Функциональное состояние Нейтрофильных лейкоцитов периферической крови и асцитической жидкости при раке яичников

На правах рукописи Абакумова Татьяна Владимировна функциональное состояние Нейтрофильных лейкоцитов периферической крови и асцитической жидкости при раке яичников 03.00.13 – физиология 16.00.02 – патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ульяновск-2009 Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Генинг Татьяна Петровна кандидат медицинских наук Антонеева Инна Ивановна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, професcор Напалкова Светлана Михайловна доктор биологических наук, професcор Любин Николай Александрович Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Самарский государственный университет Защита диссертации состоится «20» ноября 2009г. в 14:30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет по адресу: ул. Набережная реки Свияги,106, корпус 1, аудитория 703. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом – на сайте ВУЗа http://www.uni.ulsu.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432000, г. Ульяновск, ул.Л.Толстого,42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований Автореферат разослан «19» октября 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент С. В. Пантелеев Общая характеристика работы Актуальность работы. Результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о связи нейтрофилов с патогенезом злокачественного роста [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Наблюдаемые в процессе опухолевого роста изменения со стороны гранулоцитарного звена лейкоцитов периферической крови можно с равной степенью вероятности рассматривать как результат системного действия опухоли на организм, так и в качестве компонента самого процесса необластомогенеза. Наблюдаемые сдвиги могут быть также интерпретированы и как результат мобилизации механизмов противоопухолевой резистентности [Шаталин Ю.В., 2008]. По современным данным нейтрофильные лейкоциты, подвергаясь каскадным влияниям различных цитокинов, способны изменять свой количественный и субпопуляционный состав, перестраивать свою функциональную активность, секретировать многочисленные ферменты, медиаторы (в том числе и цитокины), активные формы кислорода, чтобы в конечном итоге реализовать свой физиологический потенциал – фагоцитоз и киллинг, уничтожая вирусы, бактерии, аллергены, неопластические клетки [Антонеева И.И., 2007; Нестерова И.В., Колесникова Н.В., 1999; Romani L. et al., 1997; Segal A.W., 2005]. Нейтрофилы, мигрируя в очаг развития опухоли, оказывают цитолитическое и цитотоксическое действие [Блиндарь В.Н., Зубрихина Г.Н., 2002; Swann J.B., 2007]. По данным литературы [Поцелуева М.М. с соавт., 2005], при прогрессировании неоплазмы наблюдается одновременное увеличение количества активированных нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови. При этом роль микрофагов в прогрессировании неоплазмы остается неизвестной, так как выбрасываемые нейтрофильными гранулоцитами во внеклеточную среду – плазму крови и асцит [Baskic D., 2003, Kondera-Anasz Z. et al 2004], активные формы кислорода и лизосомальные ферменты оказывают повреждающее действие не только на опухолевые клетки, но и участвуют в мутагенезе, повреждая белки, нуклеиновые кислоты нормальных клеток организма, способствуя при этом пролиферации опухолевых клеток [Шаталин Ю.В., 2008; De Larco J.E. et al., 2004; Sapone А. et al., 2003; Zhang Q. et al., 1998]. В связи с вышеизложенным представляется актуальным исследование функционального состояния нейтрофилов асцитической жидкости (в зоне контакта эффекторных клеток и опухолевых клеток), а также периферической крови на поздних стадиях прогрессирования рака яичников. Цель исследования. Оценить функциональное состояние нейтрофильных лейкоцитов периферической крови и асцитической жидкости при раке яичников. Основные задачи исследования: Изучить динамику показателей кислородзависимого и анаэробного метаболизма нейтрофилов асцитической жидкости и периферической крови крыс в процессе роста асцитной опухоли яичников. Оценить фагоцитарную активность, кислородзависимый и анаэробный метаболизм нейтрофильных гранулоцитов асцитической жидкости и периферической крови женщин на поздних стадиях развития рака яичников. Оценить рецепторный статус нейтрофильный гранулоцитов асцитической жидкости и периферической крови при раке яичников. Определить уровень провоспалительных цитокинов асцитической жидкости и периферической крови женщин при раке яичников. Научная новизна. Впервые получены данные об изменении функционального состояния нейтрофилов асцитической жидкости и периферической крови женщин при раке яичников, а также о количестве и состоянии микрофагов асцитической жидкости и периферической крови крыс на разных стадиях опухолевого роста. Изучен рецепторный статус микрофагов асцитической жидкости при раке яичников. Также, впервые, оценен уровень цитокинов (IL-1β, TNF-α, IFN-γ) в асцитической жидкости и периферической крови женщин на поздних стадиях развития рака яичников и женщин-доноров. Установлены корреляционные связи уровня кислородзависимого и анаэробного метаболизма, а также фагоцитарной активности со стадией опухолевого процесса на модели прогрессирования асцитной опухоли яичников у крыс. Научно-практическая значимость. Данные, полученные в результате оценки функционального состояния нейтрофильных лейкоцитов, их рецепторного статуса и уровня цитокинов в периферической крови и асцитической жидкости на поздних этапах прогрессирования неоплазмы, могут быть использованы в патофизиологии, теоретической и практической онкогинекологии при разработке схем диагностики и терапии прогрессирующего рака яичников. Положения, выносимые на защиту: Функциональное состояние нейтрофилов периферической крови крыс зависит от стадии роста экспериментальной опухоли. При её прогрессировании в нейтрофилах снижается фагоцитарная активность нейтрофилов. При этом в асцитической жидкости снижается доля активных нейтрофилов, но усиливается в последних миелопероксидазный кислородзависимый метаболизм и уровень кислой фосфатазы. На поздних стадиях развития рака яичников у женщин в периферической крови увеличивается абсолютное количество нейтрофилов, способных продуцировать активные формы кислорода, но с низкой активностью ферментов микробицидных систем. В асцитической жидкости при переходе от III к IV клинической стадии снижается количество микрофагов, но увеличивается их АФК-генерирующая способность. Прогрессирование рака яичников сопровождается снижением в периферической крови количества CD15+, CD11a+ нейтрофилов при раке яичников, способных к адгезии, а также CD95+ нейтрофилов, готовых к апоптозу. В асцитической жидкости увеличивается количество нейтрофилов, экспрессирующих CD11a, и снижается CD11b+ нейтрофилов. Терминальные стадии рака яичников характеризуются разнонаправленным изменением уровня провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-) в периферической крови и асцитической жидкости в клинике. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на VI съезде физиологов Казахстана с международным участием (Караганда, 2007), VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы физиологии, физического воспитания и спорта» (Ульяновск, 2008), II Международной научной конференции молодых ученых-медиков и I Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы экологической физиологии» (Алматы, 2008), IX Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2008), II Съезде физиологов СНГ (Кишинев, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), I Всероссийской молодежной научной конференции «Молодежь и наука на Севере» (Сыктывкар, 2008), VIII Молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2009), III Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2009). Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 6 – в изданиях, рекомендованных ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 41 рисунок и 8 таблиц. Список литературы включает 242 источника, из которых 136 иностранных авторов. Материал и методы исследования Объектом исследования явились нейтрофилы (Нф) периферической крови и асцитической жидкости женщин в возрасте 31-79 лет при раке яичников III-IV клинической стадии по FIGO. Контрольную группу составляли практически здоровые женщины (30-60 лет). Группу активного контроля для определения цитокинов в асцитической жидкости составили пациенты с нераковым асцитом. Экспериментальная модель асцитной опухоли яичников (АОЯ) (банк штаммов РОНЦ им Н.Н.Блохина (г.Москва), была воспроизведена на беспородных половозрелых самках крыс в возрасте 3 мес. массой 150 гр, путем перевивки асцита со средой 199 (1:1). Периферическая кровь и асцитическая жидкости отбирались под эфирным наркозом на 5-е (логарифмическая стадия) и 14-е сутки (терминальная стадия) после перевивки АОЯ. Из периферической крови с гепарином (20ЕД/мл) [Кондратьева И.А., Самуилова В.Д., 2001] и осадка асцитической жидкости были изготовлены на предварительно обезжиренных стеклах мазки по стандартной методике [Бакшеев Н.С., 1977]. Цитохимические методы исследования. Проводили цитохимическое определение активности миелопероксидазы (МПО) с бензидином [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Определяли долю активных нейтрофилов (ДАН), продуцирующие активные формы кислорода в спонтанном варианте НСТ-теста [Карпищенко А.И., 1999; Земсков В.М., 1988]. Активность катионных белков (КБ) Нф проводили по методу М.Г.Шубича (1974) с бромфеноловым синим [Шубич М.Г., 1974]. Для цитохимического выявления кислой фосфатазы (КФ) применяли метод азосочетания по методу Burstone и Li с соавт. (1970) [Карпищенко А.И., 1999; Шубич М.Г., Нестерова И.В., 1980]. Для цитохимического определения активности ЩФ использовали метод азосочетания по Rutenburg с соавт. (1965) [Шубич М.Г., Нагоев Б.С., 1980]. В каждом мазке подсчитывали 100 или 50 Нф, среди которых определяли процент клеток, содержащих отложения соответствующего фермента и подсчитывали средний цитохимический коэффициент (СЦК) [Рудик Д.В., Тихомирова Е.И., 2006]. Для определения фагоцитарной активности применяли стандартную методику с использованием дрожжей [Хейхоу Ф.Г.Дж., Квалигино Д., 1983]. Вычисляли следующие показатели фагоцитоза: фагоцитарное число (ФЧ) по Райту – среднее число захваченных одним фагоцитом частиц, и фагоцитарный индекс (ФИ) по Гамбургеру – процент фагоцитов, принимающих участие в фагоцитозе к общему числу фагоцитов [Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991]. Иммунологические методы. Иммунофлуоресцентный метод основан на использовании моноклональных антител (МКА), конъюгированных с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ). На клеточной поверхности Нф имеются специфические антигенные детерминанты (дифференцировочные и активационные антигены), позволяющие выявить субпопуляцию этих клеток периферической крови и асцитической жидкости женщин с использованием МКА производства ООО «Сорбент» (г.Москва): СD11a, CD11b, CD15, CD95, меченых ФИТЦ. Регистрацию результатов производили визуально под флуоресцентным микроскопом (х700) с иммерсией. Определение содержания цитокинов (IL-1β ,TNF-, IFN-) в сыворотке и асцитической жидкости проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с коммерческими тест-системами на основе МКА к исследуемым цитокинам (ООО «Цитокин», г.Санкт-Петербург). Эти тест-системы основаны на «сэндвич»-методе твердофазного ИФА с применением в качестве индикаторного фермента (метки на антителах) пероксидазы хрена [Hro T., Lenhoff G., 1990]. Статистическая обработка. Для выявления различий между данными, полученными в экспериментальных и контрольных группах, а также результатов в зависимости от стадии развития опухоли применяли U-критерий Манна-Уитни. Статистически достоверными считались данные при р0,05. Для выявления взаимосвязи между компонентами бактерицидных систем нейтрофилов был проведен корреляционный анализ полученных данных. Коэффициент корреляции Спирмена (r) рассчитывали с помощью компьютерной программы математического анализа “Stata v.6.0”. Результаты исследования и их обсуждение Оценка функционального состояния нейтрофилов периферической крови и асцитической жидкости у крыс с перевиваемой асцитной опухолью яичников. По мнению ряда авторов [Шаталин Ю.В., 2008; Enblad G. et al., 2007], развитие опухоли сопровождается увеличением нейтрофилов в периферической крови и увеличением миграции лейкоцитов в зону роста опухоли. Полученные в эксперименте данные свидетельствуют о повышении абсолютного количества лейкоцитов и Нф в периферической крови, что согласуется с результатами В.С.Лавровой с соавт. (1992), а также снижении их в асцитической жидкости в ходе прогрессирования АОЯ крыс (табл.1). Увеличение Нф в крови может свидетельствовать об усилении иммунной реакции в процессе развития опухоли [Enblad G. et al., 2007]. Это может быть результатом увеличения уровня гематопоэтических факторов роста G-CSF или GM-CSF, которые также могут продуцироваться опухолевыми клетками [Чердынцева Н.В., 1989], нарастания времени транзита Нф в крови [Терещенко И.П., Кашулина А.П., 1993] и укорочения времени пребывания их в костном мозге [Лаврова В.С. с соавт., 1992]. Повышение продукции простагландина Е в процессе опухолевого роста также оказывает стимулирующее влияние на колониеобразующие единицы гранулоцитарно-макрофагального ростка [Терещенко И.П., Кашулина А.П., 1993]. Однако, в функциональном состоянии Нф наблюдаются разнонаправленные изменения. Clark R.A. констатировал, что киллерный эффект Нф обусловлен секрецией МПО и Н2О2 [Мацнер Я., 1993]. Эти соединения в сочетании с внеклеточными галогенидами образуют реакционноспособные оксиданты, которые и повреждают клетки-мишени [Блиндарь В.Н., Зубрихина Г.Н., 2005]. Определение МПО позволяет судить о кислородзависимой бактерицидной активности Нф. Авторами отмечено увеличение уровня активности МПО в периферической крови животных-опухоленосителей [Лаврова В.С. с соавт., 1992]. Данные об активности данного фермента в Нф АЖ в доступной литературе не обнаружено. В результате наших исследованиях установлено, что уровень активности МПО Нф асцитической жидкости на терминальной стадии статистически значимо выше, чем на логарифмической стадии (табл.1). Возрастание активности МПО может отражать как противораковую активность Нф, так и их неспецифическую стимуляцию при воспалительной реакции, сопровождающей канцерогенез [Mosczynski Р., 1983]. Также обнаружена сильная корреляционная связь МПО микрофагов АЖ со стадией опухолевого роста (r=0,75). Уровень активности МПО Нф периферической крови на ранней и поздней стадиях прогрессирования асцитной ОЯ у крыс статистически значимо не отличаются и статистически значимо ниже уровня фермента в Нф крови здоровых крыс. Существует мнение, что уменьшение уровня МПО в Нф периферической крови на поздних стадиях опухолевого роста может рассматриваться как следствие снижения способности к завершенному фагоцитозу [Герасимов И.Г., 2004]. Таблица 1 Показатели функциональной активности Нф периферической крови и АЖ крыс на разных стадиях прогрессирования АОЯ группа показатель

Похожие:

	Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови...		1. Количество подготовленных номинантом: кандидатов наук – 18: Наследникова... Российской Федерации от 17. 12. 2012 №1069н «Об утверждении случаев, в которых возможна сдача крови и (или) ее компонентов за плату,...
	169 стандарт медицинской помощи больным железодефицитной анемией Просмотр мазка крови для анализа аномалий морфологии эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов		Математическая морфология. Электронный математический и медико-биологический... Показатели периферической крови как маркёры хронических воспалительных заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта
	Конспект урока "Группы крови. Переливание крови. Донорство" (Тема... ...		Оптимизация аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых... Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального...
	Реферат тема: “опухоли яичников” Наибольшую группу эпителиальных доброкачественных опухолей яичников составляют кистомы. Кистома – истинная опухоль яичника, отличительной...		Цитогенетический статус и фенотипические свойства лимфоцитов периферической... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю...
	Приложение 15 Участие в ноу в 2013-14 уч году Влияние учебных занятий на функциональное состояние зрительного анализатора, исследовательская работа		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «Внутренняя среда организма», изучить состав внутренней среды организма и значение каждого компонента; сформировать у учащихся новые...
	Х всероссийский съезд неврологов сетка секционных заседаний 19-21 июня ...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Микашинович, З. И. Состояние антиоксидантного статуса крови женщин при физиологическом и осложненном течении беременности / З. И....
	Автор: Лебедева Ольга Дмитриевна Координаты ...		Темы рефератов по спортивной медицине. Особенности телосложения и... Функциональное состояние внешнего дыхания у спортсменов (показатели, методы их определения, динамика в макроцикле)
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Поэтому представляется актуальным проведение исследований влияния деятельности, связанной с использованием разнообразных педагогических...		№1, 2011 удк 532. 529 О механизме выброса жидкости (крови) из конусообразного... Название учреждения образования: Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение «Средняя общеобразовательная школа №108»