День донора

КНИГИ

Анемия — скрытая эпидемия/ Пер. с англ. — М.: «МегаПро», 2004 — 76 с; 11 рис. Перевод с английского к.м.н. И.С. Тарасовой Редактор перевода д.м.н. В.М. Чернов

В книге изложены проблемы диагностики, механизмы развития и современные подхо­ды к лечению анемии при различных внутренних болезнях. Своевременная коррекция анемии, как синдрома, улучшает течение основного процесса, улучшает исход, повыша­ет качество жизни больных. Представлены результаты эффективного лечения анемии в нефрологической практике, у больных сахарным диабетом, у кардиологических боль­ных, в хирургической практике, у больных ревматоидным артритом, воспалительными заболеваниями кишечника, при вирусном гепатите С, ВИЧ-инфекции, злокачествен­ных новообразованиях и улиц пожилого возраста.

Книга рассчитана на гематологов, терапевтов, педиатров и врачей других специальнос­тей.

В книге 11 рисунков, 5 таблиц, список литературы включает 434 источника.



ЖУРНАЛЬНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

СВИРОНИВСКИЙ, А.И. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛЕЙКОЗНЫХ КЛЕТОК И КЛИНИЧЕСКИЙ ФЕНОТИП ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЦИТАРНОМ ЛЕЙКОЗЕ/ А. И. СВИРНОВСКИЙ// ГЕМАТОЛОГИЯ И ТРАНСФУЗИОЛОГИЯ.-2010.-№1.-С.25-31.

Резюме. При сопоставлении биологических свойств лейкозных клеток и клинических про­явлений хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) оценивается проблема соответствия био­логического и клинического фенотипов при этом заболевании, развивается положение о прогно­зировании возможностей терапии и ее индивидуализации на основе типовых и разрабатываемых протоколов лечения с учетом ожидаемой вариабельности молекулярно-биологических характе­ристик лейкозных клеток, что может являться предметом анализа in vitro.

Ключевые слова: хронический лимфоцитарный лейкоз, клеточный фенотип, клиниче­ский фенотип, ответ клеток на стимулирующие и повреждающие воздействия in vitro. Общепризнанное разнообразие вариантов клиниче­ского течения хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), относимого к зрелоклеточным опухолевым забо­леваниям лимфоидной ткани В-типа и являющегося са­мой распространенной формой лейкозов взрослых в странах Северной Америки и Европы (в том числе в Рос­сии и Беларуси), диктует необходимость анализа мате­риального субстрата болезни, ответственного за клини­ческие проявления заболевания и определяющего как общую стратегию лечения ХЛЛ, так и конкретную так­тику ведения отдельных больных. Рассмотрение биоло­гических свойств лейкозных клеток на различных уров­нях их организации подразумевает оценку общей морфо­логии клеток, характеристику основных субклеточных структур (клеточная поверхность, хромосомы, гены и их экспрессия), предполагаемое происхождение из нор­мальных клеток (уровень трансформации), сравнение некоторых фундаментальных процессов жизнедеятель­ности (апоптоз, пролиферация, чувствительность к тера­певтическим воздействиям, а также ответ на стимуляцию некоторых сигнальных путей). При этом важным пред­ставляется такой фактор, как стабильность тех или иных свойств или динамика их приобретения (при диагности­ке, прогрессировании болезни, после терапии).

При обнаружении в крови более 90% лимфоцитов ма­лых или средних размеров со скудной цитоплазмой, с ядром круглой или овальной формы с конденсирован­ным и глыбчатым хроматином и практически незамет­ными ядрышками нередко наблюдается более благопри­ятное течение ХЛЛ, иногда длительное время не требую­щее назначения терапии. Примесь небольшой части кле­ток (менее 10%) типа пролимфоцитов или с ядрами не­правильной формы обычно не влияет на тяжесть клини­ческих проявлений заболевания, особенно на ранней стадии заболевания. Относительно связи числа типич­ных для ХЛЛ разрушенных (размазанных) клеток в маз­ках крови с содержанием лимфоцитов в крови существу­ют противоречивые мнения [1], однако наличие больше­го количества этих клеток совпадает с клиническими проявлениями заболевания, которые в течение длитель­ного времени не требуют коррекции. С другой стороны, пролимфоцитарная или лимфоплазмацитарная морфо­логия достаточно большой части клеток при ХЛЛ, а так­же клеток с расщепленными ядрами при плейоморфной морфологической картине нередко сопровождается вы­соким лимфоцитозом, выраженной спленомегалией, увеличением пролиферативной активности клеток, ран­ним прогрессированием заболевания и снижением вы­живаемости. Если при морфологическом исследовании крови обнаруживают клетки типа иммунобластов, то при этом заметно значительное увеличение лимфатических узлов (трансформация в крупноклеточную лимфому, синдром Рихтера) и ухудшение клинического статуса больного. Вместе с тем не все клинические признаки за­болевания удается связать с конкретной морфологией клеток, часть из них определяется характером поражения костного мозга (нодулярная, интерстициальная, диффуз­ная или комбинированная инфильтрация, причем пер­вые 2 варианта поражения обнаруживаются чаще на ран­них стадиях, диффузная — на более поздних стадиях и приводит к недостаточности костного мозга) [1]. Разви­тие рихтеровской трансформации, которое может на­блюдаться у 5% больных ХЛЛ, трудно предсказать на ос­новании клинических признаков заболевания в момент постановки диагноза ХЛЛ. Однако в этом случае суще­ственную помощь могут оказать определение длины теломер [2] и полиморфизм гена CD38.

Молекулы клеточной поверхности имеют значение для распознавания клеток, запуска программ поддержа­ния их жизнеспособности или, напротив, сигнальных путей апоптотической гибели, а также миграции клеток и др., что принципиально важно для идентификации ли­нейной принадлежности, степени дифференцировки и зрелости клеток (диагностика); выживания или гибели клеток в различных условиях (патогенез и ответ на тера­певтические воздействия); распространения клеток в ор­ганизме (метастазирование). Фактически эти процессы определяют поведение и судьбу опухолевой клетки в ор­ганизме и в значительной степени могут выступать в ро­ли предикторов формирования тех или иных симптомов заболевания, т. е. вариантного клинического фенотипа. Так как сигнальный компонент рецепторного комплекса антигенов на В-клетках (BCR) формируется вследствие димеризации иммуноглобулина р(CD79P) с иммуногло­булином a (CD79ct), то от вариабельности экспрессии CD79P зависит индукция пролиферации или апоптоза. При этом его высокая экспрессия сочетается с атипич­ной морфологией, выраженной экспрессией поверхно­стных иммуноглобулинов, продвинутой клинической стадией и сниженными выживаемостью без прогрессии и общей выживаемостью. Для фенотипа активации кле­ток характерны также экспрессия CD38, высокая сте­пень экспрессии CD40, CD69, CD790. Участие BCR и соответственно CD79P в активации клеток, их выживае­мости, а также в профессии клеточного цикла позволило констатировать [3], что больные с количеством CD79p+-клеток более 30% относятся к группам промежуточного и высокого риска, имеют высокое содержание р2-микро-глобулина (выше 2,2 мг/дл), увеличенные лимфатиче­ские узлы в грудной или брюшной полости и/или спленомегалию, трисомию 12 или del(17pl3), тогда как низ­кое содержание С079р+-клеток коррелировано с мутантным статусом IgVH или с низким содержанием рас­творимых CD23, а также 2АР70-положительных клеток. Слабо экспрессированный CD79P, выступающий в роли экстраклеточного эпитопа р-цепи BCR, может объяснять патологию передачи сигналов в лейкозных клетках ана­логично энергичным В-лимфоцитам. Важность исполь­зования CD79P как прогностического параметра подчер­кивается тем, что при мультивариантном анализе сво­бодной от прогрессии и общей выживаемости установ­лена его независимость от ряда других прогностических факторов. CD38, наличие которого на клетках при ХЛЛ указывает на неблагоприятный прогноз, рассматривает­ся как суррогатный маркер мутантного статуса IgVH, имеющий значительную независимость от указанного показателя. Однако в отличие от этого биологического маркера CD38 не является фиксированным параметром, так как его экспрессия регулируется взаимодействием с незлокачественными клетками (активированными С04+-Т-клетками) опухолевого микроокружения в пре­делах псевдофолликулов во вторичных лимфоидных ор­ганах, в которых и происходит пролиферация лейкозных клеток [4]. В свою очередь пролиферирующие в лимфа­тических узлах лейкозные клетки, экспрессирующие CD38, ассоциируются с повышенной васкуляризацией этих образований. В совокупности эти данные могут объ­яснить связь между экспрессией CD38 на клетках и кли­ническими проявлениями прогрессирующего заболева­ния. Больные с экспрессией ZAP70 подлежат более тща­тельному мониторингу, так как именно этот фактор име­ет наибольшую прогностически неблагоприятную значи­мость, если сравнивать его с CD38 или с отсутствием му­таций гена IgVH [5].

Хемокины CCL3 и CCL4, продуцируемые CD38+-лимфоцитами при ХЛЛ, способствуют взаимодействию лейкозных клеток с микроокружением через CD49d/ VCAM, обеспечивая их выживаемость и рециркуляцию, что в свою очередь может влиять на клинические осо­бенности заболевания и его ответ на терапию. Решаю­щую роль в выживаемости и миграции лейкозных клеток при ХЛЛ играют рецепторы CXCR4 [6]. Ингибиторы фосфоинозитид-З'-киназы, которые подавляют CXCR4-сигнальные пути, способны преодолевать лекарственную устойчивость, опосредованную стромальными клетками [7]. В миграции лейкозных клеток и их инвазии участву­ют также хемокины CCL.21, CCL.19, CXCL.12, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), интегрины <xLp2, а4р,, а также матриксные металлопротеиназы (ММР), причем ММР-9 определяют и трансэндотелиальную миграцию лейкозных клеток, и их проникновение через базальные мембраны. Уровень проММР-9, которая колокализуется с CD44v (190 кД), значительно выше в лейкозных клет­ках по сравнению с нормальными В-клетками, что кор­релирует с более продвинутой стадией заболевания и снижением выживаемости больных, при этом секреция фермента усиливается а4р,, CXCR4 или CCR7 [8].

В большинстве случаев лейкозные клетки при ХЛЛ с немутантным геном вариабельной области тяжелых це­пей иммуноглобулинов отвечают на стимуляцию BCR in vitro, тогда как при наличии мутантного гена они на та­кую стимуляцию не реагируют [9]. Клетки, которые in vitro не отвечают на перекрестное связывание поверхно­стных иммуноглобулинов, напоминают В-клетки, при­обретающие анергию после контакта с антигеном in vivo. В этих клетках конститутивно экспрессирована фосфо-рилированная киназа (ERK)l/2, регулируемая экстра­клеточными сигналами, при отсутствии активации АКТ (протеинкиназы В). Кроме того, имеются конститутив­ное фосфорилирование МЕК1/2 и повышенная трансак­тивация ядерного фактора активированных Т-клеток (NF-AT), а также активация сигнального пути, опосре­дованного митогенактивированной протеинкиназой (МАРК). Сочетание отсутствия реактивности BCR с конститутивной активацией МАРК может быть призна­ком клеточной анергии in vivo, что в свою очередь опре­деляет фенотип малосимптомного течения заболевания именно у этой части больных [10]. Следовательно, гете­рогенность клеточного ответа на стимуляцию рецепто­ров in vitro может определять варианты клинического фе­нотипа [11]. Оценивая иммунофенотип лейкозных кле­ток и некоторые показатели иммунного статуса больных с учетом клинических проявлений ХЛЛ, можно отме­тить, что повышенная экспрессия мембранного глико-протеина CD49d (а4-цепь интегрина), который обеспе­чивает взаимодействие с элементами внеклеточного мат-рикса, в частности с фибронектином, на лимфоцитах части больных указывает на вероятность прогрессии за­болевания и неблагоприятный прогноз. Корреляция с экспрессией других неблагоприятных факторов не ис­ключает независимую прогностическую значимость экс­прессии этого белка для оценки времени до начала тера­пии и общей выживаемости [12].

В отличие от здоровых людей, у которых популяция регуляторных Т-клеток (Т^, CD4+CD25+) является очень динамичной за счет дифференцировки из быстро-пролиферирующих Т-клеток памяти и высокой чувстви­тельности к апоптозу, при ХЛЛ может происходить их накопление вследствие повышенного образования, опо­средованного взаимодействием CD27—CD70 в пролифе-ративных центрах лимфатических узлов, и сниженной чувствительности к апоптозу в результате дисбаланса Noxa—Bcl-2, что отрицательно сказывается на течении заболевания. Особенности клинической картины бо­лезни могут проявиться в более ранний срок после ус­тановления диагноза и при сниженном количестве СОЗ+-клеток в крови больных.

Если расположить наблюдаемый у больных хромо­сомный статус в порядке снижения связанной с ним аг­рессивности течения заболевания, то получится следую­щая последовательность: 17р", llq~, 6q~, + 12, норма, 13q" [13]. Обнаружение одной и той же хромосомной аберрации у больных, например del(17pl3), не исключает значительных различий в клиническом течении ХЛЛ, что проявляется в наличии части больных с маловыра-женными проявлениями заболевания и длительной вы­живаемостью. Очевидно, что в таких случаях прогнози­рование времени до начала терапии и выживаемости должно базироваться на клинических и других биологи­ческих характеристиках. Представляет интерес тот факт, что наличие известных делеций в одной или обеих хро­мосомах, в частности 13q, одинаково влияет на выживае­мость без лечения и общую выживаемость больных ХЛЛ, что позволяет отнести больных с поражением одного или обоих аллелей к одной группе риска [13]. Выживаемость больных с делецией 17р плюс мутация Т53, только с де-лецией 17р или только с мутацией Т53 также существен­но не различается [14]. Однако все же не исключается, что при del(17pl3) именно мутации оставшегося аллеля определяют наихудший прогноз, в частности низкие об­щую выживаемость и выживаемость без прогрессии. Стандартизация панелей диагностики с помощью флюо­ресцентной гибридизации in situ (fluorescence in situ hybridization — FISH) и введение балльной системы уче­та получаемых при этом количественных показателей бу­дут способствовать сопоставимости цитогенетических показателей при кооперативных исследованиях, что, ра­зумеется, является целесообразным и при анализе самых разнообразных лабораторных параметров. Технология сканирования всего генома повышает разрешающую способность кариотипирования [15].

При анализе изменения структуры и экспрессии ге­нов при ХЛЛ обращает на себя внимание, что индиви­дуальный риск прогрессии моноклонального В-лимфо-цитоза в ХЛЛ может быть связан с различным молеку­лярным профилем генов тяжелых цепей иммуноглобули­нов BCR, т. е. на этом основании можно фактически оп­ределить, является ли каждый конкретный случай кли­нически бессимптомного лимфоцитоза предлейкозным состоянием или нет. Возможно, детальное сравнитель­ное исследование молекулярных характеристик клеток при ХЛЛ и моноклональном В-клеточном лимфоцитозе, который является не таким уж редким событием, особен­но у родственников больных ХЛЛ, и мониторирование развития клинических симптомов позволят проследить за формированием вариантов соответствия клиническо­го и биологического фенотипов уже на более ранних эта­пах развития ХЛЛ. При ХЛЛ имеется и соматическая ги­пермутация генов легких цепей, влияющая на специфич­ность лейкозных BCR, стереотипность которых опреде­ляется обеими цепями, что и создает места для связыва­ния антигенов. Несмотря на известную закономерность связи высокого риска ранней прогрессии ХЛЛ у больных с немутантным состоянием генов вариабельной области тяжелых цепей иммуноглобулинов, у небольшой части больных с экспрессией мутантного гена IGHV3-21 также наблюдается агрессивное течение заболевания [16]. При сравнительной оценке встречаемости генов вариабель­ной области тяжелой цепи иммуноглобулинов при се­мейных и спорадических случаях ХЛЛ оказалось, что му­тации чаще обнаруживаются именно в первых случаях и при этом имеется внутрисемейная конкордантность му­тационного статуса. Однако частота встречаемости этих генов не различались существенно в обеих группах боль­ных. Более того, встречаемость генов тяжелой цепи им­муноглобулинов не коррелировала у заболевших членов одной и той же семьи [17], что позволяет предполагать участие в патогенезе заболевания не одного какого-либо фактора окружающей среды, а общей генетической базы.

Для сопоставления клинического фенотипа с мутантным статусом гена IgVH можно использовать и так называе­мые суррогатные маркеры этого состояния [18]. Аллель-ные вариации гена регуляторного фактора интерферо-на-4 (/Л/¥)/онкогена 1 множественной миеломы (MUM1) влияют не только на риск развития ХЛЛ, но и на прогноз заболевания (укорочение периода от момента диагностики до начала терапии, но не снижение общей выживаемости). Получены доказательства участия и дру­гих сигнальных путей, например Wnt, в характеристике биологических свойств клеток и даже в лейкозогенезе [19]. Профили экспрессии мРНК различных генов, ха­рактеризующие репертуар транскрипционной активно­сти в клетках больных ХЛЛ, позволяют выделить среди них несколько подгрупп и классифицировать эти под­группы по сути процессов прогрессии заболевания, про­гнозирующих его течение [20]. В связи с этим важно от­метить, что лейкозные клетки при ХЛЛ, которые нахо­дятся в различном микроокружении, т. е. в перифериче­ской крови, костном мозге, лимфатических узлах, ис­пользуют различные молекулы NF-кВ для пролифера­ции/выживания, а также миграции [21].

Особая роль многочисленных белков семейства Bcl-2, регулирующих поддержание жизнеспособности и ги­бель клеток (6 антиапоптотических белков, 3 структурно аналогичных и несколько структурно отличных про-апоптотических белков), имеет принципиальное значе­ние для понимания патогенеза как ХЛЛ, так и других хронических лимфопролиферативных заболеваний [22]. Однако их значение в проявлении индивидуальных осо­бенностей клинического фенотипа пока менее понятно, так как высокая активность антиапоптотических белков отмечается у большинства больных. Накопление лимфо­цитов характерно для ХЛЛ как заболевания, хотя ско­рость этого процесса варьирует на различных стадиях бо­лезни и у разных больных. Тем не менее активность ан­тиапоптотических белков может определять резистент­ность к химиотерапии. Не касаясь механизмов централь­ной интегративной роли белков семейства Вс1-2 в выжи­вании клеток, полагаем, что сами белки или соответст­вующие гены и мРНК являются мишенями для новых те­рапевтических воздействий, как, например, антисенсо-вых олигонуклеотидов, химических антагонистов, спо­собных трансформировать протективные белки в апоп-тотические, и др. [22]. Известны ключевая роль белка р53 в обеспечении на транскрипционном уровне апоп-тотического ответа лейкозных клеток при действии ге-нотоксических агентов и ее нарушение в случае мутации или делеций соответствующего гена или гена, кодирую­щего ATM (мутантный ген при атаксии-телеангиэкта-зии) протеинкиназу, выступающую в роли регулятора р53, что указывает на неблагоприятный прогноз. Оказа­лось также, что прямое взаимодействие р53 с митохонд-риальными антиапоптотическими белками, включаю­щими Вс1-2, может явиться основным путем индукции апоптоза клеток при ХЛЛ [23]. Снижение чувствитель­ности к апоптозу может быть связано и с экспрессией ге­на TOSO, который регулирует Fas-индуцированный апоптоз [24]. Повышенная экспрессия гена TOSO, коди­рующего Fas-ингибирующие молекулы, обычно корре­лирует с высоким лейкоцитозом, более поздними ста­диями заболевания, немутантным статусом гена IgVH, экспрессией CD38, стимуляцией BCR, необходимостью более раннего начала терапии и прогрессией заболева­ния, что позволяет считать экспрессию этого гена пре­диктором высокого риска при ХЛЛ [25]. Вопрос о роли полиморфизма генов, в частности генов, участвующих в поддержании жизнеспособности лейкозных клеток в различных условиях, для оценки его клинической значи­мости пока не решается однозначно [26, 27]. С другой стороны, имеются сведения о том, что хотя полимор­физм гена CD38 не влияет на вероятность возникнове­ния ХЛЛ, однако присутствие определенных аллелей в генотипе CD38 ассоциируется с большей вероятностью трансформации заболевания в синдром Рихтера [28]. Не­смотря на то что серийный анализ экспрессии генов в образцах лейкозных клеток показал повышенную экс­прессию 55 генов и сниженную экспрессию 49 генов по сравнению с нормальными В-клетками, связи большин­ства этих изменений с клиническим фенотипом устано­вить пока не удалось [24]. Поиск новых генетических ва­риантов, которые могут влиять на прогноз ХЛЛ, в том числе и среди генов, ответственных за репарацию ДНК, продолжается [27]. Фармакогеномика приобретает все большее значение для индивидуализации типовой тера­пии.

Длина теломер является значимым и независимым предиктором многих клинических событий при ХЛЛ, как, впрочем, и развития синдрома Рихтера, что отмече­но выше [2]. В то же время наличие в клетках больного ХЛЛ как IGVH4-39, так и стереотипного HCDR3 при по­становке диагноза указывает на высокий риск развития синдрома Рихтера (независимый предиктор), но не на риск прогрессирования ХЛЛ без рихтеровской транс­формации. Изменения в экспрессии генов, которые обеспечивают поддержание длины теломер в норме, сви­детельствуют о нарушении механизмов их функциони­рования при ХЛЛ [29]. Короткие теломеры ассоцииру­ются с комплексными генетическими нарушениями, ге­номными аберрациями высокого риска, короткой про­должительностью жизни без терапии и сниженной об­щей выживаемостью [30]. Правда, при этом неясно, ка­кое из генетических нарушений является первичным.

На проявления клинической картины заболевания оказывает влияние и уровень микроРНК (miR), которые представляют собой класс небольших некодирующих молекул РНК, участвующих в регуляции генов. Уровни miR-29c и miR-223 снижены у больных с плохим про­гнозом заболевания, установленным в соответствии с из­вестными прогностическими показателями [31], что под­тверждается агрессивным течением болезни, наличием большего количества лейкозных клеток и неблагоприят­ной эволюцией состояния больного, а также корреляци­ей с длительностью выживания без лечения и общей вы­живаемостью. Учет этих факторов способствует индиви­дуализации стандартной тактики ведения больных. В большинстве лейкозных клеток при ХЛЛ снижено и со­держание miR-15 и miR-16, которые отрицательно регу­лируют Вс1-2 на посттранскрипционном уровне [32]. Из­вестно, что активация других miR, например miR-1066, способствует апоптотическому ответу клеток по р53-не-зависимому пути [33]. В роли регулятора резистентности лейкозных клеток может выступать miR-34a [34].

При ХЛЛ пролиферирует только небольшая фракция клеток, а остальные клетки не находятся в клеточном цикле. Однако эти клетки в организме характеризуются повышенной резистентностью к апоптозу благодаря своеобразному механизму аутокринной секреции проан-гиогенного фактора роста эндотелия сосудов (Vascular endothelial growth factor — VEGF) [35]. Повышенная сек­реция VEGF обеспечивается мезенхимальными стволо­выми клетками вследствие секреции лимфоцитами тромбоцитного ростового фактора (platelet-derived growth factor — PDGF), т. е. лейкозные лимфоциты сами обла­дают способностью активировать функцию стволовых мезенхимальных клеток, усиливая их миграцию и про­лиферацию, создавая тем самым благоприятное для вы­живания микроокружение. Паракринные механизмы также принимают участие в этом процессе [36]. Эндоте-лиальные клетки сосудов поддерживают жизнеспособ­ность лейкозных лимфоцитов вследствие повышающей регуляции Вс1-2 и Вс1-Х, [37]. Коэкспрессия двух или бо­лее белков семейства ингибиторов апоптоза в клетках при ХЛЛ указывает на неблагоприятный прогноз. Спон­танному апоптозу в большей степени подвергаются клет­ки с комплексными хромосомными аберрациями и сни­женным содержанием Вс1-2, чем клетки с прогностиче­ски благоприятной цитогенетикой, которые характери­зуются низкой чувствительностью к апоптозу in vitro и повышенной иммуногенностью [38]. Влияние интенсив­ности спонтанного апоптоза лейкозных клеток, особен­но в связи с соотношением этого процесса с пролифера­цией и с чувствительностью к лекарственно-индуциро­ванному апоптозу, на клинический фенотип заболевания нуждается в дальнейшем изучении. Так как взаимодей­ствия между лейкозными клетками и внеклеточным мат-риксом, являющимся существенным компонентом мик­роокружения, частично опосредуется через CD44, диме-ризация CD44 активирует антиапоптотические механиз­мы (через сигнальные пути PI3K/AKT и MARK/ERK по­вышается уровень белка MCL-1), которые защищают клетки при ХЛЛ не только от спонтанного, но и от флу-дарабининдуцированного апоптоза [39]. Клетки с нему-тантным статусом гена IgVH характеризуются более вы­сокой экспрессией CD44, что и определяет агрессивное течение заболевания. Стимуляция CD40 также способст­вует пролиферации, избеганию апоптоза [40], а также формированию резистентности к различным лекарст­венным препаратам, в том числе и к флударабину. Од­нако в клетках с мутантным IgVH лекарственная чувстви­тельность восстанавливается при добавлении в среду культивирования синтетического олигонуклеотида CpG, тогда как клетки с немутантным статусом lgVu сохраняют свою резистентность, что связывают с различиями в ак­тивации сигнального пути NF-кВ в клетках обоих типов. Ряд цитокинов поддерживают пролиферацию и выжи­ваемость клеток при ХЛЛ, тогда как другие, напротив, способствуют их апоптозу, что объясняют активацией различных сигнальных путей, однако пока не установле­но связи ответа клеток на эти цитокины с экспрессией прогностических факторов [41]. Более высокая способ­ность лейкозных клеток при ХЛЛ включать сигнальные пути Akt/Mcl-1, обеспечивающие устойчивость к апоп­тозу, и экспрессия ряда генов через BCR характерны для прогностически неблагоприятных случаев ХЛЛ [42]. Первоначальная клональная экспансия и последующая прогрессия ХЛЛ тесно связаны с этими процессами, хотя стимуляция BCR in vitro, напротив, индуцирует апоптоз. Участие сигнального пути, запускаемого через BCR, в поддержании резистентности к апоптозу клеток при ХЛЛ in vitro подтверждается обнаружением повышенной экс­прессии селезеночной тирозинкиназы, которая является ключевым компонентом этого пути, что опять-таки бо­лее характерно для клеток с немутантным вариантом IgVH. Допускается возможность применения ингибито­ров упомянутого фермента при ХЛЛ в случае наличия неблагоприятных прогностических факторов, так как при этом возможны усиление действия флударабина и независимость от защитного влияния микроокружения. Несмотря на экспрессию Fas на поверхности лейкозных клеток, они остаются резистентными к Fas-индуциро­ванному апоптозу. Более того, индукция Fas-экспрессии не способствует нарастанию интенсивности Fas-опосре­дованного апоптоза [43], хотя связывание CD40 повыша­ет чувствительность лейкозных клеток при ХЛЛ к Fas-опосредованному апоптозу [44]. Ядерный фактор кВ (NF-кВ), рассматриваемый как общее название для группы индуцируемых гомо- и гетеродимерных транс­крипционных факторов, состоящих из членов семейства Rel ДНК-связывающих белков, повышает выживаемость клеток, индуцируя апоптозингибирующие белки. Для лейкозных клеток при ХЛЛ характерна высокая консти­тутивная активация этого фактора по сравнению с нор­мальными В-клетками. Этот неблагоприятный прогно­стический фактор связан с экспрессией ZAP-70. Дейст­вительно, к стимуляции BCR оказываются более чувст­ви'тельными гАР-70+-клетки. Снижение ДНК-связы-ваюшей способности NF-кВ усиливает апоптоз в лейкоз­ных клетках, причем между этой способностью и чувст­вительностью к флударабину существует обратная кор­реляция [45].

Сопоставление уровня пролиферации клеток с раз­личными клиническими и лабораторными проявления­ми ХЛЛ не всегда дает однозначные результаты, хотя со­держание клеток в S + С^М-фазах клеточного цикла среди лейкозных В-клеток выше, чем среди нормальных В-клеток, причем в костном мозге оно выше, чем в пе­риферической крови. Частота случаев с анеуплоидией ДНК при ХЛЛ обычно невысокая и ассоциируется с бо­лее высоким содержанием клеток в S + G2/M-<pa3ax, три-сомией 12. Более высокий уровень пролиферации клеток характерен для больных в стадиях В и С по сравнению с аналогичным показателем у больных в стадии А, с двумя или более экстранодальными областями лейкозной ин­фильтрации, с тромбоцитопенией ниже 100 • 109/л, с по­вышенным уровнем активности лактатдегидрогеназы. Напротив, наличие лейкоцитоза и лимфоцитоза ассо­циируется с меньшей долей клеток в S + Gj/M-фазах. Количество пролиферирующих клеток не коррелирует с характеристикой общего статуса, наличием аденопатии, анемии, стабильным или прогрессирующим состоянием заболевания [46]. Однако пролиферативная способность немутантных клеток достоверно выше, чем мутантных [47]. Поскольку повышенная пролиферативная актив­ность часто сочетается с высокой способностью к спон­танному апоптозу, перспективным для оценки связи клинического фенотипа с пролиферативным статусом лимфоидной популяции клеток при ХЛЛ может оказать­ся дополнительный учет соотношения между пролифе-рирующими и апоптотическими клетками, тем более что при ХЛЛ в течение 1 дня может замещаться от 0,1 до 1 % клонов опухолевых клеток [48, 49]. Пролиферация и вы­живаемость лейкозных В-лимфоцитов могут быть обу­словлены не столько их внутриклеточными свойствами, сколько взаимодействием с клетками микроокружения (дендритные клетки фолликулов, стромальные клетки костного мозга, интерлейкин-6-продуцирующие эндоте-лиальные клетки, клетки, продуцирующие фактор стро-мальных клеток, С04+-Т-клетки, экспрессирующие CD40L). Вместе с тем клетки, находящиеся в нишах, обеспечивающих их химиорезистентность (например, в лимфатических узлах), могут быть чувствительными к ингибиторам с-АЫ (иматинибу или дасатинибу [50]. Именно в лимфатических узлах формируются клетки, резистентные к цитостатическим препаратам [51]. Не­смотря на способность активных форм кислорода (АФК) усиливать пролиферацию и генетическую нестабиль­ность, значительное увеличение их уровня индуцирует гибель лейкозных клеток, что чаще наблюдается при на­рушении функции р53. В таких случаях следует ожидать более эффективный ответ на АФК-стимулирующую те­рапию у больных с неблагоприятным прогнозом, тем бо­лее что содержание АФК в лейкозных клетках выше, чем в нормальных. Это в сочетании со сниженным уровнем глутатиона способствует окислительному повреждению ДНК и возникновению мутаций митохондриальных ДНК, особенно у ранее леченных больных [52].

На основании использования молекулярных и рас­четных методов анализа генов IgVH предполагают, что при наличии на клетках кластерных (стереотипных) BCR (экспрессирован ограниченный набор высококонсерва­тивных BCR) и при гетерогенном некластерном репер­туаре иммуноглобулинов BCR на клетках других больных клоногенные предшественники лейкозных клеток могут происходить из разных субпопуляций В-клеток, харак­терных для врожденного и традиционного адаптирован­ного иммунитета. При этом клетки — предшественники

ХЛЛ, активируясь или реактивируясь, например, мик­робными патогенами, получают сигналы, способствую­щие их выживаемости, экспансии, злокачественной трансформации и в последующем клональной эволюции [53]. Важно, что специфика стереотипной соматической гипермутабельности может варьировать у разных боль­ных с мутантным статусом генов иммуноглобулинов и даже при наличии минимально мутантных последова­тельностей. В связи с этим следует, что С05+-В-клетки при ХЛЛ ведут свое происхождение из клеток, которые продуцируют так называемые естественные антитела, устраняющие апоптотические клетки и патогенные бак­терии [54]. Более того, очевидно, что лейкозные клетки при ХЛЛ с генами IGHV3-21/IGLV3-21 происходят из В-клеток, которые подверглись соматической мутации и созреванию в зародышевом центре в процессе вызванно­го антигеном иммунного ответа до перестройки имму-ноглобулиновых рецепторов и после лейкозогенной се­лекции в зародышевом центре [16]. Не исключено, что представление о стволовых лейкозных клетках при ХЛЛ, являясь частью общей проблемы стволовых опухолевых клеток, имеет свои особенности, обусловленные зрело-клеточным морфологическим субстратом этого заболе­вания и спецификой антигензависимого и антигеннеза-висимого образования лимфоидных клеток. Разработка этой концепции может внести свой вклад в создание но­вых подходов к терапии ХЛЛ, исходящих из более пато­генетически оправданного выбора мишеней воздействия налейкозный процесс. По-видимому, эволюция популя­ции лейкозных клеток может быть обусловлена накопле­нием изменений тех биологических свойств, которые ра­нее присутствовали в клетках (например, более выражен­ная экспрессия некоторых поверхностных антигенов, индукция белков множественной лекарственной устой­чивости и др.), отбором в результате химиотерапии пред-существующего субклона, который ранее присутствовал в популяции в незначительном количестве и которому изначально присуща лекарственная резистентность, или, наконец, появлением нового клона клеток вследствие качественно новых генетических изменений. Динамика клинического фенотипа заболевания может быть обу­словлена и изменением реакции организма непосредст­венно на опухолевый процесс или на другие эндогенные или экзогенные факторы в частности за счет углубления дисбаланса иммунитета, развития иммунодефицита или аутоиммунных осложнений, присоединения инфекций (микробы, вирусы, грибы), проявлений недостаточности нормального кроветворения и др.

Совокупность биологических свойств лейкозных кле­ток определяет клинические проявления заболевания и обладает предсказательной ценностью в плане индиви­дуализации ответа на терапию и вероятности исхода ХЛЛ. Системы стадирования заболевания только по кли­ническим признакам, несмотря на их известную прогно­стическую значимость, все же менее пригодны для вы­деления групп больных с потенциальной вероятностью быстрого прогрессирования ХЛЛ или с длительным ста­бильным состоянием. Между генотипом, его экспресси­ей в лейкозных клетках и клиническим фенотипом су­ществуют неоднозначные взаимоотношения, что, по-ви­димому, определяет многообразие форм клинического течения заболевания. Это разнообразие подкрепляется еще и тем, что в клетках с различным генотипом при дей­ствии эндогенных, и экзогенных факторов микроокруже­ния могут использоваться различные сигнальные пути, что может быть продемонстрировано in vitro. Разумеется, генетически детерминированный ответ систем целостно­го организма на присутствие в нем опухолевых клеток и экзогенные терапевтические воздействия на эти клетки вносят свой вклад в формирование клинического фено­типа болезни. Сходным клиническим проявлениям ХЛЛ могут соответствовать отличающиеся биологические свойства лейкозных клеток, которые, с одной стороны, могут определять срок развития этих симптомов и ответ на терапию (степень риска), а с другой — определять тип молекулярно-генетического субстрата и чувствительно­сти к лекарственным препаратам. В свою очередь в ос­нове отличающегося клинического фенотипа у разных больных могут лежать сходные биологические свойства клеток.

Хотя поведение клеток в культуре не всегда коррели­рует с клиническим течением, временем удвоения кле­точной лимфоидной популяции, некоторыми молеку­лярными маркерами [55], заслуживает внимания ответ клеток на воздействия in vitro как показатель их биоло­гических особенностей и гетерогенности клинического течения [56]. Это может касаться профилей экспрессии генов (лекарственной резистентности, репарации, апоп­тоза, включения различных сигнальных путей, выживае­мости клеток в ответ на повреждения и др.), т. е. оцени­ваться должны не столько статика биологических свойств клеток и их изменчивость в процессе развития заболевания, сколько ответ клеток на комплекс воздей­ствий in vitro как показатель особенностей их биологиче­ского фенотипа. При отсутствии ответа клеток на стиму­ляцию BCR можно предположить более благоприятное течение ХЛЛ, тогда как способность клеток больного реагировать на указанный тип воздействия коррелирует с неблагоприятным прогнозом. Полагаем, что репара-тивные возможности клетки в ответ на действие цито-статиков либо ионизирующего облучения in vitro с уче­том активности ферментов, участвующих в репарации [57], являются существенной характеристикой биологи­ческих свойств опухолевых клеток, определяющих их выживаемость в процессе терапии. Экспрессия белков множественной лекарственной резистентности в ответ на действие цитостатических препаратов отражает по­тенциальную возможность клеток выводить из них ле­карственные препараты и тем самым снижать чувстви­тельность к ним, тем более что экспрессия этих белков в интактных лейкозных клетках однозначно не связана с резистентностью клеток к лекарственным препаратам [58]. Таким образом, ответ на различные воздействия, например способствующие экспрессии защитных систем клетки, может использоваться для предсказания эволю­ции заболевания и прогнозирования адекватности на­значаемой терапии. Фактически оценка молекулярного субстрата эффекта стимуляции сигнальных путей в клет­ке может рассматриваться и с этой точки зрения, а оп­ределение лекарственной чувствительности клеток к от­дельным препаратам in vitro позволит даже проводить от­бор этих препаратов для терапии. При этом исследова­ния in vitro путей подавления лекарственной резистент­ности лейкозных клеток имеют определенную клиниче­скую значимость.

По-видимому, в понятие биологического фенотипа, особенно при анализе патогенеза заболевания с позиций гетерогенности клинического фенотипа и возможностей воздействия на опухолевый процесс при ХЛЛ в принци­пе и у конкретного больного в частности, должны быть включены и типы реакций лейкозных клеток на потен­циальные эндо- и экзогенные воздействия, что может определить новые направления в решении проблемы ХЛЛ. "Реактивный" (потенциальный) молекулярно-био-логический фенотип клеток может способствовать про­гнозированию характера развития клинического фено­типа. Результаты определения лекарственной резистент­ности и способы ее преодоления in vitro следует рассмат­ривать как вероятные проявления "реактивного" молеку-лярно-биологического фенотипа клеток, а ответ больно­го на терапию in vivo — как проявление "реактивного" клинического фенотипа.

При внедрении в рутинную клиническую практику ряда новых наукоемких методов исследования предстоит еще решить вопрос о степени их взаимозависимости, об экономической целесообразности использования полу­чаемых с их помощью результатов с учетом диагности­ческой или прогностической значимости этих данных и в первую очередь возможности выбора адекватной тера­пии. При этом следует иметь в виду, что оценка эконо­мической эффективности сугубо прикладных и фунда­ментально ориентированных результатов нуждается в различных подходах.
ЛИТЕРАТУРА

1. 
   Matutes