Проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами 03. 00. 15 генетика
Скачать 344.26 Kb.
|
| На правах рукописи КРУГЛОВА АННА АЛЕКСАНДРОВНА проявление родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель: доктор биологических наук,Серов Олег Леонидович Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессорКикнадзе Ия Ивановна кандидат биологических наук, Сукоян Марина Александровна Ведущее учреждение: Институт биологии генаРАН, г. Москва Защита диссертации состоится «___»_________ 2009 года на утреннем заседании диссертационного совета Д-003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383)3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан «___» _________ 200 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук А.Д. Груздев ВВЕДЕНИЕ Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой плюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, мало изучены масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию дифференцированного генома до плюрипотентного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998), или путем слияния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) c соматическими клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; Serov et al., 2001; Ambrosi, Rasmussen, 2005). Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005; Vasilkova et al., 2007). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСК соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности – ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК Mus musculus domesticus и тимоцитов M. musculus molossinus (Tada et al., 2001; 2003;). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов от слияния ЭСК человека с фибробластами (Cowan et al., 2005). Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их плюрипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Причины доминирования свойств ЭСК на данный момент не выяснены, поэтому крайне важно установить факторы, влияющие на доминирование плюрипотентности в гибридных клетках. Следует отметить, что для изучения молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме, и репрограммирования генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. Однако данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002), гибридные клетки мыши типа ЭСК-дифференцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСК-спленоциты, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al., 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2003; Пристяжнюк и др., 2005). В связи с этим, актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов репрограммирования, трудно переоценить. Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Однако на данный момент имеется очень мало сведений о получении химерных животных, полученных при введении около-тетраплоидных плюрипотентных клеток (Tada et al., 2001; Ying et al., 2002; Pells et al., 2002). Кроме этого, в данных работах нет доказательств сохранения исходного около-тетраплоидного кариотипа клеток при развитии химерного животного. Таким образом, в данной работе впервые проведен анализ хромосомного состава потомков около-тетраплоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюрипотентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрограммированием хромосом дифференцированной родительской клетки или с их потерей. Цели и задачи исследования. При выполнении работы преследовалась следующая цель: исследовать влияние плоидности соматического партнера на морфологию и свойства гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с ди- и тетраплоидными фибробластами. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Научная новизна и практическая значимость.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на II конгрессе общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), IV International Meeting Stem Cell Network North Rhine-Westphalia (Дюссельдорф, 2007), 3rd International Conference Basic Science for Medicine (Новосибирск, 2007), LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology (Колд Спринг Харбор, 2008). Материалы диссертации изложены в трех статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 х глав, выводов, списка литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 102 х страницах, иллюстрирована 12 ю рисунками и содержит 8 таблиц МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использованы культуры клеток: - линию ЭСК E14Tg2aSc4TP6.3 из линии мышей 129/Ola (“зеленый белок”, ГФРТ-, устойчива к пуромицину. Линия была любезно предоставлена доктором Остином Смитом (University of Edinburgh); - первичные культуры эмбриональных фибробластов (линия мышей DD/c M. musculus); первичные культуры фибробластов из взрослой мыши (линия мышей DD/c M. musculus); линия тетраплоидных эмбриональных фибробластов (линия мышей DD/c M. musculus); - четыре независимых клона гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и эмбриональных фибробластов мышей линии DD/c M. musculus: tef3, tef4, tef6, tef9; - одиннадцать независимых клонов гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и фибробластов, выделенных из взрослой мыши линии DD/c M. musculus: taf2, taf4, taf5, taf8, taf10, taf15, taf16, taf20, taf22, taf23, taf31; - одиннадцать независимых клонов гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК линии E14Tg2aSc4TP6.3 и тетраплоидных фибробластов мышей линии DD/c M. musculus: tef-t1, tef-t3, tef-t4, tef-t7, tef-t8, tef-t9, tef-t10, tef-t12, tef-t18, tef-t22, tef-t27; - пять культур первичных эмбриональных фибробластов из пяти химерных эмбрионов, полученных при инъецировании гибридных клеток клона taf5 в бластоцисты мышей C57BL/6J; - культуры первичных фибробластов из кожи двух взрослых химерных мышей, полученных при инъецировании гибридных клеток клона tef4 и taf2 в бластоцисты мышей C57BL/6J: Культивирование эмбриональных стволовых и гибридных клеток, проводили по методу, описанному ранее (Matveeva et al., 1998; 2005). Условия культивирования фибробластов, слияния клеток описаны в работе Кругловой с соавторами (Круглова и др., 2008). Активность щелочной фосфатазы выявляли стандартным способом (Vasilkova et al., 2007). Для иммунофлуоресцентного анализа экспрессии генов Nanog, Oct4, коллагена I-го типа (Col-1) и фибронектина (Fbn), клетки фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (Kruglova et al., 2008). Использовали следующие разведения антител (Abcam, Великобритания): против NANOG (1:200); OCT4 (1:500); COL-1 (1:1000); FBN (1:500); фаллоидин, конъюгированный с флуорохромом Alexa Fluor 546 – 1:100; антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 546 (goat anti-rabbit IgG conjugated Alexa Fluor 546; Molecular Probes, США) – 1:300. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Germany) и программного обеспечения WinView software (Rooper Scientific Photometrix). Количественный анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Col-1 и Fbn проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Суммарную РНК из клеточных линий и клонов гибридных клеток выделяли с помощью Trizol Reagent (Invitrogene, США) согласно рекомендациям производителя. Для синтеза кДНК использовали набор реактивов ImProm II Reverse Transcription System (Promega, США) по методу производителя. Концентрацию полученной кДНК доводили до 100 нг/мкл. Для проведения ПЦР-РВ в объеме 50 мкл использовали: 1х реакционную смесь (KCl, Tris-HCl (pH 8.8), 7.5 мM MgCl2, дезоксинуклеотидтрифосфаты, глицерин, Tween 20, Taq ДНК-полимеразу и пассивный референсный краситель ROX) (Синтол, Россия), 900 нМ прямого и обратного праймеров, 250 нМ зонда, меченого по 5’ концу флуорохромом (карбоксифлуоресцеин, FAM) и несущего на 3’ конце поглотитель флуоресценции BHQ (Black Hole Quancher), 20 нг кДНК и воду. В качестве эндогенного контроля использовали набор праймеров и зонд для анализа уровня экспрессии гена 18s рРНК (TagMan Endogenous Controls; Applied Biosystems, США). Для каждого образца реакция была проведена 3 раза. Готовую реакционную смесь по 50 мкл наносили на 96-луночное плато (ABI PRISM 96-Well Optical Reaction Plate With Barcode; Applied Biosystems, США), лунки закрывали оптически прозрачными крышками (ABI PRISM Optical Caps, 8 caps/strip; Applied Biosystems, США) и помещали в амплификатор (ABI Prism 7000 Sequence Detection System; Applied Biosystems, США). Условия проведения реакции: 10 мин 95ºС, затем - 40 циклов 95ºС – 15 с. и Тотж.ºС (Табл. 1) – 60 с. Результаты ПЦР реакции анализировали с помощью программного обеспечения ABI Prism 7000 v1.1 SDS сравнительным методом (2-ΔΔСt) относительного количественного анализа. Выделение ДНК проводили с помощью DNAzol согласно рекомендациям производителя (Life Technology, США). Для дискриминации хромосом линия мышей 129/Ola M. musculus и линия мышей DD/c M. musculus в гибридных клетках использовали метод ПЦР анализа аллельных вариантов микросателлитов (Круглова и др., 2008). Препараты метафазных хромосом готовили по стандартному протоколу, следуя методу, описанному Фантес с соавторами (Fantes et al., 1995) в модификации (Nesterova et al., 1998) и окрашивали DAPI. Для идентификации хромосомных перестроек использовали метод гибридизации in situ с дигоксигенин- или ФИТЦ- мечеными зондами, специфичными для хромосом Х, 4, 6 и 17. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Germany), пакета прикладных программ ISIS3 (In Situ Imaging System) компании MetaSystems GmbH. Таблица 1. Последовательность нуклеотидов праймеров и зондов, использованных при проведении ПЦР-РВ
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и... |  | Комплексная оценка качества криоконсервированных гемопоэтических... Охватывают весь комплекс по оценке качества криоконсервированных гск пк |
| Оптимизация аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых... Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального... | | Реферат: вич инфекция ассоциирована с многочисленными нарушениями... Анемия, нейтропения и тромбоцитопения. Патогенез и подходы к терапии у вич инфицированных пациентов |
| Наука о клетках структурных и функциональных единицах почти всех... Правилам землепользования и застройки на территории муниципального образования «Город Псков» 6 | | Извлечения из европейского законодательства в области биотехнологии Регулирование наночастиц. Регулирование исследования стволовых клеток и клонирования. Основные международные соглашения, европейские... |
| Эффективность риск-адаптированной терапии острого миелоидного лейкоза... Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии»... | | Меланома кожи Меланома кожи чрезвычайно злокачественная опухоль, развивающаяся из меланоцитов пигментных клеток, продуцирующих специфический полипептид... |
| This small review focuses on some approaches to animal transgenesis... Данный реферат посвящен обзору подходов к генетической модификации животных, таких как лентивирусный трансгенез, выключение генов,... | | Заседание рк: «План работы школы по теме «Организация партнёрства оу семья» Организация деятельности классных родительских микрогрупп, родительских комитетов |
| «Разработка технологий получения, культивирования стволовых клеток... Регионального отделения общероссийской организации малого и среднего бизнеса «Опора России» Фридман Е. М., руководитель Пермского... | | Всероссийская олимпиада школьников по обществознанию 2007/2008 гг. Региональный этап. 10 Класс Ответы вписывайте в специально отведенные для этого места. Рядом с заданиями в специальных клетках указывается максимальное количество... |
| Всероссийская олимпиада школьников по обществознанию 2007/2008 гг. Региональный этап. 9 Класс Ответы вписывайте в специально отведенные для этого места. Рядом с заданиями в специальных клетках указывается максимальное количество... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Рядом с заданиями в специальных клетках указывается максимальное количество баллов, которое может быть выставлено за каждое задание.... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... ... | | Структура и механические свойства гибридных композиционных материалов... Структура и механические свойства гибридных композиционных материалов на основе портландцемента и ненасыщенного |
