Комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для клинического применения
Скачать 1.71 Mb.
|
| ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток за последние 50 лет прочно вошла в практическую медицину как эффективный метод лечения заболеваний крови, иммунной системы, нарушений обмена веществ и онкологических заболеваний [46;69]. Во всем мире ежегодно количество проведенных трансплантаций увеличивается, а показания к данному виду терапии расширяются. Во многом эффективность алло-ТСГК зависит от наличия гистосовместимого донора ГСК и скорости его подбора. При этом, чем выше результаты индивидуальной совместимости пациента и донора по генам HLA-системы, тем меньше риск отторжения трансплантата в связи с преодолением биологической несовместимости тканей [14;17]. «Золотым» источником ГСК для алло-ТГСК является костный мозг (КМ) от гистосовместимого родственного донора, но вероятность найти внутри семьи HLA – идентичных сиблингов составляет лишь 25%, а найти подходящего неродственного донора, несмотря на наличие более 20 млн. зарегистрированных добровольных доноров костного мозга во всем мире [URL:http://www.bmdw.org/], удается не более чем в 30% случаев [15;21]. Для представителей некоторых групп эта возможность еще меньше, так как часть встречаемых HLA - аллелей и гаплотипов являются общими для этнических популяций; а другие преимущественно принадлежат какой-то одной популяционной группе [7]. Поэтому поиск неродственного HLA-совместимого донора – это весьма трудоемкий и длительный процесс, связанный с существенными временными и финансовыми трудностями. В среднем подбор донора может занимать около 3-4 месяцев, и зачастую пациент просто не доживает до трансплантации [1;51;59;63;80;118]. Другими серьезными проблемами являются тяжелые посттрансплантационные осложнения, которые существенно ограничивают успех алло-ТГСК костного мозга и вызваны несовместимостью иммунокомпетентных клеток донора и реципиента. В первую очередь это отторжение трансплантата и развитие острой реакции «трансплантат против хозяина» (о. РТПХ). Зачастую они носят жизнеугрожающий характер, становясь основными причинами неудач и нежелательных отсроченных явлений. Перечисленные ограничения применения клеток костного мозга привели к поиску альтернативных источников ГСК, и одним из наиболее перспективных является пуповинная кровь (ПК). В течение последних 25 лет ПК активно используется во многих странах мира для лечения пациентов со злокачественными и доброкачественными заболеваниями [57]. Благодаря впервые успешно выполненной родственной алло-ТГСК предварительно криоконсервированной цельной ПК ребенку с анемией Фанкони от HLA-идентичного донора [64] удалось доказать, что одна единица ПК, ранее считавшаяся «биологическим отходом», содержит достаточное количество ГСК и ранних предшественников гемопоэза, способных восстановить кроветворение после миелоаблативной терапии. При этом было показано, что стволовые клетки ПК сохраняют свои биологические характеристики после криоконсервации [35;64]. На сегодняшний день в мире было выдано более 30 000 образцов ПК от родственных и неродственных доноров для проведения алло - ТГСК [21] пациентам с различными заболеваниями (Таблица 1) [27;45;49;50;52;73;77;83;87;89;107;128;135]. Таблица 1 Заболевания, при которых возможно применение гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови
Результаты трансплантаций ГСК ПК, которые были проведены за последние 20 лет, показали, что ПК обладает рядом неоспоримых преимуществ, перед другими источниками ГСК. Во-первых, клетки ПК с иммунофенотипом CD34+/CD38- обладают более высоким пролиферативным потенциалом и имеют более высокий ответ на действие ряда цитокинов (ИЛ-3, ИЛ-6 и КСФ). Они способны воспроизводить в 7 раз больше колоний в долгосрочных культурах, чем аналогичные клетки костного мозга [32;40;70;74;84;85;133]. Во-вторых, риск возникновения и частота развития острой и/или хронической «реакции трансплантат против хозяина» ниже, даже при использовании ГСК ПК от частично совместимых доноров по генам HLA – системы (со степенью совместимости 5/6-4/6), чем при трансплантации ГСК костного мозга от полностью совместимых доноров (со степенью совместимости 8/8) [49;58;81;82;134]. Это объясняется наличием в ПК менее зрелых и менее функционально активных имуннокомпетентных клеток и их более низкой концентрацией по сравнению с другими источниками ГСК. Так, большинство Т-клеток ПК экспрессируют «наивный» иммунофенотип - CD45RA+/CD45RO-, CD62L, в отличие от аналогичных клеток костного мозга и периферической крови. Клетки с иммунофенотипом CD8+ в ПК либо вообще не определяются, либо содержатся в очень малом количестве. [40;130]. СD4+ клетки (Т-хелперы) ПК способны синтезировать интерлейкин- 10 и хемокиновый рецептор-5 (ССR5) в большем объеме, что объясняет противовоспалительные свойства ПК [16;92]. В-лимфоциты ПК в основном презентируют пустые молекулы HLA - антигенов второго класса, в то время как В-лимфоциты взрослых нагружены пептидами. Синтез противовоспалительного интерлейкина-12 мононуклеарными клетками (МНК), являющимся ключевым цитокином для усиления клеточно-опосредованного иммунного ответа и инициации, существенно снижен при сравнении с другими источниками ГСК [130]. В-третьих, заготовка ПК не требует проведения общей анестезии и стимуляции кроветворения гранулоцитарно - колониестимулирующими факторами (Г-КСФ) у донора. Риск для здоровья матери и новорожденного при сборе ПК отсутствует. В- четвертых, возможность длительного хранения большого количества полностью тестированных образцов ПК позволяет в максимально короткие сроки подобрать и доставить необходимые образцы ПК в клинические центры [101,127]. В-пятых, в связи с проведением тщательного вирусологического и бактериального контроля на всех этапах обработки ПК, риск передачи трансмиссивных инфекций при применении криоконсервированных ГСК ПК минимален. В-шестых, использование небольших объемов криопротектора ДМСО для заготовки ГСК ПК приводит к сокращению побочных реакций у реципиента на фоне введения криоконсервированной ПК [120]. Однако в ходе проведенных клинических исследований по применению ГСК ПК [23;64;113] был выявлен и ряд недостатков, который в настоящее время сдерживает ее широкое использование. Прежде всего, это ограниченное количество ГСК в одном образце криоконсервированной ПК и отсутствие возможности повторного сбора клеток у донора. Это существенно ограничивает использование ПК у пациентов с массой тела более 20 кг. Во-вторых, было отмечено увеличение периода миелотоксического агранулоцитоза и тромбоцитопении после алло-ТГСК ПК по сравнению с другими источниками ГСК, что сопряжено с высоким риском развития оппортунистических инфекций [58;113;121]. И в-третьих, отсутствие возможности трансфузии донорских лейкоцитов. Безусловно, выявленные недостатки ограничивают широкое использование ПК в качестве альтернативного источника ГСК. Однако уникальные свойства ее клеток, усовершенствование методов обработки и криоконсервации, внедрение единых стандартов в работу банков ПК, улучшение подборов образцов ПК для клинического применения, возможность использования нескольких единиц ПК при недостаточном количестве ГСК, позволяют надеяться, что некоторые из этих проблем будут разрешены в ближайшем будущем. Во многих лабораториях мира продолжаются многочисленные исследования, направленные на изучение микроокружения и взаимодействия между собой стволовых клеток ПК, идет поиск путей увеличения количества ГСК в одном образце ПК, как за счет усовершенствования методов забора, так и за счет разработки методов их экспансии in vivo и/или ex vivо [39].
Для обеспечения систематического сбора, тестирования, обработки, хранения, организации подбора и выдачи образцов ПК для клинического применения были созданы банки ПК. История развития банков ПК началась с лаборатории микробиологии и иммунологии штата Индиана (США) под руководством профессора Broxmeyer H.J., который стал инициатором развития данной программы. В его лаборатории на хранение были заложены первые образцы ПК от родственных доноров. Были разработаны методы сбора и хранения цельной ПК, которые продемонстрировали возможность транспортировки образцов ПК между различными центрами, оценили биологические свойства ГСК и их пролиферативный потенциал [16;31]. В последующем, с ростом числа алло-ТГСК ПК, для расширения коллекции криоконсервированных образцов ПК и улучшения качества подборов пары донор-реципиент, появилась необходимость развития программ по безвозмездному донорству и открытию государственных банков ПК [119]. Первые государственные банки ПК появились в начале 90-х годов Нью-Йорке, Милане и Дюссельдорфе [20], а в последующем и во многих странах мира. В Нью-Йоркском центре крови под руководством Р. Rubinstein, был разработан первый протокол по обработке, криоконсервированию, хранению и разморозке криоконсервированных образцов ПК [120], который до настоящего времени является основным документом при заготовке ПК во многих странах мира. Сегодня по данным Всемирной организации доноров костного мозга (Bone Marrow Donors Worldwide – BMDW) в различных странах мира насчитывается 158 государственных банков ПК где на криохранении находится более 600 000 полностью тестированных образцов ПК [URL:http://www.bmdw.org/; 87;102;124;136]. В связи с появлением большого числа банков ПК в 1998 году была учреждена группа NETCORD, призванная обеспечить соблюдение условий криохранения ПК, в соответствии со стандартами GMP (Good Medical Practice), создать международную сеть и облегчить поиск доноров ГСК ПК, улучшить качество трансплантационного материала и стандартизировать их в международном масштабе, и, что особенно важно, установить процедуры аккредитации банков ПК совместно с Международным Фондом Аккредитации Клеточной Терапии (FACT) [URL:http://www.netcord.org/]. В 2000 году группой NETCORD-FACT впервые были разработаны международные стандарты для аккредитации банков ПК по сбору, обработке, тестированию, заготовке, подбору и выдачи образцов ПК для клинического применения – International Standards for Cord Blood Collection, Processing, Testing, Banking, Selection and Release [URL:http://www.factweb.org/]. В настоящее время в мире 18 банков ПК уже получили аккредитацию в NETCORD-FACT и еще 40 находятся на стадии регистрации [URL:http://www.netcord.org/,109]. Таким образом, на сегодняшний день вся информация о доступных криоконсервированных образцах ПК, заготовленных в банках ПК, содержится в двух взаимосвязанных международных регистрах: в NETCORD - информация только о криоконсервированных образцах ПК, и во всемирной организации доноров костного мозга (BMDW), где содержится информация как о донорах костного мозга, так и о доступных единицах ПК [102]. Первостепенной задачей, которая стоит перед современными банками ПК является усовершенствование методов забора, выделения, криоконсервирования, хранения и разморозки ПК, с соблюдением контроля качества на каждом этапе согласно стандартам NETCORD, чтобы обеспечить трансплантационные центры высококачественным и безопасным материалом с максимальным количеством жизнеспособных стволовых клеток. Это приведет к дальнейшему прогрессу в области клеточной терапии и позволит улучшить клинические результаты [110].
Учитывая, что наиболее существенным ограничением широкого использования ПК является лимитированное количество ГСК в одном образце ПК, которое строго коррелирует с объемом заготовленного материала [1;12;140], основной задачей на данном этапе является сбор максимально возможного количества стволовых клеток для получения качественного трансплантационного материала [112;117]. Как правило, объем ПК, подлежащей обработке и дальнейшему криоконсервированию, устанавливается в каждом банке индивидуально в соответствии с программами их работы и требованиями трансплантационных центров [102]. Однако, учитывая, что скорость восстановления гемопоэза после трансплантации ГСК ПК напрямую зависит от количества заготовленных ГСК [62;135], большинство банков ПК предпочитают оставлять на долгосрочное криохранение образцы с чистым весом более 40-70 г и количеством выделенных ядросодержащих клеток (ЯСК) не менее 3х107/кг [58;64;135]. Сбор ПК осуществляется после получения информированного согласия роженицы, рождения ребенка и отделения его от последа в закрытые системы для сбора крови с гемоконсервантом CPDA (цитрат-фосфат-декстроза-аденин) [URL:http://www.netcord.org/; 120]. На сегодняшний день в литературе практически отсутствуют данные о влиянии гемоконсерванта CPDA на качество ГСК ПК. Единственное исследование, которое было проведено польскими исследователями, выявило умеренную токсичность CPDA на CD45+/CD34+ клетки при увеличении времени его взаимодействия с ПК [93]. Транспортировка ПК должна осуществляться при температуре от +4С до +22С; обработка полученных образцов проводится не позднее, чем через 24 часа от момента сбора, так как при увеличении сроков хранения жизнеспособность ГСК существенно снижается [URL:http://www.netcord.org/; 13;31;32;126] Первоначально, для обработки ПК и выделения ЯСК использовали протоколы, разработанные для выделения МНК КМ. При этом ПК подвергалась криоконсервированию без предварительной обработки сразу после добавления криоконсерванта ДМСО. Это позволяло сохранить до 100% ЯСК [31], однако привело к ряду существенных проблем [120]:
После проведения серий успешных трансплантаций ГСК ПК, получения доказательств ее эффективности и безопасности, во многих банках ПК начались разработки по модификации протоколов криоконсервирования. В 1995 году в качестве основного протокола обработки ПК для клинического применения, был предложен неавтоматический метод (ручной способ) сепарации ПК, основанный на увеличении скорости седиментации эритроцитов путем добавления к цельной ПК 6% гидроксиэтилкрахмала с последующим двойным центрифугированием на низких скоростях и сепарацией ЯСК [26;48;71;106;120]. Данный метод позволил сократить объем цельной ПК до 20 - 21 мл с сохранением до 90% ЯСК в жизнеспособном состоянии, существенно сократить объемы вводимого криоконсерванта, уменьшить финансовые затраты на криохранение [86;112;120]. На сегодняшний день ручной способ обработки пуповинной крови остается одним из наиболее распространенных во многих странах мира. Современным направлением при обработке ПК стало использование автоматических систем для выделения ЯСК, которые значительно сократили время процедуры, практически полностью исключили риск микробиологической контаминации и потери образца. В настоящее время наиболее распространены две технические системы – «Sepax» (Biosafe, Eysins, Switzerland) и «AutoЕхpres» (Termogenesis). Они представляют собой закрытые стерильные системы для обработки образца ПК любого объема. Принцип действия аппаратов основан на сепарации клеточных элементов путем центрифугирования на низких скоростях после добавления гидроксиэтилкрахмала («Sepax») или без него («AutoЕхpres»). Это позволяет разделять компоненты крови в соответствии с их плотностью и размерами. После центрифугирования эритроциты перемещаются в отдельный стерильный мешок, плазма остается в обрабатываемом контейнере, а полученный лейкоконцентрат в объеме 21 мл помещается в специализированный контейнер для дальнейшего криоконсервирования. Автоматический метод с использованием «Sepax» позволяет сократить уровень исходного гематокрита до 36-45%, сохранить до 80-87% ЯСК и до 86% клеток с иммунофенотипом СD45+/CD34+ [URL:http://www.biosafe.ch/; 86;116]. Эти результаты были подтверждены и в работах отечественных авторов при сравнении эффективности автоматического и неавтоматического методов сепарации крови [7]. В проведенных на сегодняшний день исследованиях не достаточно представлены данные о влиянии величины гематокрита после лейкоконцентрации на качество криоконсеврированных ГСК ПК после размораживания. Существует единственная публикация о влиянии величины гематокрита в криоконсервированных образцах ПК на жизнеспособность и пролиферативную активность ГСК после разморозки. В своем исследовании группа ученых показала, что в криоконсервированных образцах ПК с величиной гематокрита 45% пролиферативная активность ГСК снижалась до 40% по сравнению с образцами ПК с величиной гематокрита 23% [108]. В 2012 году отечественными авторами было проведено исследование о влиянии методов двойного центрифугирования (55 образцов ПК) и автоматической сепарации (30 образцов ПК) на качество ГСК ПК после размораживания. Замораживание образцов ПК осуществлялось в программном замораживателе с последующим погружением в дьюар с жидким азотом. В результате исследования при сравнении обеих групп было показано преимущество использования автоматического метода выделения ЯСК. Процент сохранения СD45+ и СD45+/CD34+ клеток составил 91,7% и 91,34% против 82,1% и 85,27% соответственно; жизнеспособность ЯСК 89,3% против 82,7%) [12]. Таким образом, на данном этапе обработки ПК, независимо от применяемого метода лейкоконцентрации, первостепенной задачей является заготовка качественного трансплантационного материала с сохранением максимального количества ГСК в биологически полноценном состоянии [112;117]. |
Похожие:
 | Оптимизация аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых... Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального... |  | Обеспечение качества получения и клинического применения компонентов... Игра викторина "Самый умный" проводилась среди учащихся 8 классов в рамках декады естественных наук |
| Эффективность риск-адаптированной терапии острого миелоидного лейкоза... Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии»... | | Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и... |
| Урока 8 класс Биология Тема: Строение крови. Переливание крови. Цель... Обучающая: доказать материальное единство живой природы на основе установленной общности в строении клеток в связи с выполняемыми... | | Системный подход к банкированию пуповинной крови для восстановительной медицины «Восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия» |
| Извлечения из европейского законодательства в области биотехнологии Регулирование наночастиц. Регулирование исследования стволовых клеток и клонирования. Основные международные соглашения, европейские... | | Конспект урока биологии в 8 классе Тема урока. Внутренняя среда организма.... Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... |
| Тема: «музыкальное путешествие» Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Уважаемые посетители раздела биология Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... |
| Тема урока: Колокольные звоны России Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Тема урока вокально-хоровая работа в многоголосии Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... |
| This small review focuses on some approaches to animal transgenesis... Данный реферат посвящен обзору подходов к генетической модификации животных, таких как лентивирусный трансгенез, выключение генов,... | | Методические указания к лабораторной работе по курсу «Технология... Цель работы: практическое знакомство со стандартными методами определения качества вина: органолептическая оценка качества вина... |
| Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... | | Вместо предисловия подарите мне холст, научите меня рисовать Цель работы: практическое знакомство со стандартными методами определения качества вина: органолептическая оценка качества вина... |
