопия, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и т.д.). У всех пациентов определен прогностический класс А по Чайльд-Пью.
Контрольную группу составили 20 практически здоровых постоянных доноров (11 мужчин 33,45 ± 6,76 лет и 9 женщин 36,78 ± 7,84 лет). У всех пациентов получено письменное информированное согласие для проведения исследования.
Экспериментальные модели. В работе использованы самцы мышей линии СВА, массой 20-25 г (виварий Института фармакологии СО РАМН, г. Томск). В ходе работы проведены 2 серии экспериментов: воспроизведение моделей острого и хронического CCl4-гепатитов. Для воспроизведения модели острого токсического гепатита мышам однократно перорально вводили масляный раствор CCl4 в дозе 50 мг/кг массы тела. Животных декапитировали через 24, 48, 72 ч после затравки CCl4. Для изучения возможного защитного действия α-интерферона животным за 24 ч до затравки CCl4 внутрибрюшинно однократно вводили раствор α-интерферона (ДГУ ПП «Вектор-фарм», Новосибирск) в дозе 10000 МЕ. Модель хронического токсического гепатита воспроизводили посредством перорального введения CCl4. При воспроизведении данной модели масляный раствор CCl4 в дозе 50 мг/кг массы тела животного вводили 2 раза в неделю в течение 4-х недель. α-интерферон вводили внутрибрюшинно в той же дозе, что и при воспроизведении острого токсического гепатита однократно за 24 ч до последней затравки CCl4. Животных декапитировали через 24 ч после последнего введения CCl4.
Морфологическое исследование печени мышей выполнено совместно с к.м.н. Фаламеевой О.В. и д.м.н. Филимоновым П.Н.
Методы определения активности и/или содержания ферментов и ингибиторов протеаз. Активность β-D-галактозидазы в сыворотке крови определяли по методу Barrett, 1972 г. в модификации Sewell et al., 1988г. с использованием флуоресцентного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозида (Melford Laboratories ltd., England); активность хитотриозидазы определяли по методу, предложенному Guo et al. (1995). В качестве субстрата использовали 4-метилумбеллиферил- β-D-N,N',N"-триацетилхитотриозид (C34H47N3O18); активность матриксных металлопротеаз-2,7 (ММП-2,7) определяли по методу Nagase et al. (1994) с использованием субстрата МСА-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 (ICN Biomedicals Inc, USA); активность катепсина В в гомогенате печени мышей определяли с помощью флуоресцентного субстрата Na-CBZ(carbobenzoxy) –Arg-Arg-7-amido-4methylcoumarin hydrochloride («Вектор», Новосибирск) по методу Barrett, Kirschke, 1981; для определения активности катепсина L использовали субстрат Na-CBZ(carbobenzoxy) –Phe-Arg-7-amido-4methylcoumarin hydrochloride («Вектор», Новосибирск) с добавлением в инкубационную смесь селективного ингибитора катепсина В СА-074 (Kirschke Н., Wiederanders B., 1984); Активность катепсина D в гомогенате печени мышей определяли спектрофотометрическим методом Видерандерса и Ольке (Wiederanders B., Oelke B., 1986). В качестве субстрата использовали 2% раствор азоказеина, приготовленный на 6,0 М растворе мочевины, рН=5.0; содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry O., 1951); активность α1 – протеиназного ингибитора и α2 –макроглобулина в сыворотке крови определяли по методу Яровой и соавт., 1982 с использованием субстрата бензоил-аргинин-этиловый эфир гидрохлорид (БАЭЭ); концентрацию ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови определяли с помощью готовых коммерческих наборов ИФА для человека (Ray Biotech, Human MMP-2 ELISA Kit, Human TIMP-1 ELISA Kit, USA) и мышей (Ray Biotech, Mouse TIMP-1 ELISA Kit, USA) (Clark et al., 1991; Plumpton et al., 1995); концентрацию цистатина С в сыворотке крови определяли с помощью готовых коммерческих наборов ИФА для человека (BioVendor, Czech Republic).
Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка проведена с применением пакета программ SPSS 9.0 и включала создание базы данных, автоматизированную проверку качества подготовки информации и статистический анализ (Гланц С., 1998; Реброва О.Ю., 2000; Флетчер Р. И соавт., 1998; Власов В.В., 2001). Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (m), достоверность оценивалась по t-критерию Стьюдента. Рассчитывались доверительные интервалы, позволяющие оценить, в каких пределах может находиться истинное значение параметра. В ряде случаев, ввиду наличия выборок из переменных, не подчиняющихся нормальному распределению, использовались непараметрические методы статистической обработки (U критерий Манна-Уитни). Для определения связи между изучаемыми признаками использовались коэффициенты корреляции Пирсона и Спирмана.
Результаты и обсуждение
Результаты клинических исследований. При обследовании больных ХВГ С обнаружено повышение содержания ММП-2 (U=109,5; р=0,001) и тенденция к повышению содержания ТИМП-1 в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами (рис.1;табл.1). Выявлена прямая корреляционная зависимость концентрации ММП-2 и ТИМП-1 (r=0,345). Эти изменения свидетельствуют о том, что в результате персистенции повреждающего фактора (вируса гепатита С) регенерация паренхимы печени замедляется и гепатоциты замещаются избыточным количеством белков внеклеточного матрикса, включая фибриллярный коллаген. Накопление внеклеточного матрикса является результатом, как повышения синтеза, так и снижения деградации его элементов - ММП, фибронектина, ундулина, коллагенов I, III и IV типов и протеогликанов. Снижение скорости выведения внеклеточного матрикса и ММП является следствием перевысвобождения их специфических ингибиторов – ТИМП.
*
Рисунок 1. Концентрация ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных ХВГ С
Примечание: * - р<0,05
В сыворотке крови больных ХВГ С не отмечено изменений активности ингибитора сериновых протеаз - α1-протеиназного ингибитора и универсального ингибитора протеаз всех четырех классов – α2-макроглобулина, тем не менее, отмечена обратная корреляционная зависимость активности МГ с концентрацией ТИМП-1 (r=-0,717). Таким образом, увеличение концентрации ММП-2 может быть связано с усилением расхода не только эндогенного ингибитора ТИМП-1, но и универсального ингибитора протеаз - МГ, так как известно, что он, наряду со специфическими ингибиторами ММП – ТИМП, является неспецифическим ингибитором ММП.
Показано, что в сыворотке крови больных ХВГ С повышается содержание ингибитора цистеиновых протеаз – цистатина С. Это, вероятно, обусловлено тем, что в протеолитический каскад деградации компонентов внеклеточного матрикса вовлечены протеазы различных классов, в том числе и цистеиновые (катепсины В и L).
Отмечено снижение активности лизосомного фермента β-D-галактозидазы в сыворотке крови больных ХВГ С (табл.2), не зависящее от активности гепатита. Полученные результаты свидетельствуют о прямом цитопатическом воздействии на клетки печени, так как нейраминидаза, входящая в состав вируса, после эндоцитоза вируса клетками печени может разрушает комплекс галактозидаза-нейраминидаза-катепсин А (так называемый стабилизирующий белок).
Изменений активности хитотриозидазы и активности ММП-2,7 в сыворотке крови больных ХВГ С не отмечено (табл.2).
Таблица 1.
Характеристика ММП -2 и ингибиторов протеаз в сыворотке крови больных ХВГ С
Ферменты/
ингибиторы
| Доноры |
ХВГ С
|
N
|
M
|
m
|
N
|
M
|
m
|
ММП-2, пкг/мл
|
15
|
453,0
|
184,0
|
36
|
1308,47**
|
318,59
|
ТИМП-1, пкг/мл
|
13
|
380,38
|
94,64
|
34
|
446,18
|
142,06
|
Цистатин С, нг/мл
|
10
|
1242,0
|
290,2
|
10
|
2969,0*
|
1136,77
|
α1 –ПИ,
ИЕ/мл
|
10
|
21,16
|
1,9
|
10
|
22,8
|
2,72
|
α2 –МГ,
ИЕ/мл
|
9
|
2,82
|
0,41
|
9
|
2,22
|
0,3
| |
