Известно, что 5’-нуклеотидаза (CD73) осуществляет гидролиз АМФ до аденозина и фосфата, а ICAM-1 (CD54) выступает в качестве ко-рецептора β2-интегрина. Для выраженной экспрессии этих двух мембранных белков необходима активация клеток такими цитокинами как, IFN-γ, IL-1β (Pober et al., 1986; Muro et al., 1989; Murray, 1988; Stefanovic, 1989). В ряде работ было отмечено, что экспрессия CD73, зависит от уровня содержания кислорода, а гипоксическое состояние провоцирует увеличение концентрации аденозина (Synnestvedt et. al., 2002; Ledoux et. al., 2003). Молекулярные механизмы, приводящие к увеличению аденозина в условиях пониженного содержания кислорода, в настоящий момент активно изучаются. Показано, что увеличение и уменьшение уровня экспрессии CD73 в условиях пониженного содержания кислорода может быть вызвано регуляторными факторами, среди которых активируемый гипоксией транскрипционный фактор HIF-1 и эритроидные транскрипционные факторы -1 и -2 (GATA1 и GATA2) (Synnestvedt et. al., 2002).
При исследовании влияния пониженного содержания кислорода на дифференцировочный потенциал ММСК обнаружено двукратное подавление индуцированного остеогенеза как при 5%, так и при 1% О2 (рис. 7, а), тогда как при стимуляции адипогенеза выраженное снижение наблюдалось только при 1% О2 (рис. 7, б). Культивирование ММСК в условиях пониженной концентрации кислорода не вызывало спонтанного коммитирования клеток.
Известно, что в условиях низкой концентрации кислорода происходит увеличение фосфорилирования Erk1/2-киназы, которое сопровождается уменьшением экспрессии ключевых транскрипционных факторов Runx2/Cbfa1 и активности ЩФ в клетках-предшественниках костного мозга (Xiao et al., 2000; Wang et al., 2012). Сохранение экспрессии некоторых адипогенных маркеров ММСК в условиях пониженного содержания кислорода широко обсуждается (Matsumoto et al., 2008; Nobusue et al., 2008). В нашем исследовании сохранение адипогенного дифференцировочного потенциала в условиях 5% содержания кислорода может объясняться более высоким уровнем экспрессии основного адипогенного маркера PPARγ (в 7,5 раза) по сравнению со стандартными условиями культивирования.
При оценке метаболизма глюкозы мы обнаружили, что при 20% О2 ММСК потребляли значительно большее количество глюкозы и продуцировали большее количество лактата, чем клетки в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1%) (рис. 8, а). Для оценки эффективности катаболизма глюкозы в процессе гликолиза использовали молярное соотношение YLa/Glu. Результаты показали, что при приближении культур клеток к состоянию монослоя в условиях 20% О2, несмотря на повышенный уровень продукции лактата в среду, YLa/Glu было ниже, чем при 5%-1% О2 (рис. 8, б). При этом флуоресцентная микроскопия (рис. 9) и цитофлуориметрический анализ окрашенных потенциал-зависимым зондом MitoTraker Red клеток выявили двукратное снижение интенсивности флуоресценции зонда при уменьшении концентрации кислорода (рис. 8, в).
Эти данные могут свидетельствовать об увеличении гликолитического вклада в процесс катаболизма глюкозы при уменьшении концентрации кислорода в среде культивирования, что подтверждается увеличенной экспрессией генов, кодирующих ферменты всех стадий расщепления глюкозы в процессе гликолиза. Необходимо отметить, что в условиях 5% О2 экспрессия ряда генов гликолитических ферментов увеличивалась уже через 96 часов экспозиции, среди которых HK1, HK2, кодирующих две изоформы гексокиназы, PFKL, PFKP, кодирующих различные изоформы фосфофруктокиназы, PFKFB3, PFKFB4, гены двух изоформ бифункционального фермента 6-фосфофруктокиназы-2/фруктозо-2,6-дифосфатазы, осуществляющего регуляцию на уровне второго субстратного цикла, ALDOC, гена альдолазы С, PKM2, кодирующего пируваткиназу. При этом отмечается возрастание уровня экспрессии LDHA, гена лактатдегидрогеназы А, и незначительное уменьшение экспрессии гена PDK1, кодирующего киназу пируватдегидрогеназы (табл. 2). Снижение экспрессии PDK1 и увеличение LDHA в ММСК пуповины при уменьшении концентрации кислорода было показано в работе А. Lavrentieva и сотрудников, полагающих, что снижение способности митохондрий к потреблению кислорода в этих условиях происходит в результате фосфорилирования пируватдегидрогеназы киназой пируватдегидрогеназы и подавления поступления пирувата в цикл Кребса (Lavrentieva et al., 2010).
Оценка жизнеспособности показала, что длительное культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода не оказывает повреждающего воздействия, более того, наблюдается снижение доли некротических и апоптотических клеток (табл. 3).
Таблица 3. Жизнеспособность ММСК 2-го пассажа в условиях различного содержания кислорода. Представлено среднее количество живых (AnnV-/PI-), апоптотических (AnnV+), некротических (PI+) и клеток в состоянии постапоптотического некроза (AnnV+/PI+). Данные представлены как (М ± m), n =3.
условия
|
PI+, %
|
AnnV+/PI+, %
|
AnnV+, %
|
AnnV-/PI-, %
|
20% О2
|
1,7 ± 0,47
|
4,6 ± 1,62
|
2,3 ± 0,57
|
91,4 ± 2,39
|
5% О2
|
1,4 ± 0,43
|
4,4 ± 1,44
|
1,8 ± 0,55
|
92,4 ± 1,74
|
3% О2
|
1,2 ± 0,23
|
2,6 ± 0,86
|
1,6 ± 0,64
|
94,6 ± 1,43
|
1% О2
|
1,3 ± 0,59
|
2,2 ± 0,33
|
1,1 ± 0,24
|
95,5 ± 0,95
|
Сравнительный анализ уровня экспрессии генов показал, что уменьшение концентрации кислорода сопровождается увеличением экспрессии BIRC5, PSEN2, STAMBPL1, BCL2L1, кодирующих такие антиапоптотические белки как белок IAP, пресенилин 2, металлопротеазу, взаимодействующую с FADD и каспазами 8 и 9 и Bcl2. При этом отмечено уменьшение экспрессии TIMP3, IGFBP3, кодирующих ингибитор металлопептидазы 3, белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста, экспрессия, которых наблюдается, как правило, на начальных этапах апоптоза (Thomas et. al., 2006; Natsuizaka et al., 2012) и гена BNIP3, продукт которого, взаимодействуя с Bcl2, приводит к выходу цитохрома с из митохондрий (Ray et al., 2000) (табл. 2).
В настоящее время механизмы, опосредующие выживание клеток-предшественников в условиях гипоксии активно изучаются. Один из возможных механизмов может осуществляться за счет активации PI3K/Akt-1 сигнального пути (Greijer et al., 2004; Stubbs et al., 2012). В результате в клетках индуцируется экспрессия ядерного транскрипционного фактора NF-κB, мишенями которого являются антиапоптотические белки IAP2, Bcl-2 и Bcl-xL (Quanungo et al., 2004).
Таким образом, культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1%) способствует поддержанию гомогенности активно пролиферирующей, менее коммитированной популяции мезенхимальных клеток-предшественников, сохраняющих высокий уровень жизнеспособности, что коррелирует с изменением экспрессии генов структурных и регуляторных белков цитоскелета, регуляторов клеточного цикла, а также регуляции экспрессии некоторых про- и антиапоптотических белков. Уменьшение концентрации кислорода приводит к снижению потребления клетками глюкозы, увеличению молярного соотношения La/Glu и уменьшению трансмембранного потенциала митохондрий, что сопровождается увеличением экспрессии генов, кодирующих все ферменты гликолитического пути катаболизма глюкозы.
Обратимость эффектов влияния пониженного содержания кислорода на клоногенный и дифференцировочный потенциал ММСК
Оценив эффекты влияния пониженного содержания кислорода на морфофункциональные свойства прогениторных клеток из жировой ткани, нам было важно определить, являются ли наблюдаемые изменения обратимыми.
При изучении обратимости эффектов воздействия пониженного содержания кислорода на клоногенный, пролиферативный и дифференцировочный потенциал мы показали, что предкультивируемые в условиях 20% О2 и переставленные в 5% О2 ММСК формируют количество колоний сходное с клетками, постоянно экспонируемыми в условиях 5% О2. Тогда как клетки, предкультивируемые в условиях 5% О2 и перенесенные для оценки этого параметра в 20% О2, формировали значительно меньшее количество колоний уже через 6 суток экспозиции (рис. 10).
Подобные изменения наблюдались при оценке пролиферативного потенциала ММСК, предкультивируемых при 5% О2 и подвергавшихся экспансии при стандартных условиях. Уже через 6 часов экспозиции наблюдалось двукратное уменьшение числа удвоений, по сравнению с клетками, культивируемыми при 5% О2. В культурах ММСК переставленных из 20% в условия 5% содержания кислорода наблюдалось некоторое увеличение числа удвоений популяции, по сравнению со стандартными условиями культивирования (рис. 11, а).
Оценка остеогенного и адипогенного дифференцировочного потенциала ММСК показала, что в культурах клеток, предкультивируемых в условиях 20% О2 и переведенных для дифференцировки в условия 5% О2, площадь минерализованного матрикса снижалась до 30% от общей площади как и при дифференцировке ММСК, постоянно культивируемых в условиях 5% О2. При обратном переносе клеток постоянно культивируемых при 5% О2 и помещенных для дифференцировки в условия 20% О2, отмечалось увеличение площади минерализованного матрикса до контрольных значений ~ 50% от общей площади (рис. 11, б).
Рис. 11. Оценка пролиферативного, остеогенного и адипогенного потенциала ММСК, индуцируемого при 20% и 5% содержании кислорода в среде. По оси ординат – число удвоений популяции (а), полуколичественная оценка площади, занятой минерализованным матриксом (б) и доли клеток, содержащих внутриклеточные липидные включения (в). * - достоверное отличие от значений в условиях 20% О2, p < 0,05, n = 3.
При оценке эффектов различного уровня содержания кислорода на способность ММСК подвергаться дифференцировке в адипогенном направлении было обнаружено, что индукция в условиях 5% О2 не сопровождалась выраженным подавлением дифференцировки как постоянно культивируемых в этих условиях клеток, так и предкультивируемых в условиях атмосферного содержания кислорода (рис. 11, в).
Аналогичный эффект обратимости воздействия пониженного содержания кислорода ранее был показан для ММСК костного мозга, однако этот эффект наблюдался и в отношении дифференцировки в адипогенном направлении (Fehrer et al., 2007).
Таким образом, после помещения ММСК, постоянно культивируемых при 5% О2, в условия атмосферного содержания кислорода их способность к дифференцировке в остеогенном направлении восстанавливается, тогда как ММСК, подвергающиеся экспансии в условиях 20% О2, при помещении в условия пониженного содержания кислорода приобретают признаки менее дифференцированных предшественников, что коррелирует с увеличением пролиферации и образованием КОЕ-ф при 5% О2. В связи с этим, можно предположить, что низкий уровень содержания кислорода (5% О2) в среде культивирования является, по-видимому, фактором, замедляющим, но не отменяющим процесс коммитирования ММСК.
ВЫВОДЫ
Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% О2) способствует поддержанию морфологической гомогенности культуры ММСК и сопровождается более высоким уровнем экспрессии некоторых генов, продукты которых участвуют в примембранной реорганизации (SVIL, ANK2) и стабилизации цитоскелета (TUBB3).
Уменьшение концентрации кислорода (5% - 1% О2) активирует клоногенный потенциал, пролиферацию и вызывает изменение кинетики роста ММСК. Увеличенный уровень экспрессии генов, кодирующих циклины (PCNA, CCND2), циклин-зависимую киназу (CKS2) и низкий уровень экспрессии гена ингибитора циклин-зависимой киназы (CDKN2C) коррелирует со стабильно высокой пролиферацией ММСК при 5% О2. Более низкий уровень концентрации кислорода (3% - 1%) оказывает наибольший стимулирующий эффект на начальных этапах экспозиции.
Длительное культивирование ММСК in vitro не влияет на экспрессию основных поверхностных антигенов стромальных клеток – CD54, CD73, CD90, CD105, CD106, HLA-ABC. Экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% О2) вызывает кратковременное (в течение 1 пассажа) изменение популяционного состава, проявляющееся в сокращении доли CD54+- и CD73+-клеток с последующим возвращением их числа к исходному уровню.
Экспансия ММСК in vitro сопровождается постепенной элиминацией клеток, спонтанно экспрессирующих щелочную фосфатазу. При индукции дифференцировки ММСК в условиях пониженного содержания кислорода показано, что замедление процесса коммитирования клеток в остеогенном направлении отмечается при 5% и 1% О2, тогда как выраженное подавление направленной дифференцировки в адипогенном направлении происходит только при 1% О2.
Показано, что культивирование ММСК при различном содержании кислорода (20%, 5%, 3%, 1% О2) сопровождается сокращением потребления глюкозы и продукции лактата, что соотносится с кинетикой роста культуры. Экспансия ММСК до состояния предмонослоя в условиях пониженного содержания кислорода сопровождается увеличением уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза (ALDOC, PFKFB, LDHA, PGK-1, FBP-1 и др.), увеличением молярного соотношения La/Glu и снижением трансмембранного потенциала митохондрий.
Культивирование в условиях пониженного содержания кислорода (5% - 1% О2) не оказывает повреждающего воздействия на ММСК. Отмечено снижение доли апоптотических клеток в результате NF-κB-зависимого увеличения уровня экспрессии антиапоптотических белков-регуляторов апоптоза (STAMBPL1, BIRC5, BCL2L1), а также уменьшения экспрессии проапоптотических белков (TIMP3, BNIP3, IGFBP3).
Постоянная экспансия ММСК в условиях пониженного содержания кислорода поддерживает клетки в менее коммитированном состоянии. Эффекты пониженного содержания кислорода на ММСК являются обратимыми: увеличение концентрации кислорода с 5% до 20% сопровождается уменьшением клоногенного, пролиферативного и увеличением остеогенного дифференцировочного потенциала.
|
