Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе
Скачать 343.37 Kb.
|
На правах рукописи Стариков Юрий Витальевич Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе 03.00.04 – биохимия 14.00.16 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск-2008 Работа выполнена в ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Ведущая организация: ГОУ ВПО Красноярская государственная медицинская академия Росздрава Защита состоится «__» __________ 2008 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 при Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ биохимии СО РАМН Автореферат разослан «__» __________ 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Русских Г.С. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Окислительный стресс характеризуется избыточным накоплением в тканях активных форм кислорода (АФК), приводящих к повреждению нуклеиновых кислот, белков и липидов. В физиологических условиях АФК участвуют в развитии «респираторного взрыва», синтезе гормонов, процессах пролиферации клетки [Владимиров Ю.А., 2000; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Наряду с этим АФК рассматриваются в качестве внутриклеточных мессенджеров, участвующих в регуляции метаболизма клетки. Универсальным участником регуляторных процессов в клетке является оксид азота. На организменном уровне основные эффекты оксида азота проявляют себя в поддержании тонуса сердечно-сосудистой системы, участии в синаптической передаче, регуляции воспалительного ответа и апоптоза клеток [Маеда Х., Акаике Т., 1998; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2000]. Апоптоз является важнейшим механизмом контроля клеточных популяций в многоклеточном организме [Kerr J.F.R., 1972]. Активация программированной клеточной гибели напрямую связана с развитием окислительного стресса. Активные формы кислорода вызывают открытие пор во внутренней митохондриальной мембране, набухание матрикса и разрыв внешней мембраны митохондрий с освобождением проапоптотических белков (AIF, Smac, прокаспаза 9, цитохром с) из межмембранного пространства в цитозоль [Yi J. et al., 2002; Лущак В.И., 2007]. Выход цитохрома с приводит к резкому повышению внутриклеточного содержания АФК и активации каспазного каскада [Green D.R., Reed J.C., 1998; Gordon D.M., 2000]. Важнейшим радикалом, участвующим в регуляции апоптоза, является радикал оксид азота (NO). Уникальная химическая природа и большое число внутриклеточных мишеней для NO оставляют открытым вопрос, каким образом опосредуется регулирующее влияние оксида азота на апоптоз в условиях окислительного стресса [Choi B.M. et al., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. С одной стороны, известно, что оксид азота способен подавлять синтез белка Bcl-2 и увеличивать экспрессию Bax в митохондриях, провоцируя повышение проницаемости митохондриальной мембраны и выход в цитоплазму клетки АФК [Hortelano S. et al., 1997; Bruene B., 1999; Лущак В.И., 2006; Кулинский В.И., 2007]. Сильный окислитель пероксинитрит, образующийся при взаимодействии оксида азота с супероксиданионом, индуцирует образование гидроксильных и липидных радикалов [Маеда Х., Акаике Т., 1998], окисляет NH2- и SH-группы белков, что приводит к ингибированию супероксиддисмутазы и ДНК-лигазы. С другой стороны, в ряде работ описаны диаметрально противоположные эффекты оксида азота на развитие программированной клеточной гибели. Так, активация NO/цГМФ-зависимого пути отменяла развитие апоптоза моноцитов клеточной линии U937 [De Nadai C. et al., 2000], гепатоцитов и В-лимфоцитов [Choi B.-M. et al., 2002]. Кроме того, блокирование апоптоза может быть связано с нитрозилированием каспазы-3 [Bruene B., 1999; Mannick J.B., 1999]. Следует отметить, что имеются данные, указывающие на способность оксида азота индуцировать синтез белков семейства Bcl-2 [Зенков Н.К. и соавт., 2001; Choi B.-M. et al., 2002]. Известно, что продукция АФК наиболее значима в нейтрофильных лейкоцитах по сравнению с другими клетками организма. Индукция окислительного стресса при воспалении инициирует развитие программированной гибели нейтрофилов. В связи с тем, что нейтрофилы быстро вступают на путь спонтанно развивающегося апотоза, не требующего какого-либо внешнего сигнала смерти [Edwards S.W. et al., 2003], состояние внутриклеточных сигнальных систем (Ca2+, цАМФ и цГМФ), баланс анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 являются важными регуляторными факторами продолжительности жизни клеток. Несмотря на очевидную взаимосвязь окислительного стресса и апоптоза, роль оксида азота в механизмах реализации программированной гибели нейтрофилов в полной мере до конца не ясна. Установление молекулярных механизмов регуляции продолжительности жизни нейтрофильных лейкоцитов позволит создать селективные технологии управления воспалительным процессом. Цель исследования: изучить роль оксида азота в механизмах регуляции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Научная новизна. Использование современных молекулярно-биологических и биохимических методов показало, что при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалительном процессе в клинике внутренних болезней (внебольничная пневмония, острый аппендицит) происходит увеличение продукции оксида азота нейтрофильными лейкоцитами. Показано, что молекулярные механизмы влияния молекул оксида азота на апоптоз нейтрофилов при окислительном стрессе и остром воспалительном процессе сопряжены с участием ионов кальция, цАМФ и цГМФ. Установлено, что влияние оксида азота на реализацию программированной гибели нейтрофилов не связано с влиянием на баланс про- (Bax) и антиапоптотических (Bcl-2) белков. Теоретическая и практическая значимость. Разработана экспериментальная модель окислительного стресса, позволяющего прогнозировать развитие программированной клеточной гибели нейтрофилов при использовании индукторов и ингибиторов NO-синтаз при острых воспалительных заболеваниях. Полученные в результате проведенного исследования данные носят фундаментальный характер и раскрывают молекулярные механизмы развития программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов, опосредованные молекулами оксида азота, в условиях окислительного стресса in vitro и острого воспаления в клинике внутренних болезней. Установленные закономерности реализации апоптотической программы нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса при воспалении могут быть положены в основу разработки селективных молекулярных технологий управления развитием воспалительного процесса, влияя на продолжительность жизни нейтрофильных лейкоцитов. Положения, выносимые на защиту:
Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VII международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, Украина, 2007), на Всероссийской конференции «Национальные дни лабораторной медицины России 2007» (Москва, 2007), XХ съезде физиологического общества имени И.П. Пирогова (Санкт-Петербург, 2007), II конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации» (Москва, 2007). В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ, по проблеме «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150 - ориентированные фундаментальные исследования 2007-2008), а так же проекта «Разработка способов коррекции нарушений регуляции апоптоза клеток при патологических процессах в условиях окислительного стресса» (гос. контракт № 02.442.11.7276 от 20.02.2006), реализованного в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006». Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 – в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы (135 страниц машинописного текста), включающего 180 источников (из них – 62 отечественных и 118 зарубежных). Работа иллюстрирована 9 таблицами и 6 рисунками. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА, МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для реализации предпринятого нами исследования были выделены экспериментальный и клинический блоки, включавшие манипулирование in vitro нейтрофильными лейкоцитами, полученными у здоровых доноров и у больных острыми воспалительными заболеваниями. В исследование были включены 32 здоровых донора (18 мужчин и 14 женщин) в возрасте от 18 до 40 лет (25,0±5,4 лет). Обследовали 54 пациента (30 мужчин и 24 женщины) в возрасте от 18 до 50 лет (32,0±3,0 лет) с острыми воспалительными заболеваниями. Из них 29 человек с внебольничной пневмонией (13 мужчин и 16 женщин) и 25 больных острым аппендицитом (17 мужчин и 8 женщин). Все пациенты поступали в стационар в порядке скорой медицинской помощи, обследование проводилось до назначения терапии. Для верификации диагноза использовали данные анамнеза, инструментальных (УЗИ, рентгенологическое исследование органов брюшной и грудной полости и др.) и лабораторных (общий анализ крови и мочи, биохимический анализ крови и др.) методов исследования. Критериями исключения являлись: возраст (менее 18 и более 50 лет), период обострения хронических воспалительных заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, алкогольная и наркотическая зависимости. Набор клинического материала осуществлялся на базе и при участии сотрудников кафедры терапии усовершенствования врачей (зав. кафедрой – канд. мед. наук, доцент Т.С. Агеева) Томского военно-медицинского института; терапевтического отделения (зав. отделением – канд. мед. наук А.В. Дубоделова) и хирургического отделения (зав. отделением – канд. мед. наук В.Я. Митасов) ММЛПУ «Городская больница №1» (главный врач – С.М. Кирютенко) (г. Томск); кафедры госпитальной хирургии (зав. кафедрой – член-корреспондент РАМН, проф. Г.Ц. Дамбаев) ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (г. Томск). Материалом исследования служила венозная кровь, взятая из локтевой вены утром натощак с помощью стандартных вакуумных систем "BD VACUTAINERTM" («Greiner-bio-one», Австрия) с гепарином (25 Ед/мл). В соответствии с поставленными целью и задачами исследования был предложен дизайн, предполагающий разделение работы на два последовательных этапа. На первом этапе исследования проводили оценку выраженности апоптоза нейтрофильных лейкоцитов крови в условиях экспериментального окислительного стресса и при остром воспалении в клинике внутренних болезней. Окислительный стресс in vitro воспроизведен с использованием пероксида водорода [Yamamoto K. et al., 2003; Akishita M. et al., 2005] (табл.1). Таблица 1 Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями в соответствии с использованными методами регистрации апоптоза и АФК в нейтрофилах
На втором этапе исследования для проверки гипотезы участия оксида азота в регуляции программированной гибели нейтрофильных лейкоцитов в условиях окислительного стресса клетки были культивированы в присутствии 5 мМ перекиси водорода и 500 мкМ L-аргинина («MP», США) (субстрата фермента NO-синтазы [Niu X.-F. et al., 1996]) или 500 мкМ L-NAME (NG-нитро-L-аргинин метиловый эфир) («Fluka» США) (селективного ингибитора NO-синтазы) [Beltran B. et al., 2002]). Далее оценивалось влияние оксида азота на содержание про- (Вах) и антиапоптотических белков (Вcl-2), концентрацию внутриклеточных мессенджеров в нейтрофилах (Ca2+, цАМФ и цГМФ) (табл. 2). Исследование проводилось в Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (зав. лабораторией – д-р мед. наук Л.С. Литвинова). | |||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе Работа выполнена в гоу впо «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному... | | Зависимость заболеваний сердечно-сосудистой системы от содержания вредных веществ в воздухе Из рис. 1 видно, что при 1,5 резко увеличивается выброс оксида углерода и углеводородов, при 1,5 повышается содержание в... |
 | К. Н. Зеленин Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург Рассматриваются вопросы химии и практических приложений оксида азота(II). Обсуждаются различные аспекты участия этого вещества в... | | Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов... Работа выполнена в нил биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии фгаоувпо «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.... |
| Лазебная Е. О. Реадаптация личности при посттравматическом стрессе Лазебная Е. О. Реадаптация личности при посттравматическом стрессе. – М.: Ноу впо “Институт психоанализа”, 68 с | | Способ получения мембран на основе оксида алюминия Способ получения мембран на основе оксида алюминия осуществляют следующим образом. Подготовленный образец алюминия подвергают первичному... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: рассмотреть генетическую связь соединений азота, охарактеризовать положение азота в таблице Менделеева, рассмотреть состав... | | Продукция оксида азота мононуклеарами крови у больных лекарственно-чувствительным... У больных лекарственно-устойчивым тл до и после проведения курса интенсивного лечения секреция no• моноцитами крови снижалась и увеличивалась... |
| Рефератов по дисциплине «экология» Искусственное загрязнение. Оксиды азота. Методы снижения образования оксидов азота | | "Роль биологического азота в азотном балансе почв" В практической части представлены результаты опыта по учету численности микроорганизмов в дерново-подзолистой почвы |
| Механизмы гибели клеток при действии оливомицина и его производных | | Рекомендации по подавлению чувства тревоги при выступлении Ему важно, как воспримут его и его речь. Оказаться в таком положении – это большой стресс, а инстинкт говорит нам, что при стрессе... |
| Темы рефератов по дисциплине Строение вещества для группы ах-07-1 Татевский В. М. Строение молекул и физико-химические свойства молекул и веществ. М.: Изд. Московского университета, 1993 | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: Проследить связь важнейших соединений азота, роль аммиака, азотной кислоты в окислительно-восстановительных процессах, специфические... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цели урока изучить нахождение азота в природе и его свойства, вскрыть причинно-следственные связи “строение–свойства” и “свойства–применение”,... | | Тематическое планирование Физика 8 класс Примеры тепловых и электрических явлений. Повторение понятий: механическое движение, траектория, пройденный путь, скорость. Особенности... |
