Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме
Скачать 493.57 Kb.
|
Рис. 1. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. (a) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала - 500 нм, увеличение 12000 раз; (б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита здорового донора. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АГ – Аппарат Гольджи, ЭПР – эндоплазматический ретикулум. Стрелками показаны микроворсинки и псевдоподии. Большая часть Т-лимфоцитов больных легкой формой астмы обладает характерными морфологическими признаками Т-клеток, однако часть лимфоцитов имеет не значительные морфологические отличия по сравнению с контрольной группой (рис. 2, а). Для всех Т-лимфоцитов данной группы характерно наличие правильной овальной формы. Однако плазматическая мембрана, в отличие от контрольной группы, образует инвагинации. Ядра лимфоцитов, как и сами клетки, имеют овальную форму, ярко выраженный лопастной вид. Хроматин ядра – конденсированный и расположен по его периферии. В цитоплазме различимы клеточные компоненты. На АСМ-изображениях Т-лимфоциты данной группы больных, также как и на ТЭМ-микроснимках, имеют правильную округлую форму с достаточно крупным ядром, которое занимает почти весь объем клетки (рис. 2, б). Ядро имеет овальную форму и расположено эксцентрично. В сравнении с лимфоцитами контрольной группы, у Т-клеток больных легкой формой астмы отсутствуют клеточные микроворсинки, но сама клеточная мембрана формирует различные инвагинации. На поверхности плазматической мембраны глобулярная структура выявляется более отчетливо, чем в контрольной группе. Количество глобул увеличивается, но размер их уменьшается (20,5±5,5 нм; р<0,05) (рис. 2, в).
Рис. 2. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой формой атопической бронхиальной астмой. a) Микрофотография типичного Т-лимфоцита больного легкой формой АБА, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала – 1 мкм, увеличение 12000 раз; б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита больного легкой формой астмы. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия. Мы можем предположить, что подобная структура связана с появлением различных белков на поверхности клеток, например, маркеров активации CD4+ лимфоцитов или белков-адгезии (L-селектинов), экспрессия которых увеличивается при бронхиальной астме (Simon, 2010). В группе больных тяжелой формой астмы наряду с нормальными клетками, встречаются Т-лимфоциты с морфологическими изменениями (рис. 3, а). Обнаруживаются глубокие инвагинации ядерных мембран, изменения цитолеммы и поверхностных структур клетки, отсутствие микроворсинок и десмосом. Клеточная поверхность формирует многочисленные выросты, выявляются блеббинги. Отмечено наличие везикул с электронно-светлым содержимым, мультиламеллярных телец, а также аутофагосом с содержимым средней электронной плотности. Целостность мембран Т-лимфоцитов не нарушена.
Рис. 3. Микрофотографии Т-лимфоцитов периферической крови больных тяжелой формой атопической бронхиальной астмой. a) Микрофотография типичного Т-лимфоцита больного тяжелой формой астмы, полученная с помощью электронной микроскопии. Шкала – 500 нм, увеличение 12000 раз; б) Микрофотография типичного Т-лимфоцита, полученная с помощью атомно-силовой микроскопии; в) Изображение поверхности Т-лимфоцита больного тяжелой формой астмы. Я – ядро, ХР – хроматин, М – митохондрия, АГ – Аппарат Гольджи, АФ – аутофагосома, БЛ - блеббинг. АСМ-исследование Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы показало, что эта группа характеризуется наличием как нормальных клеток с типичной сферической формой, так и с выраженными морфологическими изменениями (рис. 3, б). Клеточная мембрана образует многочисленные глубокие инвагинации, микроворсинки и псевдоподии отсутствуют. Ядро также формирует инвагинации. Сканирование поверхности Т-лимфоцитов больных тяжелой формой астмы показало, что, также как и в группе с легкой формой, имеется большое количество глобулярных структур, но они большего размера (47,1±11,3 нм; р<0,05). В то время как у измененных клеток глобулы становятся трудноразличимыми, диффузионными, а их количество уменьшается (рис. 3, в). Топографические и наноструктурные изменения Т-лимфоцитов в группе с тяжелой формой астмы могут быть связаны с перестройкой цитоскелета и / или более массовой активацией Т-клеток, чем у больных с легкой формой заболевания. Для взаимодействия клеточных и гуморальных компонентов между собой необходимо участие молекул адгезии. При воспалении происходит повышенная экспрессия молекул адгезии в очаге воспаления, что приводит к аккумуляции и задержке лимфоцитов в бронхах. С помощью метода атомно-силовой микроскопии была определена сила адгезии на поверхности Т-лимфоцитов у больных с разной степенью тяжести астмы. Считая линейной зависимость силы от смещения кантилевера относительно поверхности клетки, сила адгезии F (измеряемая в наноньютонах, нН) определяется согласно закону Гука:
При исследовании Т-лимфоцитов в различных группах нами были получены значения силы адгезии на поверхности Т-клеток и выявлена прямая корреляционная зависимость между значением силы адгезии F и степенью тяжести заболевания (рис. 4). Было установлено, что с увеличением тяжести астмы происходит увеличение силы адгезии на поверхности Т-лимфоцитов. Таким образом, можно предположить, что повышенная аккумуляция Т-лимфоцитов на стенках бронхов может быть обусловлена молекулами адгезии и межмолекулярным взаимодействием и, как показано в проведенном эксперименте. Полученные результаты исследований могут быть полезны для дальнейшего понимания взаимосвязи между топографией клеток (механическими свойствами плазматической мембраны) и функцией Т-лимфоцитов в иммунном ответе. С целью выяснения характера нарушений программированной гибели Т-лимфоцитов при бронхиальной астме и влияния на данный процесс синтетического глюкокортикоида - дексаметазона – на следующем этапе работы было проведено исследование выраженности спонтанного и индуцированного апоптоза в Т-лимфоцитах пациентов после 3 и 6 дней культивирования in vitro. Оценка апоптоза Т-лимфоцитов периферической крови больных легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмой Для изучения биохимических параметров апоптоза, инициация которого происходит в процессе длительного культивирования клеток, было необходимо оценить, во-первых, динамику роста Т-лимфоцитов на 3 и 6 сутки культивирования. И, во-вторых, исследовать влияние дексаметазона (индуктора апоптоза) на рост клеток в культуре. Сравнительный анализ показал, что в группе с легкой формой астмы динамика роста Т-лимфоцитов в целом совпадает с группой контроля (рис. 5). Однако мы установили, что, несмотря на добавление в питательную среду дексаметазона, клетки больных легкой формой астмы проявляли устойчивость к апоптозу, что выражалось в незначительном снижении количества Т-лимфоцитов под влиянием глюкокортикоида на 3 сутки культивирования (рис. 5, а). На 6 сутки культивирования содержание Т-клеток в группе с легкой формой астмы было достоверно выше по сравнению с группой контроля. Падение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки культивирования связано со снижением содержания питательных веществ в среде, вследствие чего в клетках происходит активация программы гибели (рис. 5, б). Таким образом, изменение содержания Т-лимфоцитов в группе с легкой формой заболевания относительно контрольной группы на 6 сутки культивирования может быть связано с подавлением апоптоза, что согласуется с литературными данными (Бойчук, 2001; Spinozzi, 2008). Однако установленные изменения могут быть проявлением активации другого физиологического процесса – аутофагии, которая способствует выживанию клеток в условиях снижения питательных веществ. Изменение динамики пролиферативной активности было также выявлено в группе с тяжелой формой астмы (рис. 5). В отличие от здоровых доноров и больных легкой формой астмы, у больных с тяжелой формой содержание Т-лимфоцитов относительно 0 суток практически не менялось как на 3, так и на 6 сутки культивирования (рис. 5, а, б). Незначительное повышение количества Т-клеток к 3 суткам говорит о снижение пролиферативной активности клеток. А слабое падение содержания Т-лимфоцитов на 6 сутки, так же как и в группе с легкой формой заболевания, может быть связано с устойчивостью клеток к апоптозу, либо с активацией аутофагии.
Рис. 5. Изменение содержания Т-лимфоцитов в группах контроля (К) и больных бронхиальной астмой с легкой (Л) и тяжелой (Т) формами астмы в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10-4М) на 3 (а) и 6 сутки (б) культивирования. Изменение динамики пролиферативной активности в зависимости от тяжести заболевания может быть обусловлено активацией апоптотического процесса. Спонтанную инициацию апоптоза можно наблюдать уже в первые дни культивирования, однако, она не значительна. Поэтому мы провели исследование биохимических параметров апоптоза Т-лимфоцитов до их культивирования (рис. 6). Результаты показали, что содержание апоптотических клеток во всех исследуемых группах не превышает 2% от общего количества лимфоцитов.
Рис. 6. Содержание Т-лимфоцитов с ранними (а) и поздними (б) признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмы, а также в группе контроля (К) до культивирования в присутствии и отсутствии дексаметазона (Д) (10-4М). Длительное культивирование лимфоцитов в питательной среде сопровождается истощением ростовых факторов, вследствие чего запускается апоптоз. Исследование основных биохимических параметров апоптоза (экспрессия фосфатидилсерина на плазматической мембране и фрагментация ДНК) проводилось на 3 и 6 сутки культивирования. Оценка экспрессии фосфатидилсерина (ФС) на поверхности клеток на 3 сутки культивирования показала, что содержание Т-лимфоцитов с ранними признаками апоптоза достоверно ниже (p<0,05) у больных астмой (рис. 7, а). Инкубация с дексаметазоном индуцировала транслокацию фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на внешнюю, инициируя, таким образом, ранние этапы апоптотического процесса, однако динамика существенно различалась между лимфоцитами различных групп (рис. 7, а). Наиболее высокое содержание апоптотических клеток отмечено в группе контроля. Индуцирующее влияние дексаметазона на апоптоз также отмечено в группе с легкой формой астмы. В группе с тяжелой формой под влиянием дексаметазона содержание клеток с ранними признаками апоптоза оказалось наименьшим. Продолжение культивирования Т-лимфоцитов в питательной среде в течение 6 суток показало относительную резистентность к развитию апоптоза в группах с легкой и тяжелой формой заболевания, в то время как в контрольной группе отмечено достоверное повышение содержания апоптотических клеток (рис. 7, б). Культивирование клеток с дексаметазоном привело к увеличению содержания апоптотических клеток во всех исследуемых группах (рис. 7, б). Содержание Т-лимфоцитов, находящихся на поздней стадии апоптоза, после 3 суток культивирования было не значительным во всех исследуемых группах (рис. 8, а). Добавление дексаметазона стимулировало апоптоз в Т-лимфоцитах, за исключением группы больных тяжелой формой астмы, в которой клетки проявляли слабую чувствительность к индуцированному апоптозу.
Рис. 7. Изменение содержания Т-лимфоцитов с ранними признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмой, а также в группе контроля (К) в процессе культивирования в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10-4М). а) Содержание Т-лимфоцитов после 3 дней культивирования; б) Содержание Т-лимфоцитов после 6 дней культивирования.
Рис. 8. Изменение содержания Т-лимфоцитов с поздними признаками апоптоза в группах больных легкой (Л) и тяжелой (Т) формами атопической бронхиальной астмой, а также в группе контроля (К) в процессе культивирования в присутствии и отсутствии в питательной среде дексаметазона (Д) (10-4М). а) Содержание апоптотических Т-лимфоцитов после 3 дней культивирования; б) Содержание апоптотических Т-лимфоцитов после 6 дней культивирования. На 6 сутки культивирования установлено повышение содержания клеток с поздними признаками апоптоза в контрольной группе (рис. 8, б). В группах с легкой и тяжелой формами астмы содержание апоптотических клеток оказалось достоверно ниже (p<0,05). Культивирование Т-лимфоцитов больных астмой с дексаметазоном в течение 6 суток оказало слабую стимуляцию апоптоза (рис. 8, б). Поскольку были получены противоречивые данные относительно динамики пролиферативной активности Т-лимфоцитов и установлено угнетение апоптотического процесса у больных АБА, на следующем этапе работы мы провели изучение другого типа ПКГ – аутофагии. |
в
Похожие:
 | На модели т-лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой Казанский (Приволжский) федеральный университет, Институт фундаментальной медицины и биологии, кафедра биохимии | | Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной... Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте... |
| Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе Работа выполнена в гоу впо «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному... | | Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе Работа выполнена в гоу впо «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному... |
| Клинико-морфологическое обоснование периодической гипобарической... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная... |  | Начала пить воду, прошла очистку организма, клеточное питание. На... С трех месячного возраста начались высыпания на щеках. Потом сыпь распространилась по всему телу в виде крапивницы. Три года хождения... |
| Курса «Общая психология» (разделы «Потребности и мотивация, эмоциональная... Выписка из образовательного стандарта по дисциплине «Общая психология» (часть стандарта) | | Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных |
| Реферат Объем документа Целью работы является определение области применения, структуры профиля, типов данных для которых при файловом обмене должны использоваться... | | Классификация типов уроков В педагогической литературе нет единой классификации типов уроков. Чередов И. М. выделяет девять, Онищук В. А. шесть, Махмутов М.... |
| Возможности реабилитации детей с бронхиальной астмой в условиях специализированного... Концепции современного естествознания являются основополагающей естественно-научной дисциплиной при подготовке экономистов, юристов,... | | Психология эмоциональных состояний и их регуляция у детей младшего... Д. 212. 216. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора психологических / педагогических наук при гоу впо «Поволжская... |
| В. С. Ротенберг Функции парадоксального сна и регуляция моноаминов... Функции парадоксального сна и регуляция моноаминов головного мозга. Приложение концепции поисковой активности1 | | Поурочное планирование по разделу Объяснять роль клеточной теории в формировании ес тественно-научной картины мира |
| Урок математики в школе примерное содержание: Урок, его структура.... Примерное содержание: Урок, его структура. Основные требования к уроку. Построение уроков основных типов. Система подготовки учителя... | | Цитогенетический статус и фенотипические свойства лимфоцитов периферической... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю... |
