Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с диабетической полинейропатией при сахарном диабете типа 1
Скачать 423.41 Kb.
|
| *Среднее ± S. D. (стандартное отклонение) Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), используя при этом следующие разделы: MapView (расположение этих полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфизмах). Для подбора праймеров и рестриктаз использовали пакеты программ DNAStar и VectorNTI 9.0. Идентификация аллелей полиморфных маркеров проводилась с использованием полимеразной цепной реакции, дальнейшего расщепления фрагментов ДНК рестриктазами и электрофоретического разделения фрагментов ДНК в 8-12%-ном полиакриламидном геле или в 2-3% –ном агарозном геле. 2. Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–594)CC и Pro72Arg гена TP53 с ДПН при СД типа 1. Белок р53 играет важную роль в регуляции транскрипции и поддержании геномной стабильности, взаимодействуя со многими клеточными белками. Показано, что повреждение ДНК способствует накоплению р53, который, в свою очередь, блокирует прогрессию клеточного цикла в фазе G1, препятствуя, таким образом, репликации ДНК до репарации повреждения. Если репарация повреждения невозможна, то белок р53 запускает механизм апоптоза (Kastan et al., 1991). При стрессах и повреждениях клеток активность и содержание р53 в них повышается. Также было показано, что активация р53 может происходить на фоне окислительного клеточного стресса, вызванного NO. Кроме того, активация p53 ведёт к изменению экспрессии генов некоторых секретируемых факторов, в результате может изменяться размножение и миграция не только поврежденной клетки, но и окружающих её клеток. При этом, находясь в стрессовой конформации, p53 в значительной степени утрачивает активности, стимулирующие рекомбинацию или репарацию ДНК (Копнин, 2001; Чумаков, 2000). Такой белок р53 значительно более стабилен (т.е. значительно увеличивается его количество в клетке) и эффективно активирует и/или репрессирует специфические гены-мишени, следствием чего является индукция в аномальных клетках либо остановки клеточного цикла, либо апоптоза. Ген TP53 расположен на хромосоме 17q13.1. В этом гене и во фланкирующих его областях обнаружен ряд полиморфных участков, в том числе однонуклеотидный полиморфизм G/C, которому соответствует аминокислотный полиморфизм Pro/Arg (rs1042522) в положении 72 полипептидной цепи (Бухман и соавт., 1988; Ara et al., 1990) и полиморфизм, обусловленный встраиванием остатка С в положении –594 от точки инициации транскрипции (rs17881686). Использование ряда экспериментальных моделей (животные и линии клеток) позволило установить, что белок р53 может быть вовлечен в патогенез диабетических осложнений. Так, на мышах линии NOD было показано, что гипергликемия приводит к апоптозу, опосредованному белком р53 (Adeghate, 2004; Keim et al., 2001). Кроме того, на экспериментальных моделях установлено, что апоптоз играет существенную роль в развитии диабетической ретинопатии (Barber et al., 1998) и нейропатии (Russell et al., 1999). Изучение ассоциации полиморфных маркеров Pro72Arg и C(–594)CC гена TP53 с ДПН при СД типа 1 на других популяциях ранее не проводилось. Проведенные на зарубежных популяциях исследования с использованием полиморфных маркеров гена ТР53 в основном посвящены изучению генетической предрасположенности к раку (Granja et al., 2004; Papadakis et al., 2002). В нашей работе частоты аллелей полиморфного маркера С(–594)CС в группах «ДПН+» и «ДПН–» были следующими: аллель СС – 0,110 и 0,146, аллель С – 0,890 и 0,854 соответственно. Частоты генотипов: в группе «ДПН+»: СС/СС – 0,000, С/СС – 0,220, С/С – 0,780; в группе «ДПН–»: СС/СС – 0,000, С/СС – 0,292, С/С – 0,708 (табл. 2). Этот полиморфный маркер расположен в промоторной зоне гена ТР53 и может, предположительно, влиять на регуляцию транскрипции. Однако различия в распределении частот аллелей и генотипов в сравниваемых в нашей работе группах не были статистически достоверными. Таким образом, полиморфный маркер С(–594)CС гена TР53 не ассоциирован с ДПН при СД типа 1 в русской популяции г. Москвы. Частоты аллелей полиморфного маркера Pro72Arg в группах «ДПН+» и «ДПН–» составили: аллель Pro – 0,330 и 0,491, аллель Arg – 0,670 и 0,509. Известно, что в различных популяциях частота аллеля Pro составляет от 0,17 (среди саамов Швеции) до 0,63 (у негров Нигерии) (Beckman et al., 1994). В большом популяционном исследовании, проведенном в России, частота аллеля Pro составила 0,307 у белоруссов и 0,246 у русских из г. Смоленска (Khrunin et al., 2005). Наблюдаемые нами в группах больных СД типа 1 частоты аллелей данного маркера близки к полученным в этом популяционном исследовании. Таблица 2. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера С(–594)CС гена TP53 в группах больных сахарным диабетом (СД) типа 1 с наличием («ДПН+») и отсутствием («ДПН–») диабетической полинейропатии
Распределились частоты генотипов следующим образом: в группе «ДПН+»: Pro/Pro – 0,160, Pro/Arg – 0,340, Arg/Arg – 0,500; в группе «ДПН–»: Pro/Pro – 0,301, Pro/Arg – 0,381, Arg/Arg – 0,319 (табл. 3). Таблица 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера Pro72Arg гена TP53 в группах больных сахарным диабетом (СД) типа 1 с наличием («ДПН+») и отсутствием («ДПН–») диабетической полинейропатии
Сравнительный анализ выявил достоверные различия частот аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в группах «ДПН+» и «ДПН–». При этом риск развития патологии оказался связан с носительством аллеля Arg (OR = 1,96; CI = 1,32 – 2,90) и генотипа Arg/Arg (OR = 2,14; CI = 1,23 – 3,73). Аллель Pro, напротив, ассоциирован с пониженным риском развития ДПН (OR = 0,51; CI = 0,34 – 0,76), так же как и генотип Pro/Pro (OR = 0,44; CI = 0,23 – 0,86). Белок р53 содержит несколько функционально значимых доменов (Ko & Prives, 1996). Полиморфный маркер Pro72Arg расположен в домене, обогащенном остатками пролина, который образован аминокислотными остатками 61 – 94. Этот домен содержит повторы РХХР, где Р – остаток пролина, а X – любой аминокислотный остаток (Zhu et al., 1999). Домен, богатый пролином, по-видимому, участвует в регуляции транскрипции ряда генов, вовлеченных в индукцию апоптоза. Так, богатый пролином домен белка р53 (Venot et al., 1998) вовлечен в регуляцию транскрипции гена PIG3, белковый продукт которого гомологичен ряду оксидоредуктаз и участвует, предположительно, в апоптозе, зависимом от р53. Делеции в этом домене влияют на транскрипцию гена Р85 (Yin et al., 1998), белковый продукт которого, регуляторная субъединица киназы PI3K, вовлечен в апоптоз при окислительном стрессе, зависимом от р53 (Walker & Levine, 1996). Домен, богатый пролином, необходим также для взаимодействия р53 с киназой Chk2 в ответ на повреждение ДНК (Berger et al., 2005). В зависимости от того, какой аминокислотный остаток находится в положении 72 полипептидной цепи белка р53, меняется способность р53 запускать апоптоз (Thomas et al., 1999). В частности, белок р53 с остатком Arg в положении 72 более эффективно вызывал индукцию апоптоза, и его количество в митохондриальной фракции превышало почти на порядок количество белка р53, содержащего остаток Pro (Dumont et al., 2003). Результаты нескольких популяционных исследований ассоциации полиморфного маркера Pro72Arg гена TP53 с рядом заболеваний нервной системы противоречивы. Так, в китайской популяции выявили ассоциацию аллеля Pro этого полиморфного маркера с развитием нейропатии при первичной открытоугольной глаукоме (Lin et al., 2002). Наследственная нейропатия зрительного нерва Лебера раньше развивалась у японцев, гомозиготных по аллелю Arg (Ishikawa et al., 2005), т. е. генотип Arg/Arg так же, как и в нашей работе, служил фактором риска развития нейропатии. В то же время, в одной из недавних работ, проведенной в Кувейте (Alkhalaf et al., 2007), обнаружено отсутствие ассоциации этого маркера с диабетом и ишемической болезнью сердца (эти заболевания имеют много общих факторов риска, связанных с метаболическими нарушениями). Полученные в нашей работе результаты позволяют говорить об ассоциации полиморфного маркера Pro72Arg гена TP53 с ДПН у больных СД типа 1 русских жителей г. Москвы. Ассоциация этого полиморфного маркера с ДПН свидетельствует о важной роли белка р53 в патогенезе данного осложнения СД. Представлялось интересным сравнить нам данные с результатами аналогичных работ, полученными на других популяциях. Однако наша работа представляет собой первую попытку оценить вклад гена ТР53 в развитие ДПН при СД типа 1 в русской популяции г. Москвы. 3. Исследование ассоциации полиморфного маркера T(–786)C гена NOS3 с ДПН при СД типа 1. Ген NOS3 расположен на хромосоме 7 в области q36 (Marsden et al., 1993; Robinson et al., 1994) и состоит из 26 экзонов. В экзонах и интронах этого гена был обнаружен ряд полиморфных участков, из которых в большинстве исследований использовали два: минисателлит в интроне 4 (ecNOS4a/4b), состоящий из 4 (аллель 4a) или 5 (аллель 4b) повторяющихся единиц длиной 27 п.н. (Miyahara et al., 1994), и однонуклеотидный полиморфизм (G/T) в положении 894 в экзоне 7, которому соответствует аминокислотный полиморфизм в положении 298 (Glu298Asp) (Shimasaki et al., 1998). Кроме того, в единичных работах использовался полиморфный маркер Т(–786)С, расположенный в области промотора в положении –786. В одной из работ было показано, что полиморфизм T(–786)C гена NOS3 ассоциирован с развитием ранних проявлений заболевания коронарных артерий (Alvarez et al., 2001). Исследователи предположили, что более всего подвержены ранним проявлениям этого заболевания носители генотипа CC, вероятно, из-за нарушения функции эндотелия. В этой же работе было показано совместное влияние генотипов NOS3-CC и ACE-DD (фермент, превращающий ангиотензин I) на риск развития ранних проявлений заболевания коронарных артерий. На русской популяции г. Москвы была показана ассоциация полиморфного маркера Т(–786) гена NOS3 с развитием диабетической нефропатии при СД типа 1. Риск развития диабетической нефропатии в этом случае был существенно выше у носителей генотипа СС, по сравнению с носителями генотипов ТС и ТТ (Носиков, 2004). В японской популяции была обнаружена ассоциация полиморфного маркера ecNOS4a/4b гена NOS3 с диабетической нейропатией у больных СД типа 2. У больных с ДПН содержание аллеля 4а и генотипа 4а/4а и 4а/4b связано с повышенным риском развитием данной патологии, в то время как, носительство аллелям 4b и гомозигот 4b/4b является защитным фактором (Tanaka et al., 1998). В нескольких работах было показано, что полиморфизм ecNOS4a/4b ассоциирован с уровнем нитросоединений (нитратов и нитритов) в крови, напрямую связанным со скоростью выработки NO эндотелием сосудов. У австралийцев и японцев, гомозиготных по аллелю 4a, содержание нитросоединений было понижено (Wang et al., 1997; Tsukada et al., 1998). В условиях окислительного стресса под действием перекисей и свободных радикалов кислорода резко падает содержание окиси азота в плазме, что способствует развитию патологических изменений в сосудах и прогрессированию атеросклероза. Таким образом, с высокой степенью вероятности можно сделать вывод о том, что ген NO-синтетазы клеток эндотелия (NOS3) вовлечен в развитие не только сердечно-сосудистых патологий, но и связан с генетической предрасположенностью к сосудистым осложнениям при СД типа 1 и 2. В нашей работе аллели полиморфного маркера Т(–786)С выявляли после расщепления амплифицированного фрагмента длиной 273 п.н., содержащего полиморфный участок, рестриктазой MroNI. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Т остается нерасщепленным, в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель С расщепляется на фрагменты размером 172 и 101 п.н. (рис. 1).  | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Иммунотерапия при сахарном диабете 2 типа, осложненном синдромом... Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский... | | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп “Государственный научно-исследовательский институт... |
| Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт... | | Течение беременности при сахарном диабете. Заболевания щитовидной железы и беременность |
| Количественная и качественная характеристика сульфатированных гликозаминогликанов... Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии... | | История изучения сахарного диабета В истории научных представлений о сахарном диабете можно выделить смену следующих парадигм.[4] |
 | Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная... | | Исследование полиморфизма генов ариламин n-ацетилтрансфераз и ассоциации... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) |
| Методическая разработка для студентов по дисциплине «Сестринское... «Сестринский процесс при сахарном диабете» подготовлена с учетом требований государственного образовательного стандарта по дисциплине... | | Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной... Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте... |
| Полиморфные маркеры генов-кандидатов и генетическая предрасположенность... Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт... | | Протокол общего годового собрания Ассоциации предприятий мебельной... ... |
| Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) | | Внимание! Эта книга о диабете предназначена для взрослых больных Работа выполнена при поддержке ргнф, проект 06-06-00449а «Структура и диагностика личностного потенциала» |
| Итоги регистрации кандидатов на выборах 8 сентября 2013: между борьбой за легитимность Именно так произошло в Екатеринбурге и Владивостоке, где налицо стратегия по размыванию голосов протестного электората и кандидатов,... | | Применение дискриминантного анализа для классификации ээг больных диабетической энцефалопатией На догоспитальном этапе при непосредственном неврологическом обследовании пациента с мозговым инсультом предварительный вывод о том,... |
