Методы создания и исследования наносистем для биомедицинских применений

Скачать 104.75 Kb.

Название	Методы создания и исследования наносистем для биомедицинских применений
Дата публикации	29.11.2014
Размер	104.75 Kb.
Тип	Методическое пособие

100-bal.ru > Химия > Методическое пособие

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Филиал в г. Пущино

Методическое пособие по практическим занятиям

Методы создания и исследования наносистем для биомедицинских применений.

Москва – 2012

Цель и содеpжaние paботы

Целью пpaктикумa является ознaкомление с совpеменными методaми формирования и исследования биосовместимых наносистем на основе полиэлектролитов, а также создание микрокапсул, содержащих ферменты:

Задачи практикума:

1. Получение пористых сферических микрочастиц CaCO3 ядер для создания полиэлектролитных капсул:

2. Получение полиэлектролитных капсул, загруженных белком.

3. Метод определения концентрации белка.

4. Методы проверки активности фермента.

Время занятий

3 часа на каждую задачу

1.1.Литература

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия / под ред. З.А. Шабаровой; Москва. Изд. «МИР», 1980г., 383стр.

2. Lumry R, Biltonen R, Brandts JF. Validity of the “two-state” hypothesis for conformational transitions of proteins.// Biopolymers, 1966, Р.4,917–944.

3. Lagerberg J.W.M. 1997 Factors influencing binding and efficacy of merocyanine 540 and other photosensitizers. Chapter 3: Cell. Mol. Life Sci. V. 53, P. 257-262, Effect of hydrogen peroxide on the binding of merocyanine 540 to human erythrocytes.

4. Купцов.А.Х., Жижин Г.Н. Фурье-спектры комбинационного рассеяния и инфракрасного поглощения полимеров. Справочник // г.Москва, 2001г., Физматлит. 582 с.

5. Cristiane R. Martins; Giacommo Ruggeri#; Marco-A. De Paoli, Synthesis in pilot plant scale and physical properties of sulfonated polystyrene J. Braz. Chem. Soc. vol.14 no.5 São Paulo Sept./Oct. 2003.

6. Sukhorukov G. B. Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes [Теxt] / G. B. Sukhorukov, E. Donath, S. Moy, A. S. Susha // Microencapsulation. – 2000. – V.17(2) – P.177-185.

Терновский Ю. В. Потенциометрический сенсор на основе уреазы, иммобилизованной в полиэлектролитных микрокапсулах [Текст] / В.И. Терновский, Ю.В. Чернохвостов, М.Г. Фомкина, М.М. Монтрель // Биофизика – 2007. - Т.52. - №5. - С.825-829.
Sukhorukov G. B. Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes [Теxt] / G. B. Sukhorukov, E. Donath, S. Moy, A. S. Susha // Microencapsulation. – 2000. – V.17(2) – P.177-185.

Реферат

Задачи, сформулированные в качестве практикума, фактически являются технологическими этапами создания биосенсора. Технология относится к области диагностики в медицине, в которой используют биосенсорные датчики для определения конкретных метаболитов. Она описывает способ изготовления микрокапсул, содержащих фермент для определения мочевины или перекиси водорода в биологических жидкостях. Микрокапсулы содержат фермент – пероксидазу хрена или уреазу, которые специфически реагируют с метаболитами (перекисью водорода или мочевиной), и затем по конечному продукту регистрируют концентрацию метаболита оптическим или электрическим методом.

Используемые материалы

Полимерные материалы.

Полиэтиленимин (PEI) молекулярная масса 600 000 – 1000 000 (Aldrich);
полиаллиламин гидрохлорид (PAH) молекулярная масса 70 000 (Aldrich);
полистиролсульфонат (PSS), молекулярная масса 70 000 (Aldrich);

Ферменты и буферные растворы

Уреаза - Уреаза состоит из двух субъединиц (α и β), соединённых в димеры, которые, в свою очередь, соединяются друг с другом в тримеры (αβ)3. Тримеры формируют особую сложную структуру ((ab)3)4.

Молекулярная масса: 480 000 а. е. м.
Оптимальный водородный показатель: 7,4
Ферментативная специфика: мочевина и гидроксимочевина
Раствор уреазы - 30 000 МЕ/л.

Уреаза 1: препарат уреазы (жидкий) из аналитического набора Мочевина КТ(200) «ДДС», (ЗАО «Диакон-ДС» , ТУ №9398-002-48813770-2004), с заявленной активностью 253000 Е/л.
Уреаза 2: (EC 3.5.1.5) Type III from Jack Beans(Sigma-Aldrich) с заявленной активностью 29500 Е/г.

Пероксидаза хрена относится к группе двухкомпонентных ферментов, в составе которых гемин, представленный протопорферином IX в комплексе с трехвалентным железом, и полипептидная цепь. Последняя включает от 203 до 308 аминокислот, формирует компактную третичную структуру, представленную двумя доменами (большим и малым). Фермент имеет размер белковой глобулы равный 50 А°, содержащий около 43% α-спиральных участков, ³/₄полипептидной цепи пероксидазы представлены гидрофобными незаряженными аминокислотами, рI равна 1,6. Гемин нековалентно закреплен в углублении полипептидной цепи между доменами, и удерживается там за счет гидрофобных связей и солевого мостика, образованного между остатком пропионовой кислоты гемина с одной из аминогрупп апобелка. Нативный фермент имеет в составе нейтральные и аминосахара в количестве до 20% общего веса. Углеводные цепи предохраняют фермент от инактивации радикалами и увеличивают термическую стабильность. В состав молекулы пероксидазы включены два иона кальция, участвующие в стабилизации третичной структуры молекулы пероксидазы хрена. Высказано предположение, что два иона кальция координируют с аминокислотными остатками (43, 46, 48,50, 64) и (171, 222, 225, 228, 230); в координации железа гемина (Phe-41, Phe-152, His-170, Leu-250) и связывании ароматических субстратов (Ile-180, Phe -221, Ile-244). Активный центр фермента представлен Arg-38, Phe-41, His-42, это область на поверхности белковой глобулы. В дистальной области гемового кармана находятся две молекулы воды.

лиофилизованная пероксидаза хрена (БиоФарм)

молекулярная масса: 44 100 а. е. м.

ферментативная специфика: В реакции пероксидазного окисления, помимо пероксида водорода, в качестве окислителя (первого субстрата) могут выступать органические субстраты — алкилгидропероксиды, пероксибензольные кислоты и др. По отношению ко второму субстрату пероксидаза проявляет меньшую специфичность, поэтому целый ряд электронодонорных соединений могут использоваться в качестве субстратов пероксидазы. Вторичные субстраты пероксидазы растений можно разбить на 3 группы. К первой относят двух электронные доноры электронов (иодид-ион, тиоанизол, стирол – двухэлектронное восстановление). Вторая группа представляет собой достаточно простые одноэлектронные ароматические субстраты (одноэлектронное восстановление). Третья группа – это субстраты, окисляющиеся по цепи переноса электронов(ABTS, IAA) [Газарян с соавт., 2006].
Мочевина о.с.ч. 3-3 (Реахим). ГОСТ 6691-77
Буферный раствор MES (Sigma),
Буферный раствор ТРИС-цитрат (“Sigma”),
ХЕПЕС (“Sigma”)
Агар ГОСТ 17206-84

2.3. Соли

СН₃СО₂Na хч ГОСТ 199-78,
CaCl₂ хч ГОСТ4234-77
Na₂CO₃ хч ГОСТ 83-79
NaCl х.ч ГОСТ 4233-77

Вспомогательные материалы.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72
Мерная посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770-74, 1-го класса точности
Дозаторы пипеточные автоклавируемые с фиксированными и переменными объемами доз 200 ÷ 1000 мм³, одноканальные ДПА по ТУ 9452-003-33189998-2002
Пипетки градуированные стеклянные 1-10; 1-5; 1-1 по ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81)
Ложечки или шпатели-микроложки ШП-180 для взятия навесок.
Бумага фильтровальная "Ф" 12026-76.
Мерный цилиндр стеклянный ГОСТ 23932-90.
Палочка стеклянная.
Пробирка типа эппендорф 1,5 мл , Сертификат соответствия № РОСС RU. ИМО2 В07620

Задача 1.

Получение пористых сферических микрочастиц CaCO3 ядер для создания полиэлектролитных капсул

Приготовление 1 М растворов:

А) 55,5 г СаСl₂ (хч) растворяем в 500 мл бидистилированной воды.

Б) 53 г Na₂CO₃ (хч) растворяем в 500 мл бидистилированной воды.

Доводим растворы до концентрации до 0,33 М (5мл раствора + 10мл бидистилированной воды)

Помещаем 0,33 М хлористого кальция на магнитную мешалку, перемешиваем при Т=20ºС, добавляя постепенно 0,33 М раствор карбоната натрия. Перемешиваем в течение 30 с, с образование воронки при перемешивании. Варьируя скорость перемешивания и молярность растворов, получаем частицы различного размера.

Ставим осаждаться на 10 мин.
Промываем бидистилированной водой, перемешивая.
Ставим осаждаться на 10 мин.
Промываем бидистилированной водой, перемешивая.
Ставим осаждаться на 10 мин.
Промываем бидистилированной водой, перемешивая.
Ставим осаждаться на 10 мин.
Фильтруем и высушиваем под лампой.
Контролируем сферичность частиц и их размеры с помощью микроскопа. Рассчитываем диаметр сфер с помощью программы ScionImage (free).

Задача 2. Получение полиэлектролитных капсул, загруженных белком

1. Готовим растворы полиэлектролитов в деионизованной воде с концентрацией 1мг/мл.

2. Отбираем 100 мкл раствора сферолитов с уреазой в деионизованной воде и добавить в 1.5 мл PАН в пробирку типа эппендорф.

3. Помещаем на 30 на Vortex.

4. Помещаем на 10 мин на шейкер.

5. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

6. Промываем деионизованной водой

7. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

8. Промываем деионизованной водой

9. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

10. Переносим осадок в 100 мкл деионизованной воды в 1.5 мл PSS в пробирку типа эппендорф.

11. Помещаем на 30 на Vortex.

12. Помещаем на 10 мин на шейкер.

13. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

14. Промываем деионизованной водой

15. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

16. Промываем деионизованной водой

17. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

18. Переносим осадок в 100 мкл деионизованной воды в 1.5 мл PAН в пробирку типа эппендорф.

19. Помещаем на 30 на Vortex.

20. Помещаем на 10 мин на шейкер.

21. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

22. Промываем деионизованной водой

23. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

24. Промываем деионизованной водой

25. Центрифугируем при 1000 об./мин в течение 2 мин.

Задача 3. Методы определения концентрации ферментов

Метод Мэрион Брэдфорд

Необходимое оборудование и материалы.

Спектрофотометр SPECORD 40
Магнитная мешалка ПЭ-6100
Секундомер, ГОСТ 5072-79
Кумасси G-250
Ортофосфорная кислота, ч
Спирт этиловый, 96%
Альбумин бычий сывороточный
Кварцевая кювета, 10 мл

Готовим реактив Брэдфорда: 100мг кумасси G-250 растворить в 50ml спирта и добавить 100ml ортофосфорной кислоты, довести до 1л водой и профильтровать через бумажный фильтр.

Метод Мэрион Брэдфорд

Довести объём образца до 0.5ml водой;
Добавить 0.5мл реагента;
Перемешать и ждать развития окраски (от 5', но не больше 30');
Измерить OD₅₉₅ (в 1ml кювете);
Рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой, построенной по БСА
Кюветы после каждого измерения промыть спиртом, т.к. кумасси сорбируется на стекло и завышает показания.

В 100 мкл раствора фермента добавляется 400 мкл реагента Брэдфорда (изначально разбавленный в два раза), выдерживается в течение 25 минут, после чего объем доводится до 1,5 мл деионизированной водой и измеряли оптическую плотность при λ=595. Концентрация белка рассчитывается по калибровочной кривой, построенной по БСА (рисунок 1).

Рисунок 1. Калибровочная кривая по Брэдфорду, построенная по БСА.

Спектроскопический метод определения концентрации белка в капсулах.

Необходимое оборудование и материалы.

Спектрофотометр SPECORD 40
Кварцевая кювета, 10 мл

Спектроскопические методы основаны на взаимодействии электромагнитного излучения с веществом, т.е. на определении характеристик поглощаемого, испускаемого или рассеянного излучения. Спектры поглощения в УФ- и видимой областях содержат как качественную, так и количественную информацию о поглощающем веществе. Последнее и позволяет использовать их в аналитической химии. Поглощение света подчиняется закону Ламберта – Бера:

<>

где D - оптическая плотность, I0 и I - интенсивности падающего и прошедшего через образец света, T - пропускание, e - молярный коэффициент экстинкции, l - длина оптического пути (толщина поглощающего слоя) в см, c - молярная концентрация. Измерив оптическую плотность D, из соотношения D = ecl можно найти концентрацию поглощающего вещества.

Метод определения концентрации белка в растворе при длине волны 280 нм основан на существовании у растворенного белка максимума поглощения при длине волны 280 нм. Белок измеряют непосредственно в растворе, концентрация белка рассчитывается по величине фотометрической абсорбции при 280 нм. На рисунке 5 в качестве примера показана калибровочная линия для пероксидазы хрена.

Рисунок.2. Калибровочная линия, построенная для пероксидазы хрена

Задача 4. Метод проверки активности фермента уреазы

Определение концентрации мочевины потенциометрическим способом.

Необходимое оборудование и материалы:

Уреаза 1: препарат уреазы (жидкий) из аналитического набора Мочевина КТ(200) «ДДС», (ЗАО «Диакон-ДС» , ТУ №9398-002-48813770-2004), с заявленной активностью 253000 Е/л.
Уреаза 2: (EC 3.5.1.5) Type III from Jack Beans(Sigma-Aldrich) с заявленной активностью 29500 Е/г.
Мочевина о.с.ч. 3-3 (Реахим). ГОСТ 6691-77
Стеклянный рН электрода ЭСЛ-11Г-05
Хлор-серебряный электрода ЭВЛ-1М
4-канальный потенцио-микроамперометрический аналого-цифровой усилитель «Рекорд-4»
Термостат U-1 (Германия)
Магнитная мешалка ПЭ-6100
KCl
NaCl
Tris-цитрат

Проверка активности фермента уреазы , находящегося в капсулах, определяется потенциометрическим способом. Для измерения изменения концентрации ионов водорода используется установка, состоящая из стеклянного рН электрода ЭСЛ-11Г-05 и хлор-серебрянного электрода ЭВЛ-1М, соединенного с экспериментальной ячейкой с помощью агар-агарового мостика (3% агар + 3М KCl). Сигнал с электрода подается на 4-канальный потенцио-микроамперометрический аналого-цифровой усилитель «Рекорд-4» с подключением к компьютеру (разработка ИБК РАН), включенный в режиме измерения э.д.с. (или рН). Ячейка, общим объемом 3мл, термостатируется с помощью термостата U-1 (Германия). Температура экспериментальной среды должна составлять 25 ± 1 ^оС. Перемешивание раствора осуществляется с помощью магнитной мешалки.

Процедура измерения концентрации мочевины состоит в следующем. Вначале измерительная ячейка заполняется аналитическим раствором, содержащим определенное количество низкомолекулярной соли и буфера. Затем в нее вводится рН электрод, затем добавляется фиксированное количество микрокапсул с ферментами, а далее после ~ 5 мин. инкубации при заданной температуре, добавляется фиксированный объем раствора мочевины. Регистрируемый (в мВ) щелочной сдвиг рН должен выйти на насыщение примерно через 50 сек.

Полиэлектролитные капсулы имеют диаметр около 3 микрон. Наличие нескольких слоев, отделявших ферменты от внешней среды, предохраняет последние от инактивирования, например, посторонними ферментами или микробами.

Возможность измерения концентрации мочевины стеклянным рН электродом обусловлена следующими свойствами чувствительного покрытия: хорошей проницаемостью полиэлектролитных мультислоев для субстрата (мочевины) и продуктов его разложения уреазой; непроницаемостью этих слоев для фермента; сохранением ферментом, находящимся микрокапсулах, высокой активности; существенным защелачиванием среды при разложении мочевины на углекислый газ и аммиак. В результате должны быть представлены зависимости величины защелачивания среды от концентрации мочевины в анализируемом растворе для уреазы в растворе и в составе ячеистого покрытия электрода.

Добавить документ в свой блог или на сайт

	Гинекологии для студентов 5 курса Исследование функции яичников. Дополнительные методы исследования: биопсия, диагностическое выскабливание, аспирационная биопсия,...		Физика Магистерская программа 011200 07. 68 – "Физика наносистем и наноэлектроника" Области профессиональной деятельности: являются все виды наблюдающихся в природе физических явлений, процессов и структур, в том...
	Пояснительная записка Курс «Физико-химические методы исследования» Курс «Физико-химические методы исследования» преподается в течение 6 семестра (одо), предназначен для магистрантов, обучающихся по...		Примерная программа наименование дисциплины инструментальные методы исследования почв и растений Инструментальные методы исследования почв и растений является предшествующей дисциплиной для следующих дисциплин: история и методология...
	Спектральные методы исследования в биохимии М 545 Спектральные методы исследования в биохимии: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. О. А гусейнов....		Программа для подготовки аспирантов специальности 07. 00. 09 «Историография,... «Историография, источниковедение и методы исторического исследования» (07. 00. 00 Исторические науки и археология) [Электронный ресурс]...
	Методические рекомендации по изучению дисциплины «Методы исследований... Целью освоения дисциплины «Методы исследования в социальной работе» является формирование целостной системы знаний об основных общенаучных...		Программа вступительных экзаменационных испытаний в ординатуру по... Методы исследования пищевода. Рентгенологические методы. Эзофагоманометрия. Фармакодиагностика. Методы выявления гастроэзофагеального...
	Программа дисциплины «История и методы исследования культуры» для... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 033000. 68 «Культурология»...		Программа дисциплины «История и методы исследования культуры» для... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 033000. 68 «Культурология»...
	Программа дисциплины «История и методы исследования культуры» для... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 033000. 68 «Культурология»...		Рабочая программа для студентов направления 011200. 68 Физика магистерская... Удовиченко Сергей Юрьевич. Конструкционные наноматералы. Учебно-методический комплекс. Рабочая программа для студентов направления...
	Программа дисциплины «История и методы исследования культуры» для... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления 033000. 68 «Культурология»...		Памятка по подготовке к лабораторным методам исследованиям лабораторные методы исследования Лабораторные методы исследования служат важным этапом обследования больного. Полученные данные помогают оценке состояния больного,...
	Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка и исследование... «Разработка и исследование новых кристаллических, аморфных и наноструктурированных материалов для сцинтилляционных и люминесцентных...		Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка и исследование... «Разработка и исследование новых кристаллических, аморфных и наноструктурированных материалов для сцинтилляционных и люминесцентных...

Методы создания и исследования наносистем для биомедицинских применений

1.1.Литература

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия / под ред. З.А. Шабаровой; Москва. Изд. «МИР», 1980г., 383стр.

Sukhorukov G. B. Microencapsulation by means of step-wise adsorbtion of polyelectrolytes [Теxt] / G. B. Sukhorukov, E. Donath, S. Moy, A. S. Susha // Microencapsulation. – 2000. – V.17(2) – P.177-185.

Похожие: