БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Выпускная работа по
«Основам информационных технологий»
Магистрантка
кафедры радиационной химии
и химико-фармацевтической
технологии
Сладкова Анастасия Алексеевна
Руководители:
профессор Шадыро Олег Иосифович
ассистент Шешко Сергей Михайлович
Минск – 2008г.
Оглавление
Оглавление 2
Список условных обозначений ко всей выпускной работе 3
Введение 5
Программа «RYC-4,01» 8
Количественный анализ облученных растворов 11
Результаты и обсуждение 18
Заключение 20
Список литературы к реферату 22
Предметный указатель 23
Интернет-ресурсы в предметной области исследования 24
Действующий личный сайт в WWW 26
Граф научных интересов 27
Презентация магистерской диссертации 28
Список литературы к выпускной работе 29
Приложение 30
Список условных обозначений ко всей выпускной работе
АФА – активные формы азота
АФК – активные формы кислорода
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ПОЛ – перекисное окисление липидов
СРФ – свободнорадикальная фрагментация
RYC – Radiation yield calculator
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Реферат
Применение ИТ для оптимизация кинетических исследований в радиационной химии
Магистрантка
кафедры радиационной химии
и химико-фармацевтической
технологии
Сладкова Анастасия Алексеевна
Руководители:
профессор Шадыро Олег Иосифович
ассистент Шешко Сергей Михайлович
Минск – 2008г.
Введение
В последнее время достигнуты значительные успехи в исследовании природы и роли свободных радикалов при функционировании биологических систем. Как правило, свободные радикалы образуются в живом организме в результате естественного метаболизма кислорода и окислительно-восстановительных превращений различных эндогенных субстратов, но могут также образовываться и в ответ на экзогенное воздействие, включая облучение (-, рентгеновское, УФ или видимый свет в присутствии сенсибилизатора). В силу высокой реакционной способности многих свободных радикалов их действие в организме контролируется эндогенными антиоксидантами, а также ферментными антиоксидантными системами. Нарушение систем регуляции свободнорадикальных процессов может приводить к возникновению и развитию различных патологий, в том числе таких как ревматоидный артрит, онкологические заболевания (рак лёгких, желудка и других органов), диабет, гипертония, катарактогенез, гепатит, аутоиммунные заболевания, инфаркт миокарда, ишемия сердца, болезни Паркинсона, Альцгеймера, процессы старения [1,2].
Патогенное действие активных форм кислорода (АФК) и активных форм азота (АФА) связывают с их высокой реакционной способностью по отношению к биологически важным соединениям, в результате чего индуцируются реакции окисления и окислительной деструкции последних. Наиболее исследованными среди процессов повреждения биологически важных молекул являются реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ).
В работах [3-8] рассматривается способность АФК повреждать и другие биологически важные соединения, как за счет окисления, так и в результате индуцирования процессов свободнорадикальной фрагментации (СРФ). Она протекает с участием углеродцентрированных радикалов органических соединений и ключевой реакцией является распад с одновременным разрывом двух связей в β-положении по отношению к радикальному центру. В опубликованных работах приводятся данные, демонстрирующие существенную роль реакций фрагментации органических радикалов при повреждении сахаров и полисахаридов [4], нуклеозидов [5], гидроксилсодержащих аминокислот и пептидов [6], лизо- и сфинголипидов [7], что делает необходимым разработку способов регулирования вероятности их протекания.
К настоящему времени достаточно подробно исследованы закономерности и механизмы свободнорадикальных реакций изомеризации и фрагментации монофункциональных органических соединений. Исследования же в области гомолитических мономолекулярных процессов бифункциональных органических соединений и их производных носят менее систематический характер. Основная часть исследований этого большого класса органических соединений относится к изучению процессов деструкции без разрыва углерод-углеродной (С-С) связи, таких как дегидратация, дезаминирование, образование продуктов окисления и окислительной деструкции. В то же время свободнорадикальные процессы с разрушением углеродного скелета молекул изучены в меньшей степени.
Актуальность исследования гомолитических превращений аминоспиртов и их производных объясняется тем, что данные соединения могут служить низкомолекулярными моделями при установлении свойств биологически важных объектов (аминосахаров, гидроксилсодержащих аминокислот, пептидов, сфинголипидов), интерес к исследованию которых обусловлен их ролью в процессах жизнедеятельности. Изучение свободнорадикальных процессов повреждения таких объектов и возможности их защиты являются одной из наиболее важных задач радиационной химии.
Разрыв С-С связи в биологически важных соединениях может протекать, как по гетеролитическому, так и по гомолитическому пути. Причём оба из них могут осуществятся ферментативно и неферментативно. Это обуславливает важность изучения процессов С-С деструкции и поиска механизмов регулирования их протекания. Поиск фармакологически активных веществ среди соединений, регулирующих вероятность протекания в биосистемах радиационно-индуцированных свободнорадикальных реакций различного типа, является перспективным и может быть широко использован при создании новых лекарственных средств для лечения заболеваний, имеющих свободнорадикальную этиологию.
Кроме того, использование природных (витамины A, E, C) и синтетических (ионол, пробукол) антиоксидантов для блокирования процессов окисления липидов клеточных мембран и других соединений в клинической практике не дает ожидаемой эффективности при лечении патологий, связанных с повышением уровня АФК. Данный парадокс также указывает на необходимость установления новых механизмов повреждения биологически важных соединений при взаимодействии их с активными радикальными интермедиатами.
Программа «RYC-4,01»
Целью моей экспериментальной работы является изучение радиационно-индуцированных свободнорадикальных превращений в водных растворах соединений, содержащих α,β-аминоспиртовые фрагменты, а также установление роли азотцентрированных (N-центрированных) радикалов в гомолитических процессах С-С деструкции таких соединений.
В качестве исследуемых соединений были выбраны низкомолекулярные соединения, моделирующие биологически важные молекулы, содержащие вицинальные амино- и гидроксильную группу, с учётом того, чтобы продукты их деструкции (в том числе и по С-С-связи) легко анализировались с помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ):
1-амино-2-пропанол N,N-диметил-1-амино-2-пропанол  
2-аминобутан 1-амино-3-пропанол
 
3-амино-1,2-пропандиол
А также гидроксилсодержащая аминокислота треонин и её производное:
D,L-треонин метиловый эфир треонина
 
Для изучения свободнорадикальных превращений в этих системах необходимо рассчитать радиационно-химический выход (G, количество образовавшихся в результате косвенного радиолиза молекул на 100 эВ поглощенной энергии), который является основной характеристикой процессов, происходящих в системах под воздействием радиации. На кафедре радиационной химии и химико-фармацевтической технологии группой аспирантов и магистрантов была создана программа для таких расчетов. В связи со спецификой исследований, проводимых на кафедре, использование данной программы вне стен лаборатории не представляет интереса. Поэтому данное программное обеспечение – “RYC-4,01” (Radiation yield calculator 4.01) используется исключительно в лаборатории свободнорадикальных процессов НИИ ФХП БГУ и на кафедре радиационной химии и химико-фармацевтической технологии. Программа позволяет рассчитывать значения радиационно-химического выхода (G) исходя из кинетических кривых концентрация образующегося продукта(с)– поглощенная доза излучения (D).
Благодаря наличию данной программы работа по определению выходов продуктов СРФ (ацетальдегид, формальдегид, ацетон, пропионовый альдегид, гликолевый альдегид, гидроксиацетон) водных растворов исследуемых соединений намного ускоряется. Это позволяет проанализировать большее количество систем.
Программа написана на базе Excel, поэтому нет необходимости подробно останавливаться на особенностях её работы в связи с тем, что пакетом Excel владеют все пользователи в достаточной степени, чтобы использовать данный программный продукт.
Количественный анализ облученных растворов
Для расчета концентраций продуктов деструкции амино- и гидроксилсодержащих органических соединений необходимо сделать калибровку. Для этого готовятся стандартные растворы анализируемых соединений определенной концентрации и проводят их анализ в тех же условиях, в которых впоследствии будут определяться выходы продуктов СРФ.
В качестве примера рассмотрим пошаговое определение радиационно-химического выхода гликолевого альдегида – продукта С-С деструкции 3-амино-1,2-пропандиола, образующегося при -облучении его 0,1моль/л дезаэрированного раствора (pH 11.0):
На рисунке 1 представлена хроматограмма, полученная при анализе карбонильных продуктов СРФ 3-амино-1,2-пропандиола в данных условиях.
Рисунок 1. - Хроматограмма карбонильных продуктов радиолиза деаэрированных растворов 3-амино-1,2-пропандиола.
Шаг 1. Калибровка.
С помощью программы для обсчета хроматограмм, полученных методом ВЭЖХ на хроматографе фирмы Shimadzu, получаем, что концентрации гликолевого альдегида, равной 1.36∙10-5 моль/л, соответствуют площади пиков на хроматограмме, равные 85578, 85473 и 85683. Путем усреднения данных значений получаем коэффициент чувствительности к данному веществу в ячейке G3, равный 6292500000 (единицы в столбце D обозначают, что мы учитываем все три значения, в противном случае, напротив значения площади пика, которое не следует учитывать, ставится нуль).
Шаг 2. Определение концентраций
Зная коэффициент чувствительности, можем определить концентрации гликолевого альдегида в каждой точке. Для этого значения площадей соответствующих пиков записываем в столбце B (вторая вкладка), и программа автоматически в соседнем столбце рассчитает концентрации определяемого продукта. В данном примере площади пиков были равны 0 (данный образец не подвергался облучению), 1365000, 120231, 180561, 239591 и 270852. В итоге имеем следующие концентрации в столбце C: 0, 1.033E-05, 1.911E-05, 2.870E-05, 3.808E-05 и 4.447E-05.
Шаг 3. Определение радиационно-химического выхода
Радиационно-химический выход гликолевого альдегида рассчитывается исходя из таких параметров, как время облучения и мощность дозы. Время облучения каждого образца задается заранее, после проведения эксперимента, с тем условием, чтобы за время облучения накопилось достаточное для анализа количество определяемого соединения. Мощность дозы рассчитывается с использованием ферросульфатного дозиметр Фрике.
Дозиметр Фрике представляет собой 0,0014М водный раствор FeSO4 в 0,4М H2SO4, содержащий 10-3М NaCl и насыщенный воздухом. Для приготовления дозиметрического раствора 0,1г FeSO4∙7H2O (0,1375г соли Мора), 13,75мг NaCl и 5,5мл концентрированной серной кислоты (плотность 1,83 г/см3) растворяют в 0,25л бидистиллированной воды.
Определение Fe3+ проводитсяли спектрофотометрически при длине волны 307 нм на приборе SPECORD M40. На рисунке 2 представлена кинетика накопления Fe3+ в диапазоне длин волн от 200нм до 350нм.
Величину дозы рассчитывали по формуле:
D = A∙(E – E0)∙100/(ε(Fe3+) · G(Fe3+)·f·ρ·l), Гр,
где А – число Авогадро (6,022· 1023моль-1),
Е – оптическая плотность облученного раствора,
Е0 – оптическая плотность необлученного раствора,
ε(Fe3+) – молярный коэффициент экстинкции Fe3+ при 307нм,
G – выход Fe3+ в присутствии кислорода(15,6 иона/100эВ),
f – коэффициент перехода от Гр к электрон-вольтам(6,24·1015),
ρ – плотность дозиметрического раствора (1,024 г/см3),
l – длина кюветы, (1 см).
Рисунок 2. - Кинетика накопления Fe3+ в диапазоне длин волн 200-350 нм.
С поправкой на температуру и упрощением используется следующая формула:
D = 2,80 ∙102 ( E – E0 ) / (1-0,0069 (25 – T)), Гр,
где Т- температура, при которой определяется оптическая плотность растворов, ºС.
Полученные значения дозы используются для построения графической зависимости поглощенной дозы от времени облучения (рис.3). График кинетической зависимости образования Fe3+ при окислении Fe2+ получен по 7 точкам. Время облучения: 0(подъем + опускание штока), 1, 2, 3, 4, 5, 6 минут. Таким образом, коэффициент пропорциональности, полученный методом наименьших квадратов, равен мощности дозы.
Формула для расчета мощности дозы имеет следующий вид:
P = D/t, Гр/с,
где, P – мощность дозы, Гр/с,
t – время облучения, с.
Данную дозиметрию проводили дважды.
Получили среднее значение: P=0,657 ± 0,019 Гр/с.
Рисунок 3. - График зависимости поглощенной дозы от времени облучения в -установке (Co60).
Однако с течением времени мощность установки уменьшается по закону радиоактивного распада и на сегодняшний день мощность дозы составляет порядка 0,45 Гр/с. Поэтому расчет производим именно с данной мощностью.
В данном примере времена облучения составляли в минутах соответственно: 0, 20, 41, 60, 80 и 100. С учетом всех данных получаем в ячейке G3 (третья вкладка) радиационно-химический выход гликолевого альдегида, равный 0,165±0,007.
Это описание примера лишь для одного продукта (гликолевого альдегида) СРФ одного из исследуемых соединений (3-амино-1,2-пропандиола).
Результаты и обсуждение
При действии ионизирующего излучения на разбавленные водные растворы образуются активные промежуточные продукты радиолиза воды (G(eaq-)= 2,8 молекул/100эВ, G(H) = 0,55 молекул/100эВ, G(OH) = 2,8 молекул/100эВ):
Эти частицы инициируют свободнорадикальные реакции растворенного вещества. В исследуемых системах радикалы Н и ОН реагируют с молекулами субстрата, образуя как углерод-, так и азотцентрированные радикалы. В случае простейшей системы 1-амино-2-пропанола при радиолизе водных растворов были обнаружены ацетон, пропионовый альдегид и ацетальдегид. Были предложены следующие схемы образования основных продуктов радиолиза:
Для изучения зависимости выходов этих продуктов от рН проводилось облучение деаэрированных водных растворов с концентрацией 0,1 моль/л при различных рН. Радиационно-химические выходы образования основных продуктов радиолиза, рассчитанные с помощью программы “RYC-4,01”на основе экспериментально полученных данных, представлены на рисунке 4.
Рисунок 4-Зависимость радиационно-химических выходов (молекул/100эВ) образования основных продуктов радиолиза деаэрированных водных растворов аминопропанола (0,1 моль/л) от рН облучаемых растворов и расчётная зависимость доли молекул аминопропанола со свободной NH2-группой от pH раствора.
В случае 3-амино-1,2-пропандиола при СРФ азтцентрированных радикалов в процессе, аналогичном процессу образования ацетальдегида для 1-амино-2-пропанола, образуется молекулярный продукт – гликолевый альдегид:
Фрагментации осуществляется по согласованному механизму с одновременным разрывом двух вицинальных по отношению к радикальному центру связей.
Заключение
В ходе выполнения экспериментальной работы для написания магистерской диссертации были изучены закономерности процессов радиационно-индуцированной гомолитической деструкции 1-амино-2-пропанола, D,L-треонина и его метилового эфира, N,N-диметил-1-амино-2-пропанола, 2-аминобутана, 1,2-пропандиола в водных растворах. Получены данные по радиационно-химическим выходам молекулярных продуктов радиолиза этих соединений в зависимости от рН растворов и других условий облучения. Оценен вклад процессов С-С-деструкции в процесс радиационно-индуцированного повреждения изученных соединений.
Установлено, что разрушение углеродного скелета аминосодержащих соединений происходит при наличии в их молекулах гидроксильной группы в β-положении к аминогруппе. Процесс С-С-деструкции последних протекает за счет фрагментации их азотцентрированных радикалов, которая осуществляется по согласованному механизму с одновременным разрывом двух вицинальных по отношению к радикальному центру связей.
Показано, что вероятность процесса разрыва С-С связи в молекулах соединений, содержащих ,β-аминоспиртовой фрагмент, зависит от состояния аминогруппы. В кислых и нейтральных растворах, в которых преобладает протонированная аминогруппа, вероятность протекания процесса деструкции углеродного скелета мала. С увеличением рН роль этого процесса возрастает и при достижении рН 10-12 процесс С-С-деструкции становится основным.
Установлено, что процесс фрагментации N-центрированных радикалов, образующихся при радиолизе ,β-аминоспиртов и их производных, в зависимости от рН растворов не подавляется либо частично подавляется кислородом.
Показано, что наличие двух алкильных заместителей в аминогруппе не приводит к снижению выхода основного продукта С-С-деструкции аминоспиртов – ацетальдегида, что позволяет предположить возможность протекания процесса деструкции за счет фрагментации аминиевых катион-радикалов, образующихся при переносе электрона от атома азота аминогруппы на ОН-радикал.
Предложен новый механизм образования ацетона при радиолизе водных растворов треонина за счет каскадной свободнорадикальной трансформации гидроксилсодержащей аминокислоты.
Для написания магистерской диссертации планируется провести исследования более сложных систем (3-амино-1,2-пропандиола, О-метилтреонина, 2-дезокси-2-аминоглюкозы, N-ацетил-2-дезокси-2-аминоглюкозы) с различными концентрациями и pH растворов, анализируя при этом различные образующиеся при радиолизе продукты. Поэтому наличие программы “RYC-4,01” существенно упрощает расчеты и позволяет при этом минимизировать количество времени, затрачиваемого для обработки данных, полученных методами ВЭЖХ.
С помощью этой программы получено достаточно большое количество данных, позволяющих выявить основные закономерности протекания радиационно-индуцированных превращений соединений, содержащих ,β-аминоспиртовые фрагменты. Однако еще ряд вопросов требует уточнений и дополнений.
Список литературы к реферату
Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free radicals in biology and medicine. Oxford: University press, 1999.
Katzung G. B. Basic and clinical pharmacology. Mc Graw-Hill: Appleton & Lange. 2000.
Петряев Е.П., Шадыро О.И. Радиационная химия бифункциональных соединений. - Мн: Университетское, 1986.
Edimecheva I.P., Kisel R.M., Shadyro O.I. et al. Homolytic cleavage of the O-glycoside bond in carbohydrates: a steady-state radiolysis study // I. J. Radiat. Res. 2005. №3. v.46. P.319-324.
Lenz R., Giese B. Studies on the mechanism of ribonucleotide reductases // J. Amer. Chem. Soc. 1997. v. 119. P. 2784-2794.
Garrison W.M. Reaction mechanisms in the radiolysis of peptides, polypeptides and proteins // Chemical Reviews. 1987. P.381-398.
Muller S.N., Batra R., Senn M. et al. Chemistry of C-2 glyceryl radicals: indications for a new mechanism of lipid damage // J. Amer. Chem. Soc. 1997. v.119. P.2795-2803.
Предметный указатель
3-амино-1,2-пропандиол 8, 11, 17, 19, 21
RYC-4,01 8, 9, 19, 21
АФА 3, 5
АФК 3, 5, 6, 7
ВЭЖХ 3, 8, 12, 21
Гликолевый альдегид 9, 11, 12, 13, 17, 19
ПОЛ 3, 5
Радиационно-химический выход 9, 11, 13, 17, 18, 19
СРФ 3, 6, 9, 11, 17, 19
Фрике дозиметр 13
Интернет-ресурсы в предметной области исследования
http://www.sciencedirect.com;
Сайт издательства Elsevier. На сайте можно найти практически все статьи по научной тематике. Однако, часто доступны только рефераты, полные версии статей платные.
http://www.elsiever.com;
Данный сайт аналогичен предыдущему, однако в основном представлены медико-биологические журналы.
http://www.e-library.ru;
Российская электронная библиотека, где можно найти множество статей, но в основном российских изданий. Доступ предоставляется только зарегистрированным пользователям.
http://www.abc.chemistry.bsu.by/current/
Сайт создан доцентом кафедры общей химии и методики преподавания химии Белорусского государственного университета А.А. Рагойшей. Тут размещается каталог бесплатных журналов по химии, биохимии и другим областям. Включает две части: постоянно доступные химические журналы и ознакомительные временно доступные химические журналы. В каталоге собрана информация об известных химических научных журналах, предоставляющих бесплатный доступ к полным текстам опубликованных статей.
http://www.vak.org.by
Сайт Высшей аттестационной комиссии Республики Беларусь. Тут можно найти информацию о подготовке научных кадров, присуждении ученых степеней и званий, кратких паспортам специальностей и програмах-минимум кандидатских экзаменов по специальности. В разделе «Каталог файлов» представлены доступные для скачивания файлы нормативных документов с приложениями и шаблоны регистрационных документов.
http://www.google.com;
Самый главный поисковик для любого поиска. Позволяет производить простой поиск по ключевым словам, возможен вариант расширенного поиска по группам, особым признакам (определение, тип файла) и т.д.
http://www.sigmaaldrich.com/;
Портал одного из крупнейших в мире поставщиков химических реактивов и лабораторного оборудования. Огромное множество соединений, предлагаемых на продажу.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?DB=pubmed
PubMed – это информационный ресурс Национального Института Здравоохранения США, состоящий из множества разделов. Он содержит более 16 миллионов цитат из научных журналов биомедицинской и естественнонаучной направленности, начиная с 1950-х годов. Здесь размещаются ссылки на полные тексты статей и другие связанные ресурсы.
http://www.anchem.ru/
Интернет-портал химиков-аналитиков. Представляет разнообразную информацию по аналитической химии: начиная от новостей в мире химии и заканчивая форумами. Здесь размещены ссылки на аналитические журналы, методики, справочные и учебные материалы. На сайте можно найти информацию о вакансиях для химиков-аналитиков и заказах на исполнение аналитических работ или разработку методик определения, а также заказы на решение задач, связанных с аналитикой.
Действующий личный сайт в WWW
www.anfann.narod.ru
Граф научных интересов
магистрантки химического факультета Сладковой А.А.
Специальность: химия высоких энергий
Смежные специальности
02.00.03 –
Органическая химия
|
Изучение строения и свойств органических соединений с использованием химических, физико-химических и физических методов исследования и теоретических расчетов.
|
|
Основная специальность
02.00.09 –
Химия высоких энергий
|
Радиационная химия. Химические процессы, происходящие в различных объектах вследствие поглощения ими ионизирующих излучений:
радиационно-химические превращения воды и водных растворов различных веществ, в том числе и биологически важных;
радиолиз органических и неорганических веществ;
радиационная полимеризация и радиационно-химические процессы в полимерах.
Фотохимия. Химические превращения веществ под действием электромагнитного излучения в ультрафиолетовом, видимом и ближнем инфракрасном диапазонах. Механизмы фотоиндуцированных реакций. Фотохимический синтез и модификация различных веществ. Лазерная химия.
|
|
Сопутствующие специальности
02.00.02 –
Аналитическая химия
|
Разработка и усовершенствование методов и средств анализа конкретных объектов.
|
03.00.04 –
Биохимия
|
Углеводы и их превращения в организме. Гликозиды, аминосахара – их строение, функциональная роль и метаболизм. Дисахариды, гетерополисахариды.
|
03.00.01 –
Радиобиология
|
Молекулярные механизмы биологического действия ионизирующих излучений.
|
|
Презентация магистерской диссертации
http://www.anfann.narod.ru/Present2.pps
Список литературы к выпускной работе
Microsoft Word 2003 в теории и на практике / С.Бондаренко, М.Бондаренко. – Минск: Новое знание, 2004. – 336 с., ил.
http://office.microsoft.com/ru-ru/default.aspx
Гультяев, А.К. MS Office XP 2003. Word, Excel, Access, Outlook, PowerPoint, FrontPage / А.К. Гультяев. – Москва: КОРОНА-Век, 2006. – 64 с.
Болохонов, А.П. Microsoft Office 2003: Краткие инструкции для новичков / А.П. Болохонов. – Москва: Аквариум, 2004. – 128 с.
Access 2000: самоучитель / П.Ю.Дубнев. – М.: ДМК Пресс, 2004. – 313 с., ил.
Excel 2000 / Марк Зайден; науч. ред. А.Плещ, С.Молявко. – М.: Лаборатория Базовых Знаний, 1999. – 328 с., ил.
Microsoft Office XP в целом: наиб. полное рук-во. Для широкого круга пользователей / Ф.Новиков, А.Яценко. – Спб: БХВ-Петербург, 2002. – 917 с., ил.
Microsoft PowerPoint 2003: самоучитель / М.В.Спека. – Москва, Санкт-Петербург, Киев: Диалектика, 2004. – 363 с., ил.
Ваш Office 2000: MS Word, MS Excel, Internet Explorer и др. / С.Баричев, О.Плотников. – М.: КУДИЦ ОБРАЗ, 2000. – 318 с., ил.
Приложение
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
|
