Организация биодеградативных путей у родококков
Скачать 0.91 Mb.
|
На правах рукописиСОЛЯНИКОВА Инна Петровна ОРГАНИЗАЦИЯ биодеградативныХ ПУТЕЙ у РОДОКОККОВ специальность 03.00.04. – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино, 2007 Работа выполнена в лаборатории энзиматической деградации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К Скрябина РАН. Научный консультант: доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Головлева Людмила Алексеевна Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН Официальные оппоненты: доктор биологических наук Кулаковская Татьяна Валентиновна Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН доктор биологических наук, профессор Мальян Александр Нерсессович Институт фундаментальных проблем биологии РАН доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна Институт микробиологии РАН Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН Защита состоится года в часов мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН по адресу: 142290, г.Пущино Московской области, проспект Науки, 5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте http//www.ibpm.ru Автореферат разослан « » 2007 г. Ученый секретарь Диссертационного совета  доктор биологических наук В.М.Вагабов ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. За последние десятилетия в окружающую среду попало огромное количество промышленных отходов, сельскохозяйственных химикатов и продуктов их частичной трансформации, не имеющих аналогов или редко встречающихся в природе. Это оказало огромное влияние на все уровни организации живой материи и, без сомнения, нарушило то равновесие, которое создавалось на протяжении миллионов лет. Учитывая распространенность, токсичность и устойчивость различных классов ксенобиотиков, мы выбрали для изучения процессов деградации гало-генированные моноароматические производные фенола и бензоата с одним-тремя заместителями. Эти соединения широко используются при производстве пластика, жидкостей для тушения огня, красителей, гербицидов, фунгицидов, растворителей и др. Так, в Финляндии с 1934 по 1988 г было использовано около 30 000 тонн различных хлорфенолов [Kitunen et al., 1987; Kitunen, 1990], До 300 г хлорированных фенольных соединений (фенолы, катехолы, гваяколы, сиринголы и ванилины) образуется на одну тонну пульпы при ее хлорном отбе-ливании, что привело к их накоплению порядка микрограмм на литр воды и миллиграмм на один кг (сухой вес) донных отложений в озерах, принимающих обработанные сливы [Salkinoja-Salonen et al., 1981]. Исследования in vitro показали, что хлорфенолы разобщают окислительное фосфорилирование, нарушают микросомальную детоксификацию, влияют на синтез белков и РНК [Lundberg et al., 1980; Erlich et al., 1987; Priston et al., 1987]. Физико-химические методы обезвреживания либо не обеспечивают деток-сификацию хлорфенолов, либо чрезвычайно дороги по сравнению с биологи-ческими (электронно-лучевой метод подготовки питьевой воды, считающийся одним из наиболее эффективных и надежных, требует 5 кВт-ч/м3 при производительности 50 м3/ч [Строкин, 2007]). То же касается сжигания хлорфе-нолов, - при недостаточно высокой температуре неизбежно образуются неизмеримо более токсичные полихлордиоксины, а проведение процесса при необходимо высоких температурах делает весь процесс дорогостоящим. Составляя основу круговорота углерода в биосфере, бактерии являются перспективными объектами для решения проблем рационального природо-пользования, а именно: 1) создания технологий эффективного обезвреживания отходов на стадии производства, что будет препятствовать попаданию в окружающую среду вредных соединений, и 2) создания технологий и методов обезвреживания токсикантов, уже попавших в окружающую среду. Только энзиматическое дегалогенирование позволяет получать безопасные продукты разложения галогенированных фенолов. Вышесказанным обусловлена необходимость всестороннего изучения фер-ментативных процессов разложения ксенобиотиков. Такой подход позволяет не только интенсифицировать микробную деградацию трудно разлагаемых соеди-нений, но способствует пониманию процессов эволюции путей метаболизма, что, в свою очередь, может служить основой для лабораторного создания био-деградативных путей и отдельных ферментов с заранее заданными свойствами. Исторически изучение микробного разложения ксенобиотиков начали с грам-отрицательных бактерий, преимущественно псевдомонад. Однако более поздние исследования грам-положительных бактерий показали, что их метаболический потенциал не ниже, чем у микроорганизмов других групп, а ряд физиологических отличий, в частности, устойчивость к стрессовым воздей-ствиям и способность к длительному периоду метаболической активности, делают их перспективным объектом как для изучения фундаментальных вопросов (например, изучение основ субстратной специфичности ферментов), так и в прикладном аспекте. Все это, плюс широкое распространение бактерий рода Rhodococcus в почве, и, самое главное, - способность разлагать широчай-ший круг абиотических соединений, определило наш интерес к этой группе бактерий. Состояние вопроса. К началу настоящей работы было известно, что первые этапы разложения разнообразных ароматических соединений микро-организмами приводят к образованию ограниченного числа ключевых интерме-диатов, дальнейшее превращение которых проходит по нескольким метаболи-ческим путям. Одним из ключевых интермедиатов является пирокатехин [Ornston, 1966], его разложение по орто-пути последовательно катализируют пирокатехин 1,2-диоксигеназа (ПК 1,2-ДО), муконатциклоизомераза (МЦИ), муконолактонизомераза и еноллактонгидролаза. При росте микроорганизмов на галогенированных субстратах помимо пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути обнаружен второй фермент, расщепляющий 3-хлорпирокатехин, - хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа (ХПК 1,2-ДО) [Dorn, Knackmuss, 1978a; Schmidt et al., 1980]. Было показано, что трансформацию 3-хлорпирокатехина в β-кетоадипат у Pseudomonas sp. B13 осуществляют ХПК 1,2-ДО, хлормуконатциклоизомераза (ХМЦИ), диенлактонгидролаза (ДЛГ) и малеил-ацетатредуктаза (МАР). Этот путь назвали модифицированным орто-путем [Schlömann, 1994]. Данные работы можно считать началом разностороннего изучения ферментов разложения (хлор)пирокатехинов и это было одним из немногих результатов, полученных к началу наших экспериментов. Дальней-шие исследования, относящиеся с девяностым годам, также проводились в основном на грам-отрицательных бактериях [Pieper et al., 1985, 1988]. Установлено, что гены, кодирующие ферменты модифицированного орто-пути у грам-отрицательных бактерий, организованы в опероны сходной структуры и характеризуются высокой степенью идентичности. Показано, что ферменты, катализирующие аналогичные реакции разложения, характеризуются рядом общих свойств, тем не менее, субстратная специфичность ферментов находится в прямой зависимости от тех субстратов, которые являются ключевыми интермедиатами при разложении ксенобиотиков [van der Meer et al., 1991a,b]. Предпринятая позже попытка методом сайт-направленного мутагенеза изме-нить субстратную специфичность (хлор)муконатциклоизомераз у грам-отрица-тельных бактерий не дала однозначных результатов. [Vollmer et al., 1998, Kaulmann et al., 2001]. Также ничего не было известно о пространственной структуре хлорпирокатехаз из грам-отрицательных бактерий; остался откры-тым вопрос об основах различий субстратной специфичности этих ферментов. На момент начала нашей работы практически ничего не было известно о ферментах разложения хлорпирокатехинов у родококков, но, учитывая их способность проявлять метаболическую активность, можно было предполо-жить, что эта группа микроорганизмов представляет несомненный интерес для исследователей с точки зрения изучения влияния токсикантов на живые системы. Цель настоящей работы. В связи с обозначенными предпосылками, целью работы явилось изучение организации биодеградативных путей бактерий рода Rhodococcus для выявления биохимических и молекулярных основ метаболической активности штаммов-деструкторов устойчивых поллютантов. Для достижения поставленной цели было необходимо выполнение следующих задач:
Научная новизна работы. Проведен широкий поиск среди предста-вителей грам-положительных бактерий рода Rhodococcus на способность разлагать галогенированные ароматические соединения и отобраны наиболее активные штаммы-деструкторы. Изучены процессы разложения 2- и 4-хлорфенолов, бензоата, фенола, 4-метилбензоата штаммами R. opacus 1cp, R. ruber P25, R. rhodnii 135, R. rhodochrous 89. Показано, что при использовании в качестве ростового субстрата каждого из эти соединений у родококков происходила индукция уникального набора ключевых ферментов, в первую очередь диоксигеназ, которые по субстратной специфичности можно разделить на три группы – пирокатехин 1,2-диоксигеназы обычного орто-пути, хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназы модифицированных орто-путей, метилпирокатехин 1,2-диокси-геназы. Впервые всесторонне охарактеризованы ферменты разложения 4-хлорпирокатехина: 4-хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа, хлормуконатцикло-изомераза, диенлактонгидролаза штамма R. opacus 1cp. Показано, что по физико-химическим и каталитическим свойствам они значительно отличаются от аналогичных ферментов из грам-отрицательных бактерий. Исследовано разложение 3-хлорпирокатехина у R. opacus 1cp, что позволило обнаружить новый модифицированный орто-путь, который до сих пор в литературе не описан. Клонирован оперон, кодирующий ферменты 3-хлорпирокатехиновой ветви модифицированного орто-пути у штамма R. opacus 1cp. Сравнение нуклеотидных последовательностей, кодирующих ключевые ферменты, показало, что хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназа и хлормуконатциклоизомераза из R. opacus 1cp ближе к аналогичным ферментам обычного орто-пути грам-положительных бактерий, чем к хлорпирокатехазам модифицированного орто-пути грам-отрицательных бактерий. Изучены свойства муконатциклоизомеразы обычного орто-пути штамма R. rhodochrous 89 и установлено, что этот фермент отличается по субъединичному составу и свойствам от всех известных муконатциклоизомераз и занимает промежуточное положение между аналогичными ферментами грам-положительных и грам-отрицательных бактерий. Впервые изучено превращение 2-галомуконата (фтор-, хлор-) (хлор)му-конатциклоизомеразами грам-положительных бактерий – реакция, которую можно считать определяющей при характеристике ферментов этого класса. Обнаружены их существенные отличия от ферментов из грам-отрицательных бактерий. Показано, что муконат- и хлормуконатциклоизомеразы из R. opacus 1cp способны выбирать направление циклоизомеризации 2-хлормуконата, что приводит к образованию 5-галомуконолактона. Реакцию превращения 5-гало-муконолактона в цис-диенлактон у R. opacus 1cp при росте на 2-хлорфеноле катализирует новый фермент, хлормуконолактондегалогеназа, аналог которого отсутствует в модифицированных орто-путях грам-отрицательных бактерий. Обнаружена необычная способность муконатциклоизомеразы из штамма R. rhodochrous 89 осуществлять превращение 2-хлормуконата, 2-хлор- и 5-хлормуконолактона в цис-диенлактон, а не в его транс-изомер, что характерно для грам-отрицательных бактерий. Впервые методом рентгено-структурного анализа расшифрована пространственная структура хлорпирокатехин 1,2-диоксигеназ 3-хлор- и 4-хлорпирокатехиновых ветвей модифицированного орто-пути штамма R. opacus 1cp на основании разработанного нами способа получения высокоочищенных препаратов этих ферментов и наличия их полной аминокислотной последова-тельности. Показано, что каждый фермент состоит из двух каталитических доменов и одного связующего центрального домена, содержащего две моле-кулы фосфолипидов. Установлено, что структура центральной части каталити-ческих доменов не отличается от таковой других интрадиольных диоксигеназ и содержит атом трехвалентного железа, пятикоординированный двумя остатка-ми гистидина, двумя остатками тирозина и гидроксилом воды. Тем не менее, в структуре активного центра обнаружены дополнительно по молекуле бензоата (у 4-ХПК 1,2-ДО) и бензогидроксамата (у 3-ХПК 1,2-ДО). Проведенное сравне-ние структур активных центров 3-ХПК 1,2-ДО и 4-ХПК 1,2-ДО позволило сде-лать предположение, что разница в субстратной специфичности этих фермен-тов опосредуется парами измененных аминокислотных остатков в той части, которая отвечает за связывание фермента с субстратом, прежде всего Val53/Ala53, Tyr78/Phe78 и Ala221/Cys224 (3-ХПК 1,2-ДО/4-ХПК 1,2-ДО). Практическое значение работы. Проведенные нами исследования позволили создать коллекцию наиболее активных штаммов, способных разлагать устойчивые галогенированные поллютанты – хлор- и фторфенолы, хлорбензоаты, хлорбифенилы. При разложении 2- и 4-хлорфенолов получены штаммы, адаптированные к высоким концентрациям токсикантов и характе-ризующиеся высокой скоростью их разложения. Ряд результатов – изучение особенностей процессов биодеструкции хлорфенолов штаммом R. opacus 1cp; разработка способов интенсификации процесса разложения токсикантов в биореакторе; возможность на основании полученных данных по простран-ственной структуре молекул методом сайт-направленного мутагенеза получать ферменты с заданной/измененной субстратной специфичностью – позволяет создать высокоэффективные бактериальные или ферментные препараты для очистка загрязненных территорий, а также оптимизировать процессы биореме-диации и очистки промышленных стоков, содержащих галогенированные ксенобиотики. Материалы диссертационной работы используются в лекциях для профессорско-преподавательского состава ВУЗов РФ и в лекциях для молодых ученых на Всероссийских конференциях, организуемых Пущинским Научным центром. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Методические рекомендации по изучению дисциплины дв 2 Научная организация... Б дв организация научно-исследовательской работы студентов являются формирование системы знаний об организации и проведении различных... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Организация противопожарного режима. Содержание путей эвакуации. Места для курения и использование открытого огня. Особенности соблюдения... |
 | Технологическая карта дисциплины «Психология» Кафедра Б дв организация научно-исследовательской работы студентов являются формирование системы знаний об организации и проведении различных... | | Рабочая программа по дисциплине гсэ. В. 3/ Опд. В. 1/ гсэ. В. 4 /... «Экономика и управление»/ 190700 «Организация перевозок и управление на транспорте»/ 180400 «Эксплуатация водного транспорта и транспортного... |
| «Московский государственный университет путей сообщения» рабочая программа Ярославский филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский... | | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... Информатика: задания и методические указания к контрольной работе для студентов всех специальностей очной и заочной форм обучения... |
| Рабочая программа дисциплины «психология» для студентов Б дв организация научно-исследовательской работы студентов являются формирование системы знаний об организации и проведении различных... | | 25 октября 2012 года Управляющим советом школы был проведен рейд... Школьный корреспондент Кочергина Инна брала экспресс-интервью у членов Управляющего совета, у дежурного класса, у учителей и учащихся.... |
| Образовательное учреждение высшего профессионального образования... Область профессиональной деятельности выпускников: изыскания, проектирование и строительство железных дорог и сооружений путевого... | | Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального... Б дв организация научно-исследовательской работы студентов являются формирование системы знаний об организации и проведении различных... |
| Поддьяков А. Н. Неопределенность в решении комплексных проблем //... Б дв организация научно-исследовательской работы студентов являются формирование системы знаний об организации и проведении различных... | | Решение практических задач заказчика проекта Организация рабочего места (наличие и состояние учебных средств, их рациональное размещение),организация режима работы, организация... |
| Комитет образования администрация Заводоуковского городского округа... Б дв организация научно-исследовательской работы студентов являются формирование системы знаний об организации и проведении различных... | | П. К. Рыбин фгбоу впо «Петербургский государственный университет путей сообщения» Программу составили: к т н профессор П. К. Рыбин – фгбоу впо «Петербургский государственный университет путей сообщения» |
| Доклад Заместителя руководителя Волжского государственного бассейнового... Заместителя руководителя Волжского государственного бассейнового управления водных путей и судоходства Лепёхина Е. В | | Организация бухгалтерского учета в банках Автономная некоммерческая организация среднего профессионального образования «Ставропольский колледж экономики и дизайна» |
