Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода

Рис. 3. Морфология ММСК 2-го пассажа при экспозиции в условиях 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержания кислорода в среде культивирования, фазовый контраст, ув. х 100. а б в г Рис. 5. Формирование колоний ММСК 2-го пассажа в условиях 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) концентрации кислорода. Окраска кристаллвиолетом, ув. х 0,6. Влияние пониженного содержания кислорода на морфофункциональные характеристики ММСК При снижении содержания кислорода популяция крупных клеток 3-го типа уменьшалась, и уже на 2-ом пассаже преобладали клетки 1-го и 2-го типа (рис. 3). Более длительное культивирование в течение 4-х пассажей не вызывало дальнейших морфологических изменений ММСК в условиях 5% О2, тогда как экспансия в условиях 1% и 3% О2 приводила к появлению распластанных клеток с большим количеством отростков. Клетки с морфологией, отличной от наблюдаемой в стандартных условиях культивирования, имели отличия в уровне экспрессии ряда генов. Было отмечено, что в ММСК при 5% О2 уровень экспрессии генов TUBB3, SVIL и ANK2, продукты которых (β-тубулин, супервиллин, анкерин) участвуют в примембранной перестройке и стабилизации цитоскелета был выше, а генов TPM2, ACTN1, CNN3, CDC42EP3, CDC42EP1, TAGLN, SGCG, продукты которых (тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки Rho-ГТФазы, трансгелин и саркогликан-γ) участвуют в формировании адгезионных контактов, взаимодействии с ВКМ и формировании псевдоподий, был ниже, чем в стандартных условиях культивирования (20% О2) (табл. 2). Допуская, что появление клеток 3-го типа связано с их повреждением в процессе культивирования, можно предположить, что приближение концентрации кислорода в среде к тканевому уровню обеспечивает снижение степени окислительного стресса и уменьшение количества таких клеток, о чем свидетельствует увеличение гомогенности культур ММСК в условиях 5% и 3% О2. Оценка пролиферативного потенциала культивируемых клеток показала, что уменьшение концентрации кислорода (до 5%-1%) способствовало активации пролиферации (на 2-ом пассаже максимальное количество удвоений в 2 раза превышало значение при 20% О2). При этом более выраженный стабильный прирост клеток наблюдался в условиях 5% О2 (рис. 4, а). Уменьшение концентрации кислорода сокращало время лаг-фазы на кривой пролиферации до нескольких часов, тогда как при 20% О2 лаг-фаза длилась не менее двух дней (рис. 4, б). Экспансия клеток в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась увеличением числа КОЕ-ф, в то время как при 20% О2 формирования колоний не происходило. Перенос клеток в условия пониженного содержания кислорода (5%-1%) активировал эту способность, максимально выраженную на втором пассаже (рис. 5). Механизм влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный потенциал ММСК остается не совсем понятным. Одним из возможных объяснений улучшения роста клеток может быть уменьшение окислительного повреждения клеток в результате окислительного стресса (Бурнаевский и др., 2010). Таблица 2. Соотношение уровня дифференциальное экспрессии генов ММСК 2-го пассажа при 5% и 20% О2 . * - достоверное отличие от значений в условиях стандартного содержания кислорода. Символ Продукт Интенсивности сигнала 5% / 20% O2 Морфлогия клеток TUBB3 β-тубулин, 3 2,2* SVIL супервиллин 2,3* ANK2 анкерин 2 3,6* TPM2 тропомиозин 2 0,5* ACTN1 актинин 1 0,5* CNN3 кальпонин 1 0,4* CDC42EP3 эффекторный белок Rho-ГТФазы, изоформа 3 0,3* CDC42EP1 эффекторный белок Rho-ГТФазы, изоформа 1 0,3* TAGLN трансгелин 0,3* SGCG саркогликан-γ 0,2* Пролиферация FOSB белок семейства Fos формирует транскрипционный фактор AP1 4,2* FOSL1 белок семейства Fos формирует транскрипционный фактор AP1 3,2* PCNA ядерный антиген пролиферирующих клеток 2,1* CCND2 G1/S-специфичный циклин D2 2,0* CKS2 регуляторная единица циклин-зависимой киназы 2,0* CDKN2C ингибитор циклин-зависимой киназы 0,4* Метаболизм глюкозы HK1 гексокиназа, изоформа 1 1,1 HK2 Гексокиназа, изоформа 2 1,1 PFKL Фосфофруктокиназа, изоформа L 1,6 PFKP Фосфофруктокиназа, изоформа P 1,9 PFKFB3 6-фосфофруктокиназа-2/фруктозо-2,6-бисфосфатаза, изоформа 3 2,1* PFKFB4 6-фосфофруктокиназа-2/фруктозо-2,6-бисфосфатаза, изоформа 4 1,6 ALDOC альдолаза С 2,1* PKM2 пируваткиназа, изоформа M2 1,5 LDHA лактатдегидрогеназы А 1,5 PDK1 киназу пируватдегидрогеназы1 0,9 Апоптоз BIRC5 антиапоптотические белок белок IAP 3,5* PSEN2 пресенилин 2 3,2* STAMBPL1 металлопротеаза, взаимодействующая с FADD 2,4* BCL2L1 антиапоптотический белок Bcl2 2,2* TIMP3 ингибитор металлопептидазы 3 0,4* IGFBP3 белок, связывающий IGF 0,3* BNIP3 белок, взаимодействующий с Bcl2 0,3* * б а Рис. 4. Пролиферативная активность ММСК в условиях различного содержания кислорода. Представлены средние значения числа удвоения популяций (а) и кривые пролиферации ММСК 2-го пассажа (б), культивируемых в условиях 20%, 5%, 3% и 1% О2. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 6. Рис. 7. Влияние пониженного содержания кислорода на эффективность остеогенеза и адипогенеза ММСК. Гистохимическое выявление компонентов минерализованного матрикса (ализариновый красный) (а) и липидных включений (масляный красный) (б) в культурах ММСК 2-го пассажа и полуколичественный анализ, * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3. Рис. 8. Потребление глюкозы (белые столбики) и продукция лактата (черные столбики) (а), молярное cоотношение YLa/Glu (б), средняя интенсивность флуоресценции потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red (в) в ММСК 2-го пассажа в предмонослойной культуре, в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3. а б в г Рис. 9. Выявление митохондрий ММСК 2-го пассажа, культивируемых при 20% (а), 5% (б), 3% (в) и 1% (г) содержании кислорода, с помощью потенциал-зависимого зонда MitoTracker Red. а б в г Рис. 10. Выявление колоний, формируемых при 20% (а,г) и 5% (б,в) содержании кислорода клетками: а - постоянно культивируемыми при 20% О2, б – предкультивируемыми при 20% О2, в – постоянно культивируемыми при 5% О2, г - предкультивируемыми при 5% О2. Окраска кристаллвиолетом, ув. х. 0,6. Активация пролиферации ММСК в условиях пониженного содержания кислорода сопровождалась более выраженной экспрессией генов семейства Fos (FOSB, FOSL1), продукты которых формируют транскрипционный фактор AP-1, генов PCNA, CCND2, кодирующих ядерный антиген пролиферирующих клеток и циклин D2, а также гена CKS2, кодирующего регуляторную единицу циклин-зависимой киназы при значительном подавлении экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2C) (табл. 2). Можно предположить, что увеличение пролиферативной активности ММСК обусловлено активирующимся в этих условиях JNK сигнальным путем, с последующим образованием транскрипционного фактора AP-1, о чем косвенно свидетельствует увеличение экспрессии генов семейства Fos и гена CCND2, кодирующего циклин D2, экспрессия которого происходит под воздействием этого транскипционного фактора. Активация SAPK/JNK и p38 киназных путей при гипоксии была продемонстрирована во многих типах клеток, в том числе ММСК (Scott et al., 1998; Kunz et al., 2003, Lee et al., 2011). Экспозиция при 5% - 1% О2 на 1-ом пассаже сопровождалась снижением доли клеток, экспрессирующих CD73 и CD54, пропорционально уменьшению концентрации кислорода в среде (рис. 6, а, б), не вызывая изменения количества клеток, экспрессирующих CD105 и CD90. Дальнейшая экспозиция ММСК в условиях пониженного содержания кислорода в течение 3-х пассажей не оказывала влияния на долю CD105+- и CD90+-клеток и способствовала восстановлению количества CD73+- и CD54+-клеток до исходного уровня. Однако, при длительном культивировании в условиях 20% О2 происходило практически двукратное снижение доли CD54+-клеток (рис. 6, в, г). Рис. 6. Количество CD73+- и СD54+-клеток через 6 суток (а,б) и при длительной экспозиции (в,г) в условиях различного содержания кислорода в среде культивирования. * - достоверные отличия от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3.

Похожие:

	Сравнительная характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного... Сборник нормативных документов. Биология. Сост. Г. М. Пальдяева. – 3-е изд. Стереотип. –М.: Дрофа, 2011. и образовательных программ...		Павел Михайлович Влияние моделирования эффектов микрогравитации на... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Кислород, его общая характеристика и нахождение в природе. Получение кислорода. Свойства кислорода. Применение кислорода. Круговорот...		Кирова Маргарита Но для человека важно, чтобы в воздухе содержание кислорода было высоким, это влияет на его здоровье. Однако в процессе жизнедеятельности...
	Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю...		Морфофункциональная характеристика детского организма в разные возрастные периоды жизни Именно в процессе развития осу­ществляется постепенная реализация наследственной информации, которая была заложена при оплодотворении....
	Реферат: Циррозы печени Цирроз печени — хронические прогрессирующие заболевания, характеризу­ющиеся поражением как паренхимы, так и стромы органа с дистрофией...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока. Конкретизировать знания о химическом элементе и простом веществе на примере кислорода. Изучить химические свойства кислорода....
	Конспект урока химии. 8 класс. Тема урока: «Кислород, его общая характеристика... Развивать умение наблюдать за протеканием химических реакций, мыслительную деятельность учащихся, практические навыки при выполнении...		Урок №34 "Получение кислорода. Понятие о катализаторах" Урок “Получение кислорода. Понятие о катализаторах” подготовлен для VIII класса и проводится при изучении темы "Кислород. Оксиды"...
	Урока. Орг момент Тема: Общая характеристика подгруппы кислорода и их простых веществ. Кислород и озон		Тематический план изучения дисциплины №п\п Наименование темы Развитие физиологии кровообращения. Морфофункциональная характеристика системы кровообращения. Строение сердца и сосудов у плода....
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Краткая характеристика групп тканей и отдельных видов ткани из различных видов волокон; их состав, технологические свойства и применение...		Морфофункциональная характеристика зубочелюстного аппарата у собак... Работа выполнена в фгу «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий»...
	Урок в 6 классе Тема: Получение ткани. Простые переплетения Переплетением нитей в ткани называется порядок взаимного перекрытия основных нитей уточными. При выработке тканей используют разнообразное...		Т ема: Получение кислорода ...