Отчет о научно-исследовательской работе по Государственному контракту от «07» июля 2009 г. №02. 740. 11. 0270 по теме: «Разработка методик и создание биохимических коллоидных систем для ветеринарно-биологических и зоотехнических направлений»
Скачать 2.98 Mb.
|
Влияние мембранного окружения на активность ферментов Каталитически активная конформация трансмембранных ферментов может в значительной степени формироваться мембраной. При выделении из мембраны и делипидизации они часто полностью теряют свою каталитическую активность. К таким ферментам относятся (Na+, К+ и Ca2+)-АТФазы [26], цитохром С оксидаза [26] и др. Каталитические свойства интегральных ферментов, обладающих пептидным или фосфатидилинозитольным якорем, также могут изменяться при переводе их в растворимую форму. На такую возможность прямо указывают данные по изучению каталитических свойств мембраносвязанного АПФ (двудоменный фермент с двумя активными центрами [26]) в культуре клеток яичников китайского хомячка [35]. Было показано, что соотношение каталитических констант гидролиза природного субстрата ангиотензина I на N- (k = 48 с-1) и С-доменах (kcat = 14 с-1) мембраносвязанного фермента отличается от такового для солюбилизированного АПФ в водных условиях: 11 с-1 и 34 с-1, соответственно [35]. Кроме того, изменение каталитических характеристик ферментов при их солюбилизации было показано в серии экспериментов по сравнительному изучению кинетических свойств р- и м-форм ферментов, обладающих GPI-якорем [36, 37, 31, 38]. При этом в одних случаях ферментативная активность падала при высвобождении фермента, а в других, напротив, связанная форма ферментов характеризовалась пониженной активностью. Например, в случае ацетилхолинэстеразы слущивание фермента с мембраны под действием фосфолипазы С приводило к потере его наблюдаемой активности [31]. Обратный эффект наблюдался в случае дипептидазы из почек свиньи, для которой характерна активация при высвобождении этого фермента с поверхности мембраны [36]. При этом показано, что активация дипептидазы в реакции гидролиза субстрата Gly-D-Phe происходила за счет десятикратного уменьшения Кт (от 0,77 до 0,07 мМ) при сохранении постоянного значения V . В аналогичных исследованиях свойств 5'-нуклеотидазы из желудка курицы было показано, что активация фермента при его солюбилизации происходила за счет как уменьшения значения Кт, так и повышения Vmax [37]. В случае 5'-нуклеотидазы из лимфоцитов свиньи подобный эффект был связан с увеличением Vmax на 20% при сохранении постоянного значения К [37]. Таким образом, мембранное окружение существенно влияет на проявляемые ферментами каталитические свойства. Ниже мы рассмотрим основные факторы, регулирующие активность мембрано-связанных ферментов. Влияние состава и динамических свойств мембраны Функциональная активность мембранных белков в первую очередь зависит от динамических свойств липидного матрикса мембраны, обеспечивающих конформационную подвижность фермента — способность белковой молекулы совершать обратимый конфор-мационный переход из напряженного состояния в расслабленное [2, 3, 4]. Такая возможность зависит от плотности упаковки липидов, которая в свою очередь зависит от состава мембран. Обычно при температурах ниже критической (Т — температура фазового перехода «гель — жидкий кристалл», индивидуальна для каждой мембраны, например в бислойных мембранах чистого фосфатидилхолина Т составляет 23°) мембраны слишком упорядочены, чтобы обеспечивать конформационную лабильность белков [2]. Однако, ферменты в клетках спящих губернантов (животных, впадающих в зимнюю спячку) могут функционировать даже при понижении температуры ниже, чем Т. Дело в том, что при подготовке к зимнему периоду происходит изменение фосфолипидного состава мембран животных — увеличение содержания полиненасыщенных жирных кислот в их составе. Такие липиды концентрируются вблизи гидрофобных участков белков и формируют слой так называемых пограничных (аннулярных) липидов, отличающихся от липидов общей фазы мембраны [5]. В этом случае белки окружены более рыхлой упаковкой липидов таким образом, что активность ферментов оказывается на достаточно высоком уровне для поддержания жизнедеятельности клеток этих животных. В настоящее время считают, что контролирование активности большинства ферментов в биомембране осуществляется на уровне молекулярных взаимодействий белка с этим слоем, т.е. за счет локальной липидной регуляции [4, 20]. Липидный состав мембран, от которого зависит и состояние аннулярного слоя белков, влияет на каталитические свойства ферментов. Например, карбоангидраза из мышц кролика [39] проявляет различные кинетические свойства, находясь в связанном состоянии с мембранами различного состава (содержание холестерина различалось в 22 раза). Кинетические параметры каталитического гидрирования СО2 под действием карбоангидразы в различных мембранных фракциях варьируют: Кт от 1,6 до 3,6 мМ; kcat от 230 до 510 с-1. При этом также показана различная способность фермента в разных фракциях к связыванию специфических ингибиторов — изменение значений Ki на два порядка. Можно также привести любопытные данные о влиянии состава мембран голодающих и сытых крыс на способность мембраносвязанной ацилтрансферазы к связыванию специфического ингибитора малонил-CoA [40]. Показано, что в микросомальных мембранах сытых животных сродство этого фермента к ингибитору выше в 2,2 раза. От динамических свойств общей липидной фазы мембран существенно зависит активность ферментов, использующих водонераство-римые субстраты. Известно, например, что холестерин понижает текучесть мембран. Показано, что введение холестерина в культуру клеток НЕК293подавляет активность мембраносвязанной а-секре-тазы предшественника амилоидного белка (см. рис. 3), что, в свою очередь, приводит к значительному понижению уровня секретируемой формы этого белка в культуральной среде [41]. Очевидно, это связано с ограничением латеральной подвижности фермента в мембране [41]. В случае периферических белков некоторые модификации бислоя, напротив, приводят к их активации. Например, при добавлении к мембранным фракциям ионов Са2+ или продуктов перекисного окисления липидов наблюдается активация митохондриальных фосфолипаз [26]. Полагают, что вызываемые этими добавками дефекты упаковки и структурные флуктуации липидов облегчают связывание периферических белков с мембраной. Влияние поверхностного потенциала мембран От поверхностного заряда биомембран зависит электрический потенциал, который определяет локальную концентрацию заряженных субстратов и протонов вблизи мембраны [3]. Влияние поверхностного потенциала может проявляться в сдвиге рН-оптимума активности ферментов, активный центр которых локализован у поверхности мембраны, и в изменении измеряемой величины константы Михаэлиса (Кт) для заряженных субстратов [3]. Для ряда ферментов показана регуляция ферментативной активности изменением поверхностной плотности заряда мембран (митохондриальные мембраны и микросомы клеток печени или мозга белых крыс) [26]. Например, глицерин-3-фосфатдегидрогеназа и арилсульфатаза С активируются при уменьшении, а ацетилхолинэстераза, диметилаланиноксидаза и моноаминоксидаза, напротив, при увеличении плотности отрицательного заряда в мембране. Этот параметр варьировали добавлением к нативным мембранам анионных или катионных детергентов, встраивающихся в липидный бислой мембраны. Анализ кинетических данных во всех случаях подтвердил, что наблюдаемый эффект связан с изменением значений К при сохранении значений V, что указывает на концентрирование заряженного субстрата или продукта реакции вблизи мембранной поверхности [26]. Формирование ферментных комплексов Модуляция активности мембраносвязанных ферментов может происходить вследствие того, что белки в мембранах нередко формируют гомо- и гетерокомплексы [2, 3, 4, 42, 43]. Как правило, они представляют собой нековалентные белковые комплексы, структура которых нарушается при разрушении мембраны и при выделении комплекса в раствор (слабые взаимодействия в таких комплексах могут зависеть даже от ионной силы раствора) [3]. Получены также и стабильные детергент-нерастворимые белковые комплексы, в состав которых входят эктоферменты, обладающие GPI-якорем (например, щелочная фосфатаза, аминопептидаза Р, 5'-нуклеотидаза) и гликоли-пиды [26]. Состояние белковой агрегированности в мембране может определяться несколькими факторами [26, 44]: 1) наличием прямых белок-белковых взаимодействий, способствующих появлению агрегатов; 2) энтропией смешивания белков в липидной фазе, т.к. при агрегации белков энтропия системы уменьшается, то диспергированное состояние белков в мембране является предпочтительным; 3) термодинамической выгодностью сокращения количества пограничных липидов (за счет уменьшения поверхности контакта белка с липидом), что нередко способствует появлению белковых агрегатов [3]. В нативной мембране степень агрегированности белков также зависит от факторов, влияющих на состояние общей липидной фазы. Так, введение холестерина в мембраны эритроцитов и митохондрий приводило к агрегации белков и сопровождалось увеличением упорядоченности липидов общей фазы [42]. Рассмотрим примеры модулирования каталитических свойств мембранных ферментов в результате образования ферментных комплексов. Так, Na+/К+-зависимая АТФаза, находясь в солюбилизиро-ванной (мономерной) форме, связывает меньшее количество ионов К+, чем в мембраносвязанном (димерном) состоянии [2]. Показано, что УДФ-глюкуронилтрансфераза — интегральный гликопротеин I типа — в составе мембран функционирует только в виде гомокомп-лексов. При образовании олигомеров этого фермента в мембране возникают гидрофобные карманы, способствующие концентрированию гидрофобных субстратов и ориентирующие их определенным образом относительно реактивных групп активного центра фермента [45]. Интересным, на наш взгляд, примером влияния комплексообра-зования на каталитические свойства мембранных ферментов является различное поведение мономерной растворимой и олигомерной мембранной полифосфатазы [46]. Методом гельфильтрации показано, что мембранный фермент, обладающий GPI-якорем, в экстракте 0,1% тритоном Х-100 из мембранной фракции митохондрий Saccharomyces cerevisiae присутствует в составе двух белковых комплексов — 120 и 76 кДа, в то время как р-форма полифосфатазы найдена только в виде мономера (36 кДа). Активность фермента, находящегося в составе белкового комплекса, повышалась при увеличении степени полимеризации субстрата (от 9 до 188 фосфатных остатков), а активность мономерного фермента от этого параметра не зависела. Двузарядные катионы активировали мономерную и, напротив, ингибировали олигомерные формы фермента. В то же время однозарядные анионы, активируя олигомеры фермента, не влияли на активность мономерной полифосфатазы. Различия заключались и в том, что сродство мономерной формы к полифосфату-15 и -188 характеризовалось меньшими значениями Кт (в 6 и 17 раз, соответственно), чем аналогичные значения, полученные для олигомерных форм мембранного фермента [46]. В последнее время появляются также данные о существовании специфических механизмов, регулирующих активность мембранных ферментов. Например, активация протеинкиназы С — периферического фермента, участвующего в фосфорилировании мембраносвя-занных белков — происходит только при специфическом связывании с мембраной. При этом одновременно участвуют три подцентра связывания (с форболовыми эфирами или диацилглицеринами, с Са2+ и с фосфатидилсерином), и только при специфическом взаимодействии белка с фосфатидилсерином происходит высвобождение псевдосубстрата из активного центра и активация этого фермента [34]. В целом, функционирование мембранных ферментов зависит от локального окружения и может определяться их взаимодействием с липидными и белковыми компонентами мембран. В настоящее время тонкие взаимодействия такого рода на мембранах исследовать в экспериментах in vivo затруднительно, поэтому для изучения характеристических свойств мембранных ферментов прибегают к методам их очистки и реконструкции с использованием адекватных моделей биомембран. Ниже мы рассмотрим возможности различных модельных систем для проведения таких исследований. Модельные мембранные системы, используемые для реконструкции мембранных ферментов Несмотря на то, что свойства ферментов в системах, моделирующих их мембранное окружение, могут изменяться по сравнению с реальной средой, изучение очищенных и реконструированных ферментов дает большие преимущества. Этот подход позволяет не только охарактеризовать фермент в изолированной системе, но и определить минимальное число компонентов, необходимых для проявления тех или иных биохимических активностей [2, 3, 4, 44]. В мембранологии в настоящее время используется целый ряд систем, предложенных для моделирования биомембран. В их числе:
Большинство из перечисленных систем не находят широкого применения в энзимологии из-за ряда ограничений. Например, в монослойные мембраны можно включать только ферменты, которые функционируют на границе раздела липид-вода. К таковым относятся липазы [3], которые, действуя на мембранные липиды, влияют на площадь поверхности и поверхностное давление монослоя. Встраивание в плоский бислой применяется обычно для характеристики белков, способных увеличивать ионную проводимость мембраны [47]. Чаще всего белки встраивают в везикулы, образованные одинарным фосфолипидным бислоем [3, 48], которые могут служить моделью компартментализации в биологических системах. С помощью этих систем было подтверждено влияние физического состояния мембраны — поверхностного заряда, плотности упаковки липидов (текучести), толщины бислоя, кривизны бислоя, структурных флуктуаций — на активность мембранных ферментов. Так, использование для реконструкции ферментов однослойных везикул, образованных липидами с разной длиной углеводородных цепей или степенью ненасыщенности углеводородных цепей, позволяет изучить соответственно влияние толщины бислоя и текучести мембран на каталитические свойства ферментов. Например, таким образом было показано, что активность цитохрома Р-450 строго зависит от толщины бислоя [26]. В то же время при добавлении в везикулярную систему липидов, не образующих бислойные структуры (таких как фосфатидилэтанол-амин или диацилглицерин), может быть продемонстрирована роль изменения кривизны бислоя. Показано, что при функционировании как интегральных (родопсин, Са2+-АТФаза, цитохром Р-450, мито-хондриальная убихинон-цитохром С редуктаза, дигликозилдиацил-глицерин-синтетаза, маннозилтрансфераза), так и периферических ферментов (фосфолипаза А2, протеинкиназа С) между функцией белка и присутствием в бислойной системе таких липидов существует прямая связь [8]. Например, структурные флуктуации липидов оказываются необходимым условием для активации транспортной Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума [49]. Увеличение содержания в системе липидов, вызывающих образование небислой-ных структур, приводило к резкому увеличению скорости переноса Са2+ внутрь липосом. Скорость гидролиза липидов под действием фосфолипаз А2 и С [26], низкая для ламеллярной упаковки фосфатидилхолина (ФХ) в монослойных везикулах, возрастала при введении в систему диацилглицеринов. Использование суспензии смесей липидов в воде, в которых в зависимости от соотношения компонентов образуются различные агрегаты липидов, в том числе обращенные мицеллы и гексагональные структуры, позволяет выявить оптимальную конструкцию матрицы для функционирования различных ферментов. В частности, для митохондриальной АТФазы, солюбилизированной в водной суспензии смеси ФХ и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), наблюдалась существенная зависимость активности от изменения структуры липидного окружения, определяемого соотношением [ФХ]/[ФЭ] в смеси. В системах с ламеллярной (более 30 % содержания ФХ) и обращенной гексагональной структурой (менее 10 % ФХ) активность фермента была относительно низкой. При этом в области перехода между этими двумя структурами каталитическая активность АТФазы существенно возрастала, достигая своего оптимума в случае, когда в системе основной структурной единицей являлись обращенные мицеллы (при 15% ФХ) [50]. В то же время каталитическая активность маннозилтрансферазы индуцировалась исключительно гексагональной упаковкой липидного окружения в водной дисперсии смеси ФХ и фосфатидилинозитола [51]. Кроме вышеперечисленных методов реконструкции мембранных белков, в энзимологии успешно применяются псевдогомогенные коллоидные системы на основе синтетических ПАВ — структурных аналогов природных липидов (рис. 4) [52]. В таких системах в зависимости от концентрации компонентов могут возникать все структуры, характерные для водных дисперсий мембранных липидов: обращенные и прямые мицеллы, жидкокристаллические структуры, в том числе ламеллярная, прямая и обращенная гексагональная и кубическая упаковки. Пример такой фазовой диаграммы для системы Аэрозоль ОТ—октан—вода приведен на рис. 5 [26]. Принципиально важным достоинством таких систем является возможность целенаправленного варьирования основных физико-химических параметров системы путем простого изменения соотношения компонентов. Гидратированные агрегаты синтетических ПАВ в органических растворителях просты в приготовлении, устойчивы в течение многих часов в присутствии добавленного белка (от 10 до 105 нг/мл) и равновесное состояние в них достигается быстро — минуты [52]. При солюбилизации в такой системе белки включаются во внутреннюю полярную полость агрегатов ПАВ, приобретая оболочку из монослоя гидратированных молекул ПАВ, предохраняющих их от денатурирующего действия органического растворителя. Ферменты при этом не теряют способности к катализу, а динамический характер системы, обеспечивающий быстрый обмен компонентами, позволяет изучать взаимодействия ферментов с различными эффекторами (субстратами, ингибиторами, кофакторами и т.д.) [53]. Эти свойства выгодно отличают этот способ реконструкции от других систем. В настоящее время, очевидно, что исключительно важную роль в регуляции ферментативпой активности играют белок-белковые взаимодействия. Они реализуются, например, при специфическом связывании ферментов с регуляторными белками или образовании мультиферментных и ферментно-транспортньгх комплексов. Для олигомерных ферментов взаимодействие белковых субъединиц не только определяет такие важнейшие свойства, как способность к аллостерической регуляции и др., но часто составляет необходимое условие для проявления самой ферментативной функции. Наконец, даже неспецифические взаимодействия фермента с белками клеточного матрикса могут приводить к существенному изменению его каталитических свойств, и в этой связи в литературе рассматривается возможность регуляции ферментативпой активности в системах, содержащих обратимо адсорбирующиеся ферменты. Следует отметить, однако, что детальное изучение этих факторов ограничивается отсутствием надежных и универсальных подходов, позволяющих регулировать состав исследуемых белковых комплексов: искусственно осуществлять их сборку или, наоборот, разрушение. Так, в частности, в случае олигомерных ферментов разделение на субъединицы in vitro часто наблюдается лишь в денатурирующих условиях, что существенно затрудняет возможность исследования каталитических свойств отдельных субъединиц. Рисунок 2 - Схематическое представление взаимодействия молекулы субстрата или другого реагента (S), распределенного в системе обращенных мицелл с включенными гидрофильным (Ej), поверхностно-активным (Е2) н гидрофобным (Е3) ферментами  Наметкин С.Н. и соавт. [54] полагают, что подобные задачи могут быть решены при использовании в качестве среды для ферментативной реакции систем гидратированных обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях. При солюбилизации в таких системах ферменты включаются во внутреннюю водную полость мицелл (рис. 2), сохраняя при этом каталитическую активность. Размер внутренней полости мицелл можно варьировать в широком диапазоне (от десятка до сотен и более А), изменяя степень гидратации ПАВ (молярное отношение [вода]/[ПАВ] в системе), Таким образом, в обращенной мицелле при различных степенях гидратации может помещаться как одна молекула белка, так и крупные белковые комплексы. Иными словами, обращенные мицеллы могут служить матрицами регулируемого размера для сборки белковых комплексов различного состава. Это обстоятельство может быть использовано, например, для контролируемого синтеза конъюгатов макромолекул. Что же касается кинетических исследований, то принципиальная возможность регуляции активности олигомерного фермента при изменении его субъединичного состава в системе обращенных мицелл была показана на примере лактатдегидрогеназы. По существу лактатдегидрогеназа представляет собой агрегат одинаковых ферментных молекул — она состоит из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых обладает каталитической активностью. Совершенно иной случай — исследуемая в настоящей работе у-глутамилтрансфераза. Этот гетеродимерный фермент образован нековалентно связанными «легкой» п «тяжелой» (Мr 21 ООО и 54 ООО) субъединицами. Имеющиеся в литературе данные указывают на то, что обе субъединицы участвуют в формировании активного центра у-глутамилтрансферазы. Разделение субъединиц традиционными методами в растворах детергентов и с помощью мочевины вызывает потерю ферментом специфической активности. В работе представлены результаты изучения закономерности регуляции активности у-глутамил-трансферазы в системе обращенных мицелл одного из наиболее часто используемых для энзимологических исследований ПАВ — аэрозоля ОТ в октане. Изучена регуляция надмолекулярной структуры и каталитической активности гетеродимеркого фермента — у-глутамилтрансферазы в системе обращенных мицелл аэрозоля ОТ (АОТ) в октане. При использовании в качестве субстратов L- и D-изомеров у-(3-карбокси-4-нитро)анилида глутаминовой кислоты и глицилглицина исследованы катализируемые ферментом гидролазная, аутотрансферазная и трансферазная реакции. Для всех типов реакций зависимости каталитической активности у-глутамил-трансферазы от степени гидратации имеют вид кривых с тремя оптнмумами при [Н20]/ [АОТ] — 11, 17 н 26, когда радиусы внутренней полости мицелл соответствуют размерам легкой (Mr 21000), тяжелой (Мr 54 000) субъединиц у-глутамилтрансферазы и димера (Mr 75 000). Методом скоростной седиментации установлено, что при изменении степени гидратации происходит обратимая диссоциация фермента на легкую и тяжелую субъединицы. Показано, что обе субъединицы обладают способностью катализировать гидролазиуго и трансферазную реакции; аутотрансферазная реакция обнаруживается только в случае тяжелой субъединицы. На зависимостях каталитической активности субъединиц от степени гидратации наблюдается по одному оптимуму: при [Н2О]/[АОТ] = 11 (для легкой) и 17 (для тяжелой субъединиц). При смешении мицеллярных растворов, содержащих легкую и тяжелую субъединицы, обнаруживается третий оптимум, соответствующий дилеру ([Н2О]/[АОТ] = 26) | В работе [55] проведено сравнительное изучение регуляции каталитической активности растворимых и мембранных форм ферментов в системах обращенных мицелл ПАВ в органических растворителях. На примере у-глутамилтрансферазы (в системе обращенных мицелл AGT в октане) и аминопептидазы (в системе обращенных мицелл Бридж 96 в циклогексане) показано принципиальное различие в регуляции каталитической активности растворимых и мембранных форм ферментов. Каталитическая активность мембранной формы существенно зависит от концентрации ПАВ при постоянной степени гидратации, тогда как каталитическая активность растворимой формы не изменяется в этих условиях. Зависимость каталитической активности от концентрации ПАВ можно рассматривать в качестве теста на мембранотропность ферментов. Считается, что ферменты и белки, солюбилизированные в обращенных мицеллах АОТ, проявляют максимальную функциональную активность, когда размер внутренней полости мицелл соответствует или близок размеру солюбилизированного белка [1-7]. В этом случае на экспериментальных зависимостях «активность (νо) - степень гидратации мицелл (Wo)» обнаруживается максимум. Иногда зависимости v0-W0 имеют вид кривой с насыщением, что обусловлено возможной стабилизацией белка в микрогетерогенной системе за счет ассоциации его молекул друг с другом. В ряде работ показано [8-13], что обращенные мицеллы АОТ способны влиять на процессы ассоциации и реассоциации белков в зависимости от их полярности или мембранной активности, которую можно оценить из наклона прямых в координатах «активность-[ПАВ]0» при постоянной концентрации воды [57]. Для некоторых олигомерных ферментов в обращенных мицеллах АОТ на кривых «активность-Wo» наблюдается несколько максимумов [57]. А.В. Левашов и сотр. [53, 58, 59] объясняют их появление включением в мицеллы разного размера активных субъединиц фермента и/или их разных олигомеров. Седиментационный анализ подтвердил эту точку зрения [57]. Однако не для всех олигомерных ферментов в мицеллах АОТ характерно наличие нескольких максимумов на зависимости vo-Wo-каталаза, уреаза и D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из Е. coli [23] обнаружили лишь один максимум активности. Особый интерес представляют данные по влиянию степени гидратации обращенных мицелл АОТ на пероксидазную активность конъюгатов пероксидазы хрена (далее – пероксидаза) с тироксином и стероидами, а также на иммунные комплексы пероксидазы и ее конъюгатов с антителами против самого фермента или стероидов. А.Н. Еремин с соавт. [60] изучили влияние степени гидратации (W0) обращенных мицелл аэрозоля ОТ (АОТ) и его смеси с Тритоном Х-45 в гептане на пероксидазную активность ферритина селезенки лошади в реакциях окисления разных субстратов пероксидом водорода и органическими гидропероксидами, а также на активность растворенных или иммобилизованных иммунных комплексов конъюгата пероксидазы хрена с кортизолом (ПХ-КОР). На зависимостях «пероксидазная активность-W0» обнаружены максимумы при значениях W0, равных 8-14 и 19-22, которые нельзя соотнести с диссоциацией иммунокомплексов на их компоненты или ферритина на субъединицы. Обсуждена возможность стабилизации обращенными мицеллами конформеров олигомерных белков и влияние ассоциации мицелл на пероксидазную активность иммунокомплексов ПХ-КОР и ферритина. Предложен способ выделения железосодержащего кластера из молекулы ферритина без восстановления ионов Fe3+. |
Похожие:
 | Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... |  | Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... |
| Список основных исполнителей по Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 Государственному контракту 14. 740. 11. 1258 от 17 июня 2011 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных... | | Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей» |
| Отчет о научно-исследовательской работе контракт №21/10 от «09» октября... Целью работы является исследование теоретических и практических особенностей существующих систем ротации в правоохранительных органах,... | | Отчет о научно-исследовательской работе по государственному контракту... Русский язык и культура речи: учебно-методический комплекс для студентов очной формы обучения / сост. И. А. Крым; Кузбасский институт... |
| Отчет по государственному контракту от 04. 06. 2012 №1102-01-41/06-12... ... | | Отчет о научно-исследовательской работе по теме: «Разработка научно... «Институт законодательства и сравнительного правоведения при Правительстве Российской Федерации» (ИЗиСП) |
| Отчет о научно-исследовательской работе по теме «Эффективность использования... Отчет по теме № са-12-39 «Эффективность использования отраслевых информационных систем» Минкультуры России | | Отчет о выполненной работе по Государственному контракту №12. 741.... Целью проведения работы является эффективное освоение молодыми исследователями и преподавателями лучших научных и методических отечественных... |
| Отчет №3 о научно-исследовательской работе по теме: «Грид-технологии» Разработка методов эффективного решения задач обработки, хранения, передачи и защиты информации | | Отчет о научно-исследовательской работе Гост 32-2001. Межгосударственный стандарт. Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет о научно-исследовательской... |
| Отчет о научно-исследовательской работе Межгосударственный стандарт (гост 32-2001). Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления (редакция 2005... | | Отчет о научно-исследовательской работе на тему: «Разработка модифицированных... «Разработка модифицированных методов выделения гуминовых веществ для получения биологических препаратов на основе вермикомпоста» |
| Общие положения отчет Отчет о научно-исследовательской работе (нир) документ, который содержит систематизированные данные о научно-исследовательской работе,... | | Отчет по Государственному контракту № «Разработка концепции создания интеллектуальной транспортной системы на автомобильных дорогах федерального значения» |
