Отчет о научно-исследовательской работе по Государственному контракту от «07» июля 2009 г. №02. 740. 11. 0270 по теме: «Разработка методик и создание биохимических коллоидных систем для ветеринарно-биологических и зоотехнических направлений»
Скачать 2.98 Mb.
|
Ядерно-магнитный резонанс (ЯМР) В основе ЯМР-спектроскопии лежит поглощение электромагнитных волн в радиочастотном диапазоне ядрами, обладающими магнитным моментом. Наиболее часто в исследованиях используются ядра 13С, 2Н, 31Р. Детальную картину строениягидрофобной области липидного бислоя удалось получить с помощью метода 2Н-ЯМР. Атомы водорода в определенных местах липидной молекулы можно избирательно заменить дейтерием. Это мягкий способ зондирования мембран. Считается, что он, как правило, не вносит возмущений в их структуру. Структура ЯМР спектров определяется временем жизни различных спиновых состояний, величиной диполь-дипольного взаимодействия между данным ядром и соседними ядрами, неоднородностью магнитного поля и т.д. Характерным параметром ЯМР-спектров является величина химического сдвига δ. Иногда для анализа используют время релаксации τ, которые связаны соотношением: δ = 10 – τ. Пики ЯМР лежат в радиочастотном диапазоне, а различия в частотах сигналов для разных изотопов намного превышают ширину сигнала поглощения. Спектры ЯМР малых молекул хорошо разрешимы. Так, спектр ЯМР молекулы холестерола позволяет идентифицировать резонанс каждого атома в отдельности и получить информацию о подвижности различных участков молекулы в зависимости от ее окружения. Кроме параметра химического сдвига – δ рассчитывается параметр Т1, характеризующий процесс продольной (спин-решеточной) релаксации, который прямо пропорционален увеличению подвижности отдельных атомов. Метод ЯМР позволяет с высокой избирательностью получить сведения о поведении разных частей молекулы. Например, увеличение параметра Т1 соответствует возрастанию подвижности С-С-связей от поверхности мембраны к атомам, приближенным к середине бислоя. В литературе часто используется параметр упорядоченности S, который отражает усредненную ориентацию вектора C-D-связи. Колебательные и вращательные движения молекулы, которые влияют на ориентацию C-D-связи в бислое в целом, происходят с достаточно большой скоростью (>106 c-1), так что любой атом дейтерия воспринимает единое усредненное магнитное окружение. Это окружение зависит от соседних атомов, а также от ограничений движения по типу и амплитуде. При переходе к более крупным молекулам спектры ЯМР сильно усложняются и зачастую становятся неразрешимыми. Так, ЯМР-спектроскопия белков в лучшем случае может позволить охарактеризовать состояние (лабильность) отдельных групп молекулы, например, окружение фосфолипидного радикала в активной группе трансфераз. Другим недостатком ЯМР-спектроскопии является довольно низкая чувствительность – концентрация образца должна быть не менее 10-3 М (что довольно много), в то время как оптические методы позволяют получить информацию о молекулах, концентрация которых составляет 10-6–10-7 М. Несмотря на то, что дляизучения мембранных белков ЯМР-спектроскопия оказалась не столь эффективна, этот подход часто используют как немодифицирующий метод изучения мембранных структур. Столь же перспективны и другие немодифицирующие методы: кругового дихроизма и сканирующей калориметрии. Метод кругового дихроизма Метод кругового дихроизма позволяет выяснить, какой тип вторичной структуры преобладает в мембранных белках. Величина кругового дихроизма, характеризуемая обычно эллиптичностью, представляет собой разницу в поглощении образцом право- и лево-поляризованного света. Она объясняется различиями в коэффициентах молярной экстинкции право- и лево-поляризованного по кругу света. При интерпретации спектров кругового дихроизма возникают некоторые трудности, которые связаны, в основном, с негомогенностью мембранных суспензий, обуславливающей сглаживание спектральных кривых. На первый взгляд представляется, что доля спиральных участков в молекуле белка – не самый информативный параметр. Но с помощью этого метода можно выяснить, осуществляется ли прямое влияние на мембранные структуры внешних факторов, если это влияние изменяет спирализацию белковых молекул. Это изменение часто имеет место в тех случаях, когда наблюдается собственный конформационный сдвиг в молекуле белка или есть взаимодействие молекул белка друг с другом, которое изменяет их конформацию. Метод сканирующей калориметрии Принцип метода дифференциальной сканирующей калориметрии состоит в измерении тепла, необходимого для увеличения температуры объекта на очень малую величину при непрерывном повышении температуры объекта. При работе с липидами мембран изменение их фазового состояния также может сопровождаться поглощением или выделением тепла. Чем выше значение поглощенного тепла, тем более значительная молекулярная реорганизация происходит в образце при этих условиях. Таким образом, из- менения конформации макромолекул можно измерять, регистрируя тепло, выделяемое или поглощаемое при конформационных переходах. Метод называется дифференциальным, потому что для нахождения теплоты фазового состояния вещества необходимо из регистрируемого поглощения (или выделения) системой тепла вычесть тепло, поглощаемое (или выделяемое) ею в отсутствии фазовых переходов, – собственную теплоемкость. Современные чувствительные калориметры позволяют измерять фазовые переходы в водно-липидных дисперсиях. Применение этого метода для исследования простых искусственных систем (мицеллы, везикулы, бислои которых организованы из фосфолипи- дов заданного вида) дало ценную информацию о принципах организации бислоя. Было обнаружено, что в бислоях индивидуальных фосфолипидов критическая температура (Ткр) для фазового перехода занимает доли градуса. В смеси различных фосфолипидов область фазового перехода занимает 1–2 градуса. На величину Ткр влияют длина жирнокислотных цепей в молекуле (чем больше атомов углерода в жирнокислотном радикале, тем выше температура перехода) и степень ее гидратации. Обводнение бислоя снижает температуру фазового перехода. Термограмма нагревания мембранных образцов отличается от термограммы их охлаждения. Это явление носит название гистерезиса липидных систем и объясняется «памятью» липидов. Одна из причин такой памяти заключается в неодинаковой энергии гидратации и дегидратации липидного бислоя. Для нативных мембран ценность метода дифференциальной сканирующей калориметрии ниже, чем для искусственных систем. Высокое содержание холестерола в плазматических мембранах не позволяет выявить отчетливых изменений теплопродукции в области фазовых переходов. В случае внутриклеточных мембран фазовые переходы не обнаруживаются по другой причине – эти мембраны оказываются достаточно «жидкими» в приемлемом интервале температур (5–60ºС). Флуоресцентная спектроскопия Световая волна, сталкиваясь с молекулой какого-либо вещества, либо рассеивается (изменяет направление движения), либо поглощается (передает свою энергию молекуле). При этом молекула переходит в возбужденное состояние. Энергия, поглощенная молекулой, может рассеяться в виде тепла (в результате столкновения с другими молекулами) или излучиться в виде света. Какое именно событие из указанных здесь будет иметь место, – определяется состоянием молекулы в момент столкновения. Возбужденные электроны возвращаются на основной уровень двумя путями: либо испуская свет, либо с помощью безизлучательного перехода. В первом случае испускаемый свет обладает меньшей энергией и большей длиной волны (так называемый Стоксов сдвиг), так как часть энергии теряется. Эффективность флуоресценции (вероятность излучательного перехода) характеризуется квантовым выходом 8, равным отношению числа излученных фотонов к числу поглощенных. Величину 0, как и Стоксов сдвиг, определяют и внутренние, и внешние факторы. Например, в случае транс-изомеров в несколько раз выше, чем в случае цис-изомеров флуоресцирующих молекул. К числу внешних факторов относится столкновение с молекулой тушителя (динамическое тушение) или образование комплекса флуоресцентной молекулы с тушителем (статическое тушение). Первый процесс (излучательный переход) зависит от вязкости среды и может быть использован для ее измерения. Тушителями флуоресценции являются тяжелые анионы или катионы (J-, Br-, Cs+, Cu2+), парамагнетики (Мn2+, нитроксильные радикалы). Кроме того, наблюдается тушение флуоресценции в полярных растворителях, например, в воде. Второй случай – безызлучательный переход в основное состояние – происходит, если наиболее высокий колебательный подуровень основного состояния имеет приблизительно ту же энергию, что и низкий колебательный уровень возбужденного состояния. Такой переход характерен для «гибких» молекул. У «жестких» молекул, содержащих ароматические кольца, чаще всего наблюдается излучение части поглощенной энергии. Переход молекулы в возбужденное состояние сопровождается изменением дипольного момента молекулы. Это в свою очередь поляризует электронные оболочки окружающих молекул, что приводит к смещению атомов и переориентации молекул. Затрата энергии на эти процессы и приводит к сдвигу в длинноволновую область спектра. Стоксов сдвиг будет тем больше, чем больше: 1) изменение дипольного мо- мента молекулы при возбуждении, 2) время жизни молекулы в возбужденном состоянии, 3) поляризуемость окружающих молекул. В некоторых случаях возбужденная молекула, сталкиваясь с идентичной невозбужденной молекулой, образует комплекс – эксимер. При этом из плоских молекул возникают структуры типа сэндвича, которые стабилизированы переносом заряда от одной молекулы к другой. На перенос заряда тратится часть энергии поглощенного кванта, поэтому эксимер флуоресцирует в более длинноволновой области. Степень эксимеризации зависит от концентрации хромофора, температуры и вязкости окружающей среды. Тушение флуоресценции иногда представляет собой результат дальней безызлучательной передачи (так называемого резонансного переноса) энергии. В этом случае система содержит два флуоресцирующих хромофора, причем спектр испускания одного из них (донора) должен перекрываться со спектром поглощения другого (акцептора). При наличии переноса энергии интенсивность флуоресценции донора снижается, а акцептора – увеличивается. Эффективность переноса зависит от дистанции между донором и акцептором, и это явление может быть использовано для определения расстояния между определенными группами в мембране. 2.3.3 Получение полимерных пленок и методы их исследования Для проведения эксперимента требовалось получить и исследовать пленки из 9 типов полимеров: целлюлозы ацетатгидрофталата (ЦАГФ), целлюлозы ацетатбутирата (ЦАБ), поливинилбутираля (ПВБ), сополимера полиметилметакрилата и этилакрилата (ПММА+ЭА), полиметилметакрилата (ПММА), полистирола (ПС), сополимера полистирола и малеинового альдегида (ПСМА), поливинилстеарата (ПВС), поливинилхлорида (ПВХ). Для работы в качестве универсальной технологии получения НКМ была выбрана методика полива [163]. Принципы этой методики реализуются как для получения пленок без ОМС, так и с иммобилизованным ОМС. В методе полива используются растворы полимера и растворы ОМС в соответствующих растворителях, имеющих соответствующие фиксированные концентрации. Растворы могут наноситься на подложку с помощью пипетки или с помощью центрифуги, на головке которой жестко зафиксирована подложка, в центр которой наносится раствор полимера или смесь раствора полимера с раствором ОМС. Подложка в методе полива пленок представлена кварцевым стеклом. В соответствии с данной методикой требуется провести обязательный анализ по следующим направлениям:
Для получения полимерных пленок использовали метод полива из раствора. Формование пленок из растворов полимеров является одним из наиболее простых и эффективных методов производства пленочных материалов [163-167]. Методы получения пленок поливом из раствора имеют большое значение для полимеров, температура вязкого течения которых находится ниже температуры разложения. К ним относятся эфиры целлюлозы, гидрохлорид полиизопренового каучука, поливиниловый спирт и многие другие. Использование растворителей целесообразно и в тех случаях, когда повышение молекулярной массы, улучшающее прочностные и эластические свойства пленок, ведет к увеличению температуры текучести и не допускает переработку полимеров из расплава. Существуют два основных технологических метода: 1) пленки получают из раствора полимера, поливаемого из движущейся фильеры на неподвижный стол, поверхность которого представляет собой плоские листы силикатного стекла (используется для получения специальных плёнок) и 2) из неподвижной фильеры раствор полимера поступает на непрерывно движущуюся поверхность - бесконечную ленту или вращающийся барабан (используется в крупнотоннажных производствах традиционных плёнок). Для получения полимерных матриц для НКМ более предпочтителен первый метод, который позволяет получить пленки достаточно малого размера (порядка 1 мм 2). Полимеры в растворах, особенно концентрированных, образуют структуры, форма и размер которых зависят как от характера взаимодействия полимера с растворителем, так и от условий, в которых находится раствор (температура, механическое воздействие) [163, 166, 168]. Специфическим свойством растворов полимеров является их высокая вязкость, зависящая от концентрации полимера, его структуры, вязкости растворителя, но главным образом от характера взаимодействия полимера с растворителем. Основными стадиями процесса получения пленок поливом являются: 1) приготовление раствора полимера или нескольких полимеров; 2) подготовка раствора к формованию — фильтрование; 3) полив пленки; 4) сушка пленки при нормальных условиях или специально заданных условиях; 5) отделение от подложки; обрезка. Растворители полимеров должны отвечать следующим основным требованиям: 1) иметь достаточную растворяющую способность по отношению к полимеру; 2) неограниченно смешиваться с пленкообразующим полимером для обеспечения однородного раствора; 3) иметь минимальное значение концентрационного градиента вязкости (т. е. вязкость раствора по возможности должна мало изменяться с изменением концентрации полимера во избежание значительной усадки пленки при испарении растворителя); 4) иметь максимальный температурный градиент вязкости (т. е. значительное изменение вязкости с изменением температуры, что облегчает проведение ряда технологических операций, например фильтрования, деаэрации); 5) иметь степень летучести, обеспечивающую оптимальную кинетику испарения; 6) быть химически стойкими и инертными по отношению к другим компонентам раствора и материалам оборудования; 7) быть нетоксичными. Важным достоинством метода получения пленок из раствора является то, что отлив пленок производится при сравнительно низкой температуре, возможно введение нетермостойких добавок, определяющих дальнейшее применение пленки (стабилизаторов, красителей, биоорганических соединений, лекарственных препаратов и т. п.) [163-169]. Для разрабатываемого способа получения НКМ на основе полимерной матрицы с иммобилизованным ОМС, представляющим собой нетермостойкую добавку, это имеет большое значение. Изготовление полимерных пленок методом полива из растворов полимеров Достоинством метода является его простота. Однако необходимым условиям метода является растворимость полимера и оптического молекулярного сенсора (ОМС) в одинаковых растворителях, что не всегда осуществимо. При использовании метода полива готовят раствор полимера с заданной концентрацией, благодаря которой раствор полимера обладает технологически адекватной вязкостью. При этом для данного полимера подбирается оптимальный растворитель (или набор растворителей). Для каждого растворителя характерна кинетика испарения. Если посредством пипетки из общего раствора полимера извлечь определенный объем и распределить его на подложке с известной площадью поверхности, то, по ходу испарения растворителя, на данной подложке будет формироваться пленка из данного раствора полимера определенной массы и толщины в соответствии с формулами: M=ρ∙S∙h∙10-4 V=M(1- ω)/ ρ∙ω где ρ - плотность раствора полимера (г/см3); S - площадь подложки (см2); h - толщина слоя полимера для полива на подложку М – масса полимера на одну пленку (г) ω – массовая доля полимера в растворе V – объем раствора полимера, извлекаемого мерной пипеткой (мл). Изготовление пленок методом полива проводят на специальном горизонтальном столике с регулируемым уровнем.  Рисунок 7 - Специальный горизонтальный столик. Для отлива пленок используют стандартные предметные стекла размером 2,5см7,5см. Стекла готовят к отливу пленок путем обезжиривания с помощью погружения на 15 мин в хромовую смесь. После тщательного промывания в дистиллированной воде стекла просушивают на воздухе до полного высыхания. После этого стекла располагают на специальном горизонтальном столике с регулируемым уровнем. На стекла с помощью пипетки на 2 мл наносят раствор полимера по каплям по всей площади стекла. Пленки отливают под вытяжкой при комнатной температуре и накрывают чашкой Петри. Высушивают пленки в парах растворителя в течение суток. Для приготовления пленок толщиной 10 и 20 мкм используют 4% растворы полимеров. Для приготовления пленок толщиной 40 мкм используют 8% растворы полимеров. Для исследования оптических, структурно-механических свойств и влагопоглощения отливают пленки различной толщины от 10 до 40 мкм. С целью экономии ОМС, а также повышения чувствительности НКМ была разработана модифицированная методика. Суть модификации состоит в следующем: При стандартном методе получения пленок из раствора, содержащего одновременно и полимер и ОМС, существует предположение о том, что ОМС распределяется в полимерной матрице равномерно по всей толщине пленки. Поскольку среда пленки гидрофобна, то это должно создавать препятствие для проникновения катиона растворенного в воде аналита вглубь пленки и образования его комплекса с ОМС. В модифицированном методе объем раствора исходного полимера, приходящийся на 1 пленку, разделяют на две порции: раствор №1 и раствор №2 в определенном соотношении. При этом вначале отливают пленку из раствора №1 (без ОМС), она сохнет некоторое фиксированное время, после чего смешивают раствор №2 с необходимым объемом раствора ОМС и на пленку сформированную из раствора №1 наливают смесь раствора №2+ОМС. Эту «двойную» пленку сушат сутки в парах растворителя. Целесообразность такой методики состоит в том, что с ее помощью можно с определенной достоверностью повысить концентрацию ОМС на поверхности пленки. Было поставлено 8 экспериментов со следующими объемными соотношениями растворов №1 и №2 (см. таблицу 2.): Таблица 2 - Объемные соотношения растворов № 1 и № 2
Оптимальным оказалось соотношение раствора полимера 1 к раствору полимера 2, равное 9:1. При этом для приготовления НКМ необходимо использовать ряд приемов, выведенных экспериментальным путем. В частности, при нанесении раствора №1 на стеклянную подложку заранее готовятся 6 подложек с нанесенным на их поверхность чистым растворителем. После нанесения раствора №1 на стекло в окружении таких стеклышек с нанесенным растворителем данную систему накрывают чашкой Петри и выдерживают в течение 45 минут. После истечения этого времени чашку Петри снимают, убирают стеклышки, а на стекло с раствором №1 по каплям добавляют растворитель, объем которого в 2 раза меньше объема раствора полимера и ОМС, рассчитанных на одну пленку по стандартной методике отлива. Скорость добавления растворителя должна быть примерно 2 капли в секунду. После этого стеклышко накрывают чашкой Петри на 15 минут, а после истечения этого срока добавляют раствор №2, смешанный с раствором ОМС. После этого стеклышко накрывают закрытой фольгой чашкой Петри на сутки. Использование предложенной модификации позволило получить пленки с лучшей хемочувствительностью. Для усовершенствования методики полива пленок была предложена следующая схема: на стекло наносят раствор полимера с концентрацией 4%, смешанный с чистым растворителем, объем которого равен или превышает объем предполагаемого раствора ОМС. При этом важно отметить, что растворитель может быть идентичным растворителю раствора полимера, может быть близок ему по свойствам и растворению определенной группы полимеров (например, хлороформ и ДХЭ), а может быть представлен смесью растворителей, из которых один растворитель растворяет полимер, а другой - нет. Такой раствор наносят на стекло и накрывают чашкой Петри. В микропробирку вносят раствор ОМС, в который добавляют растворитель, объем которого может соответствовать предполагаемому раствору полимера (как в случае стандартной методики), и эту смесь наносят на уже распределенный на стекле раствор полимера. Отмечено, что внесение избыточного объема растворителя для создания насыщенного пара положительно влияет на характер формирования пленки. При этом растворитель в жидкой фазе можно нанести непосредственно на общее стекло, где пленка формируется, а можно внести в единый замкнутый объем (под чашку Петри), а нанесение ОМС осуществлять, как описано в модифицированной методике. Экспериментально установлено, что существенной разницы формирования пленки между первым и вторым технологическим решением нет, но сложность и больший расход растворителя наблюдается во втором случае. Также было отмечено, что, варьируя концентрации растворенных веществ (полимера и ОМС), можно добиться более эффективной регуляции кинетики удаления растворителя, особенно в сочетании с дополнительным внесением в объем избыточного пара растворителя, удобства распределения материала на подложке и получение качественной пленки. Было предположено, что от метода изготовления пленки зависит и ее молекулярная структура. Это основано на том, что в одних случаях удается встроить ОМС на поверхность, а в других нет, при этом от метода получения зависит оптическая плотность пленок, например при слишком быстром испарении растворителя из формирующейся пленки, она мутнеет. Выяснено, что чем меньше концентрация полимера в растворе, из которого формируется пленка, тем лучше качество пленки (нет помутнений, возможна иммобилизация ОМС без смешивания с дополнительным раствором полимера и т.д.). Преимущество модифицированных методик перед стандартной состоит в получении более гладких и однородных пленок. Важно также, что появляется возможность встраивания любого ОМС в любую полимерную матрицу за счет варьирования растворителями на базе двух самостоятельных растворов при их нанесении на стекло, что снимает необходимость в проведении исследований на совместимость раствора полимера и раствора ОМС. |
Похожие:
 | Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... |  | Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... |
| Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... | | Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей» |
| Отчет о научно-исследовательской работе контракт №21/10 от «09» октября... Целью работы является исследование теоретических и практических особенностей существующих систем ротации в правоохранительных органах,... | | Отчет о научно-исследовательской работе по государственному контракту... Русский язык и культура речи: учебно-методический комплекс для студентов очной формы обучения / сост. И. А. Крым; Кузбасский институт... |
| Отчет по государственному контракту от 04. 06. 2012 №1102-01-41/06-12... ... | | Отчет о научно-исследовательской работе по теме: «Разработка научно... «Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации» (ИЗиСП) |
| Отчет о научно-исследовательской работе по теме «Эффективность использования... Отчет по теме № са-12-39 «Эффективность использования отраслевых информационных систем» Минкультуры России | | Отчет о выполненной работе по Государственному контракту №12. 741.... Целью проведения работы является эффективное освоение молодыми исследователями и преподавателями лучших научных и методических отечественных... |
| Отчет №3 о научно-исследовательской работе по теме: «Грид-технологии» Разработка методов эффективного решения задач обработки, хранения, передачи и защиты информации | | Отчет о научно-исследовательской работе Гост 32-2001. Межгосударственный стандарт. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской... |
| Отчет о научно-исследовательской работе Межгосударственный стандарт (гост 32-2001). Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления (редакция 2005... | | Отчет о научно-исследовательской работе на тему: «Разработка модифицированных... «Разработка модифицированных методов выделения гуминовых веществ для получения биологических препаратов на основе вермикомпоста» |
| Общие положения отчет Отчет о научно-исследовательской работе (нир) документ, который содержит систематизированные данные о научно-исследовательской работе,... | | Отчет по Государственному контракту № «Разработка концепции создания интеллектуальной транспортной системы на автомобильных дорогах федерального значения» |
