Оптимизация аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток периферической крови в лечении пациентов с множественной миеломой шифр
Скачать 1.27 Mb.
|
3.2 Оценка влияния условий продолжительной транспортировки на ГСК В соответствии с задачами исследования, необходимо было оценить влияние температурного режима и низкочастотных вибраций, возникающих при транспортировке, на ГСК нативного трансплантационного материала. Оценивалось влияние различной экспозиции данных факторов на количество и пролиферативный потенциал ГСК, а так же – на цитолиз лейкоцитов. Влияние условий транспортировки на цитолиз лейкоцитов. В ходе исследования обнаружена зависимость динамики степени цитолиза лейкоцитов от температуры при транспортировке. Результаты оценки представлены на рис. 4. Моделирование транспортировки в течение 6 часов при температуре +4°С и при температуре +24°С обеспечило сохранность лейкоцитов близкую к 100%. Через 12 часов при температуре +4°С сохранность лейкоцитов составила уже 87±2,6%, а при температуре +24°С – 96,2±1,18%. Через 24 часа при температуре +4°С она снизилась до 82±3,9%, а при температуре +24°С - до 93,5 ±2,5% (Р<0,01).  Рисунок 4. Динамика изменения цитолитической активности лейкоцитов в зависимости от температурного режима транспортировки. Следовательно, в группах, где моделирование транспортировки осуществлялось при температуре +4 °С, цитолиз лейкоцитов оказался достоверно выше (P < 0,01), чем в соответствующих группах при температуре +24°С – через 12 часов на 9%, а через 24 часа – на 12%. Таким образом, установлено, что температурный режим при транспортировке трансплантационного материала влияет на активность цитолиза лейкоцитов, который возникает при их апоптозе или некрозе. Известно, что зрелые формы лейкоцитов склонны к апоптозу. Апоптоз лейкоцитов может быть как результатом их иммунной активации, так и при отсутствии воспалительной реакции, когда на них не влияют цитокины, ингибирующие апоптоз. Охлаждение выделенных из организма лейкоцитов может нарушать взаимодействие данных лигандов-ингибиторов с рецепторами и активировать апоптоз. При проведении проточной цитометрии мы определяли маркер некроза и позднего апоптоза, исследование раннего апоптоза не выполнялось. Можно предположить, что оценка всех этапов апоптоза при пониженной температуре могла показать еще большую его активность. Несмотря на то, что восстановление кроветворения происходит за счет ГСК, цитолиз лейкоцитов в трансплантационном материале не желателен по ряду причин. Во-первых, возобновление зрелых форм лейкоцитов из трансплантированных ГСК происходит в течение нескольких суток и организм пациентов после ВДХТ в этот период оказывается не защищенным от инфекции. Возможно, введение с трансплантатом жизнеспособных иммунокомпетентных клеток позволяет в ранний посттрансплантационный период временно восстановить иммунный статус. Прямого доказательства значимости данного фактора в литературе не найдено, однако в некоторых исследованиях показано, что срок восстановительного периода у пациентов после ВДХТ зависит, в том числе, от количества лейкоцитов в трансплантационном материале [9]. Во-вторых, цитолиз лейкоцитов не желателен, так как из данных клеток высвобождается большое количество провоспалительных цитокинов, что, по мнению некоторых авторов, обуславливает ряд побочных эффектов при выполнении трансплантации [36; 51]. Таким образом, транспортировку и хранение нативного лейкоконцентрата, предназначенного для аутотрансплантации, предпочтительно выполнять при температуре +24 °С. Влияние условий транспортировки на количество ГСК. Основную часть трансплантационного материала составляют лейкоциты (до 99% клеток), но восстановление кроветворения происходит за счет пролиферации ГСК (1% клеток). Поэтому основным параметром оценки качества трансплантата общепринято считать количество содержащихся в нем ГСК. В нашем исследовании не обнаружено изменения количества ГСК при моделировании условий транспортировки в течение 24 часа. Продолжительность нашего исследования была ограничена сутками, поскольку Приказом Минздрава РФ № 325 «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации» [15] возможность транспортировки ГСК ограничивается 24 часами. Но при увеличении длительности эксперимента более суток можно обнаружить снижение количества ГСК. Так, в исследованиях ряда авторов, снижение количества ГСК наблюдалось через 48 и 72 часа их нахождения в нативном виде при комнатной температуре [19; 20; 21]. В другом исследовании было обнаружено, что уже через 9 часов происходило значительное снижение пролиферативного потенциала ГСК [81]. Учитывая, что именно пролиферативный потенциал отражает способность ГСК к кроветворению, в нашем исследовании, кроме оценки количества ГСК, был выполнен анализ их пролиферативного потенциала. Влияние условий транспортировки на пролиферативный потенциал ГСК. Результаты оценки влияния различных условий транспортировки на пролиферативный потенциал ГСК представлены в таблице 4. Таблица 4. Изменение пролиферативного потенциала ГСК, подвергавшихся, при различной температуре, низкочастотной вибрации с различной экспозицией.
Как видно из приведенных в таблице 4 данных, вибрация и температура не оказывают влияние на пролиферативный потенциал ГСК, подвергшихся этим воздействиям с одинаковой экспозицией. Достоверных различий между группами, находившимися в вышеописанных условиях 6 часов, не выявлено. Так же не выявлено различий в группах с моделированием условий транспортировки при различной температуре в течение 12 и 24 часов. Влияние продолжительности транспортировки на пролиферативный потенциал ГСК. Из результатов, представленных в таблице 4, видно, что продолжительность эксперимента негативно влияет на пролиферативный потенциал ГСК. Учитывая, что температурный режим и вибрация не влияли на пролиферативный потенциал ГСК, группы с одинаковой экспозицией были объединены. Таким образом, была образована контрольная группа с исходным количеством КОЕ (n=40), и 3 опытные группы: транспортировка 6 часов (n= 40), 12 часов (n= 40) и 24 часа (n= 40). Динамика снижения пролиферативного потенциала ГСК в зависимости от продолжительности транспортировки графически представлена на рисунке 5. Достоверное снижение (P < 0,05) пролиферативного потенциала ГСК обнаружено уже через 6 часов моделирования транспортировки. Пролиферативный потенциал в среднем составил через 6 часов 84±6,1%, через 12 часов 63±6,9%, а через 24 часа 38±9,9%. Таким образом, снижение данного показателя составило соответственно – 16±1,2%, 37±4,1% и 62±6,1%.  Рисунок 5. Изменение колониеобразующей активности ГСК в зависимости от продолжительности транспортировки. Примечание. * - P < 0,05, отличия достоверны в сравнении с контролем. Контролем являлось исходное количество КОЕ в образце, принимаемое за 100 %. Линия тренда показывает линейный характер снижения КОЕ в ходе исследования. Таким образом, было показано, что пролиферативный потенциал ГСК начинает снижаться непосредственно после получения трансплантационного материала при сохранении абсолютного количества клеток. Снижение данного показателя характеризует потерю способности ГСК восстанавливать кроветворение после длительной транспортировки нативного трансплантационного материала. В итоге это может влиять на увеличение сроков восстановления кроветворения. Наше исследование позволило показать, что пролиферативный потенциал ГСК снижается по линейной зависимости. Полученная зависимость данного параметра от продолжительности транспортировки позволяет прогнозировать изменение пролиферативного потенциала ГСК, зная время транспортировки. Для рассчета используется формула линейной функции: КОЕ ГСК(%)= k × T+100% где k – угловой коэфициент линии тренда, который равен тангенсу угла этой линии с осью ординат. В нашем случае k = –0,047, Т – время транспортировки в минутах. Результат полученный с помощью данной формулы должен учитываться с поправкой ±7 %, принимая во внимание стандартное отклонение, полученное в эксперименте. Обращает на себя внимание, что полученные нами данные совпадают с рекомендациями, изложенными в «Инструкции по заготовке и консервации донорской крови Минздрава РФ», где сказано что «контейнеры с донорской кровью следует в возможно короткий срок переносить для хранения». В то же время, в приказе Минздрава РФ № 325 «О развитии клеточных технологий в Российской Федерации» [15] указывается возможность транспортировки заготовленной ПК в течение 24 часов. Однако, согласно полученным нами результатам, через 24 часа транспортировки пролиферативный потенциал ГСК составляет только 38,2 % от исходного значения, несмотря на умеренный цитолиз. Следовательно, потерю способности ГСК к кроветворению в процессе транспортировки необходимо компенсировать заготовкой дополнительного количества трансплантационного материала. Для этого целесообразно применение предложенной нами методики прогнозирования, учитывающей негативное воздействие продолжительной транспортировки на способность трансплантационного материала восстанавливать кроветворение. 3.2.1 Метод расчета трансплантационной дозы, учитывающий снижение способности ГСК к восстановлению кроветворения в процессе транспортировки. Пациентам с множественной миеломой рекомендуется заготовить количество ГСК достаточное для двукратной трансплантации, что составляет 6×106 ГСК/кг веса пациента. Если предполагается длительная транспортировка полученных ГСК, как сказано выше, следует учитывать сижение их способности к восстанавлению кроветворения. Поэтому рационально заготовить дополнительное количество ГСК. Результаты исследования позволили разработать способ прогноза способности ГСК восстанавливать кроветворение в зависимости от предполагаемой продолжительности транспортировки (Т в минутах):  Зная полученный КОЕ ГСК, легко рассчитать кратность (К) снижения данного параметра в процессе транспортировки:  Обобщая расчет, получается следующее уравнение:  Что бы определить адекватную трансплантационную дозу необходимо умножить плановую трансплантационную дозу (ТД) ГСК на полученную кратность снижения их пролиферативного потенциала в ходе транспортировки трансплантационного материала. Таким образом, расчет адекватной трансплантационной дозы необходимой для заготовки можно выполнить по следующей формуле:  Описанный метод позволяет еще на этапе выполнения лейкоцитафереза рассчитать требуемую к заготовке трансплантационную дозу ГСК, с целью компенсации снижения их пролиферативного потенциала. 3.2.3 Результаты клинической апробации метода расчета Описанный выше метод, разработанный нами на модели пуповинной крови, прошел апробацию при работе с клиническим трансплантационным материалом. Необходимость апробации была обусловлено тем, что продолжительная транспортировка по-разному может влиять на свойства ГСК пуповиной крови и ГСК периферической крови. Сравнительный анализ фактических результатов, полученных при транспортировке 20 образцов трансплантационного материала, полученных от больных ММ, и результатов прогнозирования приведен в таблице 5. Таблица 5. Результаты фактической и прогнозируемой величины снижения пролиферативной способности ГСК в ходе транспортировки (n=20).
|
Похожие:
 | Комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических... Охватывают весь комплекс по оценке качества криоконсервированных гск пк |  | Эффективность риск-адаптированной терапии острого миелоидного лейкоза... Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии»... |
| Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... | | Приказ Об утверждении регионального стандарта медицинской помощи больным множественной миеломой |
| Реферат: вич инфекция ассоциирована с многочисленными нарушениями... Анемия, нейтропения и тромбоцитопения. Патогенез и подходы к терапии у вич инфицированных пациентов | | 1. Количество подготовленных номинантом: кандидатов наук – 18: Наследникова... Российской Федерации от 17. 12. 2012 №1069н «Об утверждении случаев, в которых возможна сдача крови и (или) ее компонентов за плату,... |
| Урока 8 класс Биология Тема: Строение крови. Переливание крови. Цель... Обучающая: доказать материальное единство живой природы на основе установленной общности в строении клеток в связи с выполняемыми... | | «Применение препарата Офтоципро в лечении инфекционно-воспалительных... «Офтоципро» отмечается положительный терапевтический эффект у 96,05% (73 глаза) пациентов с инфекционно-воспалительными заболеваниями... |
| Конспект урока биологии в 8 классе Тема урока. Внутренняя среда организма.... Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и... |
| Тема: «музыкальное путешествие» Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Уважаемые посетители раздела биология Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... |
| Тема урока: Колокольные звоны России Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Тема урока вокально-хоровая работа в многоголосии Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... |
| План лекции. Введение. История развития трансплантации. Проблема... Тема 11: Этические проблемы трансплантации органов и тканей человека. Этические проблемы ксенотрансплантации | | Математическая морфология. Электронный математический и медико-биологический... Показатели периферической крови как маркёры хронических воспалительных заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта |
