Отчет о научно-исследовательской работе по Государственному контракту от «07» июля 2009 г. №02. 740. 11. 0270 по теме: «Разработка методик и создание биохимических коллоидных систем для ветеринарно-биологических и зоотехнических направлений»
Скачать 2.98 Mb.
|
| Часть углеводов представлена свободными олигосахаридами, а часть входит в состав сложных липидов (гликолипиды) или сложных белков (гликопротеины). В составе соединительной ткани и межклеточного вещества обнаруживаются протеогликаны: углеводные компоненты в них сульфатированы. Их типичными представителями являются хондроитинсульфат, дерматансульфат и гепарансульфат. Углеводные компоненты мембранных структур в подавляяющем большинстве открываются во внеклеточную среду. Их функции связаны с контролем за межклеточными взаимодействиями, поддержанием иммунного статуса клетки, обеспечением стабильности белковых молекул в мембране. В качестве наиболее распространенного примера гликопротеинов обычно приводят иммуноглобулины крови, но это не мембранные гликопротеины. Типичным примером гликоконъюгатов, выполняющих свои функции в составе мембран, являются антигенные детерминанты эритроцитов различных групп крови. Они представлены как гликолипидами, так и гликопротеинами, в числе которых – белок гликофорин. Очень важна роль углеводного компонента белковых молекул в формировании специфических функций мембранных белков и липидов. Многие белковые молекулы, особенно биологически активные вещества (например, нейропептиды), синтезируются в виде крупных, неактивных предшественников, которые затем расщепляются специфическими протеазами с формированием «зрелых» биологически активных продуктов. Деятельность протеаз контролируется уровнем гликозилирования белков. Так, многие белки, синтезируемые вначале как гликопротеины, в дальнейшем в результате процессинга теряют олигосахаридную часть. [10] Мембранные белки – особенности строения Если липиды – относительно низкомолекулярые соединения с молекулярным весом около 1000 дальтон (1 килодальтон, кДа), то белки относятся к высокомолекулярным соединениям. Их молекулярный вес достигает 1000 кДа и более. Белковый состав мембран чрезвычайно разнообразен, он в значительной мере определяет свойства мембран и их функциональную активность. Мембранные белки, как правило, почти не отличаются от растворимых по количеству входящих в них гидрофобных аминокислот. Однако эти гидрофобные аминокислоты сгруппированы в мембранных белках в ряд доменов так, что гидрофильных групп пептидной цепи недостает для их маскировки. Такие белки не активны вне гидрофобного окружения. Мембраны предоставляют им возможность стабилизировать свою структуру и нормально функционировать. Важный белковый компонент мембраны – гликопротеины – белковые молекулы, содержащие углеводные цепочки. Периферические белки или домены интегральных белков, расположенные на наружной поверхности мембраны, почти всегда гликозилированы. Углеводные цепочки гликопротеинов имеют разнообразную структуру. Роль гликопротеинов в жизни клетки многообразна. Некоторые из них играют роль ферментов, другие обладают гормональной активностью. Предполагают, что одна из функций процесса гликозилирования – обеспечить возможность белкам, синтезированным в аппарате Гольджи, транспорта через клеточную мембрану. Гликопротеины, расположенные на поверхности клеток, ответственны за такие важные процессы, как взаимное распознавание клеток – с их помощью клетки многоклеточного организма устанавливают межклеточные контакты. Они, по-видимому, также служат материалом, склеивающим клетки одного типа между собой. Предполагают также, что от структуры гликопротеинов зависят устойчивость и многие другие свойства клеточной поверхности. Гликозилированные белки обладают резистентностью к протеолизу и поэтому имеют большую длительность жизни. Гликопротеины, находящиеся на поверхности эритроцитов, определяют группу крови. Способы связывания белков с мембраной Белковая молекула может фиксироваться в бислое с помощью различных типов взаимодействий, включая электростатические (на уровне полярных головок липидов) и гидрофобные (в толще бислоя). Мембранные белки подразделяют на два типа: периферические и интегральные. Периферические белки отличаются от интегральных меньшей глубиной проникновения в бислой и степенью воздействия на состояние и подвижность углеводородных цепей липидов. Периферическими называют белки, легко вымываемые из мембран растворами солей или даже дистиллированной водой. Такие белки способны обратимо связываться с бислоем и часто совершают челночные перемещения между мембраной и ее окружением. Некоторые из этих белков связываются непосредственно (или через посредника, в частности, Са2+) с заряженными группами липидов мембран за счет электростатических взаимодействий (рис. 2 a). В качестве примеров можно привести миелиновый основный белок [12], спектрин, протеинкиназу С [13], фосфолипазы [14]. Следует отметить предпочтительное связывание таких белков с мембранами определенного липидного состава, так, например, для фосфолипазы А2 критичным является присутствие в мембране фосфатидилхолиновых липидов [14], а для протеинкиназы С — фосфатидилсериновых [13]. В то же время эти белки могут взаимодействовать с ближней гидрофобной областью бислоя [4, 9]. Существует также ряд белков, адсорбирующихся на мембранных гликолипидах и гликопротеинах посредством углевод-белкового и/или белок-белкового взаимодействия (рис. 2 б) [3, 15]. Этот тип взаимодействий реализуется, например, при связывании F1-час-ти Н+-АТФазы с погруженной в мембрану F0-частью. Вторая группа мембранных белков — интегральные, которые связаны с мембраной за счет более прочных гидрофобных взаимодействий. Интегральные белки можно извлечь из мембраны только при разрушении липидного бислоя детергентами или органическими растворителями. Такие белки можно подразделить на внутренние трансмембранные (рис. 2 в и г) и наружные, имеющие гидрофобный якорь (рис. 2 д—ж). Основная функционально значимая часть молекулы внутреннего трансмембранного белка при встраивании практически полностью погружается в мембрану. Трансмембранные белки различаются числом полипептидных участков, пересекающих би-слой, и могут содержать один (рис. 2 в), как, например, в случае гликофорина [16], или несколько (рис. 2 г) таких участков, что характерно для ЛГФаз, бактериородопсина [17], родопсина [18] и др. Эти участки, как правило, целиком построены из гидрофобных аминокислот и часто имеют α-спиральную конфигурацию [2, 3]. Многие интегральные белки животного происхождения связываются с плазматическими мембранами клеток за счет гидрофобного якоря, при этом большая часть молекулы гликозилирована и локализуется с наружной стороны мембраны [2, 3, 4]. Некоторые из этих белков крепятся к мембране посредством кова-лентно связанного гликозил-фосфатидилинозитольного (GPI) якоря (рис. 2 ж). Подобный способ связывания реализуется в случае щелочной фосфатазы, 5'-нуклеотидазы, ацетилхолинэстеразы и др. Другие белки взаимодействуют с мембраной за счет трансмембранного пептидного якоря — последовательности гидрофобных аминокислот, расположенной вблизи N- или С-конца молекулы белка. Мембранные белки I типа (рис. 2 д) синтезируются с N-терминальным сигнальным пептидом, отщепляемым в процессе биосинтеза, и С-концевым якорем. В случае белков II типа N-сигнал в процессе биосинтеза не отделяется и выполняет роль трансмембранного якоря (рис. 2 е). Отметим, что для многих белков, встроенных в мембрану с помощью якоря, характерно «слущивание» (shedding) с клеточной поверхности, при котором они выделяются в растворимом виде во внеклеточное окружение, а якорь остается в мембране [19, 20]. Образование растворимых форм происходит в результате ферментативного гидролиза доступного примембранного участка белка-субстрата и описано для разнообразных по структуре и функциям интегральных белков I и II типов (табл. 1) [21, 22]. Ферменты, ответственные за отщепление пептидного якоря этих белков, называют секретазами, конвертазами или шедазами. Большинство из них являются мембранными металлопротеиназами [21, 22] и характеризуются широкой протеолитической специфичностью (табл. 2). Так, например, в случае АПФ, принадлежащего к мембранным белкам I-типа и имеющего якорь с С-конца полипептидной цепи, слущивание происходит под действием специфической металлозависимой секретазы [21]. В то же время существуют и сериновые секретазы (эластаза-подобные), отщепляющие якорь мембранных белков в пределах ограниченной последовательности, состоящей из небольших неполярных аминокислотных остатков [23]. Белки, обладающие GPI-якорем, секретируются с клеточной поверхности при действии фосфолипаз C или D [22]. Таким образом, многие белки могут присутствовать в организме животных как в мембраносвязанной, так и в растворимой циркулирующей формах. Полагают, что свойственный для этих белков баланс форм необходим для их нормального функционирования [22, 24]. Повышение секретазной активности приводит к нарушению этого баланса и наблюдается при патологических состояниях: отеке легких, кахексии, артрите, сепсисе, аутоиммунных заболеваниях, нейродегенерации, онкогенезе и др. [20, 22]. Очевидно, секретазы белков, вовлеченных в различные физиологические и патологические процессы, имеют важное значение и могут рассматриваться как потенциальные мишени при поиске новых лекарственных средств. Важность функций различных секретаз наглядно иллюстрирует пример образования рА4-пептида, являющегося основной причиной болезни Альцгеймера. Этот пептид образуется в процессе расщепления мембраносвязанного предшественника амилоидного белка двумя β- и γ-секретазами (рис. 3), при этом действие других секретаз (в особенности а-секретазы) предотвращает развитие этого заболевания [22, 25]. Биологическая значимость процесса слущивания мембранных белков в значительной степени может быть обусловлена различными свойствами их растворимых и мембра-носвязанных форм in vivo. Прежде всего эти отличия могут быть вызваны особенностями функциониро- вания мембраносвязанных белков, которые мы рассмотрим ниже. Особое внимание при этом будет уделено свойствам ферментов — биокатализаторов превращений разнообразных биологически активных веществ. Функции мембранных белков Как правило, именно белки ответственны за функциональную активность мембран. К таким белкам относятся разнообразные ферменты, транспортные белки, рецепторы, каналы, белки, обраующие поры (аквапорины), то есть разнообразные белковые структуры, которые обеспечивают уникальность функций каждой мембраны. Мембранные белки по биологической роли можно разделить на три группы: I – белки-ферменты, обладающие каталитической активностью, II – рецепторные белки, специфически связывающие те или иные вещества, III – структурные белки. Белки-ферменты Белки-ферменты наиболее распространены среди всех мембранных белков. В их число входят как интегральные (мембранные АТФазы), так и периферические (ацетилхолинэстераза, кислая и щелочная фосфатазы, РНКаза) белки. Ферменты – большие молекулы, в то время как размеры молекул веществ (субстратов), вступающих в ферментативные реакции, обычно в тысячи раз меньше. Фермент взаимодействует с субстратом небольшим участком своей поверхности – активным центром. Специфичность фермента всегда определяется тем, насколько поверхность его активного центра соответствует поверхности субстрата. Этот принцип структурного соответствия повсеместно используется и в работе белков клеточных мембран. В дополнение к этому надо учесть, что конформация внедряющихся в мембрану белков зависит от мембранного бислоя, так что и их ферментативная активность контролируется мембранными липидами. Этот контроль может реализоваться благодаря как влиянию на сродство к субстратам или на их доступность, так и воздействию на длительность жизни (прочность) белковых ассоциатов мембранных ферментов, образующихся в клеточной мембране. Ферменты входят в состав как плазматических, так и внутриклеточных мембран. Например, на наружной мембране эпителиальных клеток, выстилающих пищеварительные органы, имеются ферменты, осуществляющие расщепление питательных веществ еще до того, как они попадут внутрь клетки (этот процесс, открытый отечественным физиологом А.М. Уголевым носит название «мембранное пищеварение»). Наружная мембрана клеток печени содержит более 20 различных ферментов. Мембранные ферменты нуждаются в контакте с окружающими их липидами. Когда их извлекают из липидного окружения (например, когда липиды экстрагируются из мембраны неполярными растворителями), работа мембранных ферментов нарушается (меняются особенности кинетики или характера влияния посторонних веществ или же вовсе прекращается). Активность таких мембранных ферментов удается частично восстановить, если к ним добавить липидные мицеллы. Анализ природы липидов, активирующих мембранные ферменты, демонстрирует отсутствие строгой специфичности - определяющим является гидрофильно-липофильный коэффициент липидной смеси. В ряде случаев активировать делипидированный фермент удается даже детергентом. Однако такой реактивированный фермент теряет способность воспринимать регулирующие сигналы извне, которые управляли его работой в «живой» мембране. Активирующее действие липидов на мембранные ферменты может быть по меньшей мере двояким. Во-первых, в присутствии липидов может меняться форма молекулы мембранного фермента, так что его активный центр становится доступным для субстрата. Во-вторых, липиды могут играть роль организатора ансамбля или конвейера, состоящего из многих ферментов. Молекулы мембранных ферментов содержат большие неполярные гидрофобные участки. Поэтому в водной среде они агрегируют, из-за чего большая часть активных центров маскируется. В присутствии липидов мембранные ферменты организуются в ансамбли, окруженные аннулярными липидными молекулами, и их ферментативная активность может проявиться в полной мере. Для нормальной работы мембранных ферментов существенно, чтобы окружающие их липиды находились в жидком агрегатном состоянии. Биологическое значение мембранной организации ферментов Изучение роли мембранной организации белков непосредственно в живом организме затруднено из-за сложной организации живой материи и одновременного протекания множества взаимосвязанных процессов. Однако, возможность проведения мутации генов, обеспечивающей избирательные изменения в структуре экспрессируемых белков, например, экспрессию только растворимых форм белков, позволяет в некоторых случаях показать важность функционирования именно мембраносвязанных белков [20, 27, 28, 29]. Рассмотрим это на примере Kit-лиганда — одного из мембраносвязанных факторов роста млекопитающих. Для мутантной формы этого интегрального гликопротеина I типа, не содержащей трансмембранного и цитоплаз-матического доменов, была продемонстрирована нормальная экспрессия in vivo и биологическая активность при исследовании слияния клеток, аналогичная активности секретируемой формы нативного белка. Однако у мыши, имеющей ген такого белка, проявлялись все симптомы животного, вообще лишенного гена Kit-лиганда — макроцитарная анемия, бесплодие, белый окрас [29]. В качестве другого примера можно привести мембранный фактор Boss, который является необычным интегральным белком I типа. Якорь этого белка семикратно пересекает мембрану. Мутации, обеспечивающие полное или даже частичное (с сохранением трех трансмембранных участков) удаление якоря, приводили к полной потере биологической активности этого белка в организме [28]. Недавние исследования также убедительно подтверждают физиологическую значимость мембранной формы АПФ. Мышь, у которой ген нативного АПФ был заменен на ген, кодирующий фермент без якоря таким образом, что весь секретируемый фермент был активен, однако не встраивался в мембрану, имела все симптомы «нокаутного» животного, полностью лишенного гена АПФ: низкое давление, неконтролируемое мочеиспускание, бесплодие, различные сосудистые дисфункции, нарушения структуры и функции почек [30]. Отметим, что важность связывания с биомембраной выявлена не только для интегральных белков, но и продемонстрирована в ряде случаев для периферических белков, например, пируватоксидазы — периферического фермента, катализирующего окисление пирувата до уксусной кислоты и восстановление убихинона. Указанный фермент циркулирует в организме и связывается с плазматической мембраной лишь в присутствии субстрата и кофактора; при этом в молекуле белка формируется С-концевой липидсвязывающий домен. Показано, что мутантная форма пируватоксидазы, лишенная последних 24 аминокислотных остатков, полностью неактивна in vivo из-за неспособности связываться с мембраной [26]. Таким образом, биологическая роль различных мембранных ферментов может в значительной степени определяться их способностью к связыванию с мембраной. Во-первых, связывание с биомембраной обеспечивает локализацию (концентрирование) ферментов в определенной части клетки и/или в той области мембраны, где концентрируется субстрат. Например, ацетилхолинэстераза фиксируется в постсинаптической мембране, где велика концентрация ацетилхолина [31]. Во-вторых, адсорбция ферментов на мембране создает возможность для сопряжения процессов катализа и трансмембранного переноса. Так, при функционировании мембраносвязанных ферментов, участвующих в гидролизе крахмала и белков, вблизи клеточной мембраны создается локально высокая концентрация растворимых молекул продукта, что способствует их эффективному поглощению клеткой [32]. В-третьих, для многих ферментов при связывании с мембраной обеспечивается доступность водонерастворимых субстратов. Это могут быть интегральные ферменты, участвующие в процессинге мембранных белков (например, секретазы мембранных белков, см. выше), а также периферические ферменты: фосфолипазы [33], протеинкиназа С [34], пируватоксидаза [26] и др. Наконец, при связывании формируется оптимальное микроокружение, обеспечивающее нативную конформацию и каталитическую активность мембранных ферментов. |
Похожие:
 | Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... |  | Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... |
| Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... | | Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей» |
| Отчет о научно-исследовательской работе контракт №21/10 от «09» октября... Целью работы является исследование теоретических и практических особенностей существующих систем ротации в правоохранительных органах,... | | Отчет о научно-исследовательской работе по государственному контракту... Русский язык и культура речи: учебно-методический комплекс для студентов очной формы обучения / сост. И. А. Крым; Кузбасский институт... |
| Отчет по государственному контракту от 04. 06. 2012 №1102-01-41/06-12... ... | | Отчет о научно-исследовательской работе по теме: «Разработка научно... «Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации» (ИЗиСП) |
| Отчет о научно-исследовательской работе по теме «Эффективность использования... Отчет по теме № са-12-39 «Эффективность использования отраслевых информационных систем» Минкультуры России | | Отчет о выполненной работе по Государственному контракту №12. 741.... Целью проведения работы является эффективное освоение молодыми исследователями и преподавателями лучших научных и методических отечественных... |
| Отчет №3 о научно-исследовательской работе по теме: «Грид-технологии» Разработка методов эффективного решения задач обработки, хранения, передачи и защиты информации | | Отчет о научно-исследовательской работе Гост 32-2001. Межгосударственный стандарт. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской... |
| Отчет о научно-исследовательской работе Межгосударственный стандарт (гост 32-2001). Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления (редакция 2005... | | Отчет о научно-исследовательской работе на тему: «Разработка модифицированных... «Разработка модифицированных методов выделения гуминовых веществ для получения биологических препаратов на основе вермикомпоста» |
| Общие положения отчет Отчет о научно-исследовательской работе (нир) документ, который содержит систематизированные данные о научно-исследовательской работе,... | | Отчет по Государственному контракту № «Разработка концепции создания интеллектуальной транспортной системы на автомобильных дорогах федерального значения» |
