* Норма: Шелухин, 1974; Субботкин, 1979; Лукьяненко, Гераскин, 1966; Сухопарова, Сухенко, 1986. Жирным шрифтом выделены статистически значимые отклонения от относительной нормы.
25% (1988 г.) содержания натрия (p<0,05) с последующим его снижением (8,5-9,4%), и подъём уровня кальция в 1,5-2,2 раза от величин 70-х годов (Наточин и др., 1975, 1995). В это же период отмечаются существенные изменения в морфологическом составе крови (табл. 2). При этом отмечалась нестабильность
Таблица 2
Лейкоцитарная формула крови русского осетра (%)
Годы
|
Миелобл.
|
Нейтрофилы
|
Эоз.
|
Мон.
|
Лимф.
|
ИСЛ
|
юные
|
зрелые
|
пат.
|
1988
|
28,6
|
16,5
|
8,8
|
невыд.
|
23,6
|
-
|
22,5
|
3,4
|
1989
|
19,5
|
8,6
|
6,1
|
1,8
|
26,2
|
-
|
37,8
|
1,64
|
1990
|
-
|
9,0
|
6,5
|
-
|
20,6
|
-
|
63,9
|
0,56
|
Норма*
|
-
|
1,6
|
5,0
|
-
|
12,8
|
-
|
80,6
|
0,24
|
Примечание: Миелобл. – миелобласты, пат. – патологические, Эоз – эозинофилы, Лимф. – лимфоциты, ИСЛ – индекс сдвига лейкоцитов. * Норма: Сухопарова, Сухенко, 1986
функционирования интерреналовой железы: вначале повышение активности, с интенсивным синтезом кортизола (12,15±1,8 нг/мл), затем - напряжение и истощение, при снижении поступления в кровь кортизола до 2,3±0,7 нг/мл (Баранникова и др., 1989, 1990; Баранникова, 1992). В это время уменьшается секреция в кровь половых стероидных гормонов примерно в 3 раза (1989 г.). Выявленное снижение биохимических и гематологических параметров крови в дальнейшем (1990 г.) сменилось тенденцией к нормализации, однако в отношении интерреналовой железы и кортизола такого не отмечалось.
Сходные изменения были зарегистрированы и у других видов осетровых - севрюги и белуги, но с присущими для этих видов особенностями.
Изменения в физиологическом состоянии осетровых в море отразились и на производителях, мигрирующих на нерест. Они проявились в усилении имевшихся изменений в биохимических показателях и появлением новых, ранее не встречавшихся. Практически все исследуемые показатели претерпели изменения в ту или иную сторону, в сравнении с 60-70-ми годами прошлого века, что можно видеть на примере самок русского осетра (рис. 1).
Рис. 1. Межгодовая изменчивость физиолого-биохимических показателей
у самок русского осетра
Также как и в море, у русского осетра, выловленного в дельте и под плотиной Волгоградской ГЭС, обнаружены аналогичные изменения в ионном составе крови: увеличение содержания кальция более чем в два раза у рыб, выловленных в дельте и в 1,6 раза под плотиной Волгоградской ГЭС (Кузьмина и др., 1992). Изменения в обмене веществ и минерального обмена сопровождались существенными колебаниями концентраций в крови кортикостероидных гормонов (Баранникова и др., 1989, 1990; Баранникова, 1992). Наиболее высокие концентрации в крови кортизола отмечались в весенние месяцы 1988 г., как у самок (48-40 нг/мл), так и у самцов (78-57 нг/мл) со снижением к июню до 16 нм/мл у тех и других. В дальнейшем имеет место относительная стабилизация его уровня с колебаниями в пределах 15-29 нг/мл. Примерно такая же динамика зафиксирована и в отношении половых гормонов прогестерона и тестостерона у самок и самцов. Похожая динамика отмечена и у эстрадиола. Негативным образом отразилось загрязнение среды обитания и на гематологических показателях производителей русского осетра, мигрирующего на нерест. Характер и направленность зафиксированных изменений (p<0,01) были схожими с таковыми в морской период жизни этих рыб с некоторым усилением. Наиболее рельефно они смотрелись у ослабленных производителей, подошедших к плотине Волгоградской ГЭС: СОЭ возрастало в 2 раза, при снижении в крови количества эритроцитов на 30%, в 1,6 раза лейкоцитов и 1,4 содержания гемоглобина, с трансформацией лейкоцитарной формулы. При этом индекс сдвига лейкоцитов возрастал в 4,6-5 раз от величин отмечаемых ранее. У самцов изменения гематологических параметров крови практически не отличались от самок. Не остаются неизменными в этих условиях и функциональные свойства гемоглобина: сродство гемоглобина к кислороду увеличивается в 1,3, а величина эффекта Бора 3,3 раза (Камшилов, 1990). В красной крови, наряду с увеличением гемолиза эритроцитов, наблюдается усиление кроветворения. Пониженная устойчивость эритроцитов к гемолизу, подтверждается и данными по осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) крови русского осетра (Васильев, 1990). Она в 1988 и 1989 гг. была в 1,7-1,6 раза меньше, чем в 60-х годах.
У севрюги и белуги развитие реакции на загрязнение водной среды принципиально не отличалось от таковой осетра, хотя имели свои особенности.
Трансформации в обмене веществ, гормональном статусе и в целом в физиологическом состоянии повлияли на состояние половых желез осетровых рыб, в которых, выявленные в конце 80-х годов изменения, были настолько существенны, что привели к нарушению половой функции (Гераскин и др., 2001). Это не только большое разнообразие выявляемых патологий с появлением качественно новых форм, но и достаточно высокая частота встречаемости таких рыб. В море у рыб II СЗГ были обнаружены: гермафродитизм, интерсексуальность, опухоли, кисты и другие новообразования, отмечались сильные воспалительные процессы. В половых клетках изменения выявлялись, начиная с ооцитов протоплазматического роста. При переходе к вителлогенезу (II-III СЗГ) возрастает как частота встречаемости рыб с патологиями гамето- и гонадогенеза, так их разнообразие и степень.
Кроме того, морфофункциональные нарушения встречались в печени, почках, селезенке, сердце, скелетных мышцах. Наиболее значительными они были в неблагоприятные, с экологических позиций, годы (1988-1989). В печени отмечено повышенное содержание липидов и липофусцина, белковая и жировая дистрофия, нарушения пигментного обмена, сосудистые патологии, хроническая воспалительная инфильтрация паренхимы, некробиоз гепатоцитов, цирротические явления. А в структуре её ткани обнаружены включения: мышц, половых желёз и ооцитов, селезёнки и даже участки с разными типами (до 4) тканей. В почках имело место явление белковой дистрофии и хронического межуточного нефрита, в селезенке – в основном сосудистые нарушения. В сердце нарушения проявлялись изменениями в волокнах и гиперемией кровеносных сосудов, имелись также очаги некроза (Евгеньева, 2000). Наиболее явный характер носили изменения в поперечнополосатой мышечной ткани (ППТМ). Выявлялись участки с нормальным строением ППТМ, слабо, умеренно и сильно выраженными изменениями этой ткани. На последних этапах развития этого процесса зафиксировано также снижение активности АТФ-азы вплоть до полного исчезновения. При далеко зашедшем патологическом процессе в ультраструктуре мышц наблюдалось снижение количества рибосом, исчезновение структуры аппарата Гольджи, полная деструкция митохондрий, фрагментация и набухание саркоплазматического ретикулума, изменение формы ядра (Басурманова, 1994). Конечной стадией разрушения мышечного волокна был полный лизис миофибрилл внутри волокна и разрушение сарколеммы. Впоследствии некротизированная мышечная ткань замещалась жировой или соединительной.
Морфологические изменения в мышцах сопровождались трансформацией их белкового состава проявлявшегося снижением количества выявляемых компонентов и изменением соотношения белковых фракций с большой, средней и низкой молекулярной массой (табл. 3). Наиболее существенные
Таблица 3
Фракционный состав водорастворимых белков белых мышц русского осетра (морской период жизни) с разной степенью морфологических нарушений
Уровень патологии
(баллы)
|
Количество компонентов и их относительное содержание в белковых фракциях
|
ФНМБ
|
ФСМБ
|
ФВМБ
|
∑
|
1-2
|
4 (2-5)
7,5±0,8%
|
6 (4-7)
59,5±0,9%
|
7 (5-8)
33,0±1,1%
|
17 (12-19)
100,0%
|
3
|
2 (1-4)
3,9±0,7%
|
4 (2-7)
63,9±1,6%
|
6 (5-7)
32,2±1,5%
|
13 (11-18)
100,0%
|
4
|
1 (1-2)
4,1±0,3%
|
3 (2-5)
62,0±2,7%
|
5 (4-5)
33,9±2,4%
|
9 (7-13)
100,0%
|
5
|
1 (1-3)
3,4±1,7%
|
4 (4)
69,6±6,2%
|
3 (4-3)
27,0±7,8%
|
8 (8-9)
100,0%
|
Примечание: в числителе количество компонентов, в скобках их размах колебаний, в знаменателе относительное содержание фракции в общем содержании белков мышц
изменения зафиксированы в белковом спектре мышц, имеющих высокую степень морфологических нарушений (Гераскин и др., 1990). По мере углубления мышечной патологии у осетра наблюдается нарастание белкового дефицита, снижение в крови холестерина, с тенденцией понижения у рыб старше 11 лет кортизола, при резко выраженной гиперкальцемии (Кузьмина и др., 1992; Наточин и др., 1995). У рыб с высокой степенью патологии мышц, выявлено также уменьшение (p<0,05) активности ЦО в печени более чем вдвое и увеличение в мышечной ткани в 2,6 раза, при почти неизменном уровне активности ЛДГ и СДГ. Активность ЛДГ в крови (67±11 мкмоль/мин·л) у таких рыб была в два раза выше, чем у особей с нормальными мышцами (35±5 мкмоль/мин·л). На уровне тенденции (на 20%) отмечено снижение активности АОА в печени, у рыб с нарушениями морфологической структуры мышц, что является результатом высокой интенсивности ПОЛ.
У севрюги чёткой связи между биохимическими показателями рыб и глубиной морфологических изменений в мышцах не прослеживалось, за исключением активности ЦО и АОА в печени. Причины таких различий кроятся в видовой специфике развития по времени и степени выраженности реакций организма севрюги в ответ на действие возмущающих факторов среды.
У белуги просматривалось некоторое углубление функциональных сдвигов у особей с дегенеративными изменениями мышечной ткани, как на уровне тенденций, так и подтверждаемые статистически.
Такое развитие реакции организма осетровых рыб на токсическое воздействие окружающей среды можно оценить как острый токсикоз - результат существенного повышения содержания в воде Северного Каспия нефтепродуктов, пестицидов и фенолов (Попова и др., 1992; Мумжу и др., 1989; Ежегодник … за 1990 г.). При его снижении в 1990 г., наблюдается уменьшение уровня функциональных и гистоморфологических изменений.
4. Влияние различных уровней загрязнения Каспийского моря на физиологические системы осетровых рыб
Введение в комплекс показателей, характеризующих физиологическое состояние осетровых, изучение процессов ПОЛ, выявило их значительную изменчивость, которая проявляла определённую зависимость от содержания в морской воде нефтепродуктов, что видно на примере русского осетра (рис. 2).
 
 
ХОП мкг/л Х 10 Zn, Cu, Pb – левая; Сd, Mn -правая шкала
Рис. 2. Межгодовая динамика интенсивности АсПОЛ и СпПОЛ, содержания МДА в печени и мышцах русского осетра и загрязнения моря (по данным лаборатории водных проблем и токсикологии КаспНИРХ) органическими поллютантами и некоторыми металлами
Другая закономерность, связана с сезонными колебаниями содержания в воде нефтяных углеводородов - преимущественным снижением их содержания от летнего максимума к осени (Глумов, 2001), которая отражалась и на сезонной динамике ПОЛ (табл. 4). Интенсификация ПОЛ в печени и мышцах летом зафиксирована у всех исследованных видов осетровых. Она обусловлена выносом токсических веществ паводковыми водами в море и увеличением температуры воды. Считается (Глумов, 2001), что основной объём (около 90%) загрязняющих веществ в Северный Каспий поступает с речным стоком, при сохранении примерного соотношения загрязняющих веществ.
Таблица 4
Параметры перекисного окисления липидов (М±m) мышц и печени русского осетра в разные сезоны года за исследуемый период (1993-2003 гг.)
Сезоны
года
|
СпПОЛ
мкмоль/ч кг
|
АсПОЛ
мкмоль/ч кг
|
МДА
мкмоль/кг
|
мышцы
|
печень
|
мышцы
|
печень
|
мышцы
|
печень
|
Весна
|
28,2±4,0
|
75,4±6,2
|
113,6±7,6
|
108,2±8,8
|
6,2±1,0
|
10,6±0,8
|
Лето
|
42,6±3,4
|
136,8±9,2
|
133,0±5,4
|
184,2±11,4
|
8,8±0,8
|
21,4±1,6
|
Осень
|
24,2±2,0
|
95,8±7,2
|
111,2±4,4
|
142,0±10,2
|
4,6±0,4
|
16,0±1,2
|
Зависимость параметров ПОЛ русского осетра от уровня общего загрязнения вод Северного Каспия демонстрирует и регрессионный анализ. Коэффициент множественной корреляции в этом случае очень высок: от 0,84 до 1,00. Однако достоверными являются лишь регрессионные линейные уравнения зависимости скорости СпПОЛ (У1) в мышечной ткани и накопление в ней МДА (У2) от концентраций в воде исследованных токсикантов: У1 = - 0,20Х1 + 1,37Х2 + 0,416Х3 - 0,35Х4 + 0,44Х5 – 0,88Х6 + 0,21Х7 + 1,05Х8 + 0,249Х9 – 31,59; У2 = - 0,29Х1 + 1,49Х2 + 044Х3 – 0,31Х4 + 0,088Х5 – 0,98Х6 + 0,26Х7 + 1,07Х8 + 0,28Х9 -7,64 соответственно, где Х1 – нефтеуглеводороды; Х2 – фенолы; Х3 – СПАВ; Х4 – ХОП; Х5 – Zn; Х6 – Cu; Х7 – Pb; Х8 – Cd; Х9 – Mn. В этом случае коэффициент множественной корреляции достигает 1,00, показывая прямую линейную зависимость этих параметров ПОЛ от уровня общего загрязнения водной среды. Более детальный анализ выявил достоверную корреляционную связь ПОЛ с содержанием в воде нефтеуглеводородов, фенолов, а также меди и кадмия при высоких коэффициентах корреляции: от 0,61 до 0,84. В случае множественной регрессии, коэффициент корреляции уровня ПОЛ с этим поллютантам достигает 0,84. Из этого следует, что основу негативного влияния загрязнений на русского осетра составляют нефтеуглеводороды, фенолы и кадмий, а также, в некоторой степени, медь.
Анализ в этом отношении параметров ПОЛ двух других видов осетровых дал результаты, свидетельствующие о видовых особенностях реакции этих рыб на загрязнение среды обитания. Однако и в этом случае во всех вариантах регрессионного анализа, достоверно отражающих влияние компонентного состава загрязнения, на первом месте присутствуют нефтеуглеводороды и лишь как дополнение к ним тяжелые металлы и один или два вещества органического происхождения. То есть уровень ПОЛ у осетровых рыб обуславливают не отдельные поллютанты, а их комплекс, индуцируя состояние окислительного стресса. Во всех вариантах множественной регрессии ведущим элементом модели являются нефтеуглеводороды, затем фенолы, а потом тяжёлые металлы. Видовые особенности выражаются в проявлениях связи между параметрами ПОЛ и отдельными видами токсикантов или их сочетанием. Среди тяжёлых металлов выделяется кадмий, который, видимо, в сочетании с нефтеуглеводородами и фенолами увеличивает токсичность последних.
Реагирует на изменения загрязнения морских вод и энергетическая система осетровых. Её ответ проявляется изменениями активностей ключевых ферментов аэробного и анаэробного пути получения энергии в печени и мышцах - цитохромоксидазы (ЦО) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Из-за того, что активность этих ферментов определялась летом, то и уровень загрязнения в сравнительном анализе использовался за это время года. А он, как показано выше, зависит от объёма паводка. При больших паводках активность ЦО в печени снижалась, низких - увеличивалась (рис. 3). Другим доказательством
б
а
б
а
Рис. 3. Межгодовая динамика активности ЦО в печени (а) и соотношение (б) её активностей в печени и мышцах у русского осетра в летний период при различных объёмах паводка
влияния поллютантов на активность ЦО в печени является её уменьшение у особей осетра, выловленных в районах прямого действия волжского стока, более чем вдвое (р<0,05), в сравнении с рыбами, из других участков моря. Кроме того, изменяется также соотношение активностей ЦО в печени и мышцах (рис. 3). Если оно меньше единицы, то можно говорить о нарушении в распределении функциональных приоритетов ферментных систем, регулирующих аэробные и анаэробные процессы в энергетическом обмене печени и белых мышцах. Печени свойственна высокая активность ферментов аэробного обмена, а белым мышцам - анаэробного гликолиза (Щепкин, Эмеретли, 1985; Эмеретли, 1985; Иванов, 2003). При этом прослеживается видовая специфичность ответной реакции этого фермента в печени и мышцах на уровень загрязнений, вносимых паводковыми водами в Северный Каспий. У русского осетра она более замедлена, в сравнении с севрюгой и белугой.
Переходя к анализу динамик активности ЛДГ в печени и мышцах у осетровых рыб, необходимо отметить определённую их противофазность по отношению к динамике величины паводка (рис. 4) с проявлением видовой специфичности. У русского осетра такая закономерность проявлялась в большей степени в активности ЛДГ печени, но лишь до 2000 г., после которого характер динамики изменился. Однако, несмотря на видовые особенности, у
 
Рис. 4. Межгодовая динамика активности ЛДГ печени и мышц русского осетра
в летний период при различных объёмах паводка
всех исследованных видов осетровых выявляются общие закономерности. Успешное функционирование энергетической системы, зависит также и от работы дыхательной системы. Органом извлечения кислорода из водной среды у взрослых рыб являются жабры. Они чутко реагирует на присутствие в воде токсикантов. Гистологические исследования состояния жаберного эпителия у осетровых рыб, выловленных в море, выявили наличие различных форм нарушений, затрагивающих все отделы жаберного эпителия, независимо от пола, стадии зрелости и видовой принадлежности. При существенном увеличении как в 1996 г., содержания в морских водах меди, свинца и марганца, а также углеводородов, резко, до 51% выросла встречаемость рыб с тяжёлыми изменениями в жабрах при примерно 30% встречаемости в другие годы. Сильно повреждают жабры ионы цинка, который обладает синергическим действием в смеси с медью (Метелёв и др., 1971). Увеличение концентраций цинка и меди к 1999 г. также сказалось на состоянии жаберного эпителия - у 40% рыб изменения носили существенный характер. Кроме того, респираторный эпителий большинства рыб был разрыхлён, отмечалось его набухание и гиперплазия. В то время как до 1998 г., осетровым в море было характерно лишь разрастание эпителия филамента.
Таким образом, ведущим фактором в повреждении жабр выступает медь, токсичность которой может усиливаться цинком (синергический эффект), а так же совместным действием других металлов.
Другой компонент дыхательной системы рыб - гемоглобин, реагирует на загрязнение среды увеличением или снижением своего содержания в крови. У русского осетра оно синхронно следует за уровнем основных загрязнителей морских вод. У севрюги - в основном проявляется обратная зависимость. Такие различия связаны с разной стратегией адаптации организма осетра и севрюги и их этапностью к действию поллютантов. У осетра - повышением потребностей в окислительных процессах, у севрюги их торможением, наступающим в поздних фазах токсикоза. У белуги, картина реагирования гемоглобиновой системы схожа с таковой у севрюги, но с заметной инерционностью процессов.
Отклик регуляторно-гомеостатической функции на воздействие поллютантов рассматривался в свете изменений метаболизма, как регуляторно-компенсационных реакций. На воздействие чрезвычайных раздражителей, одним из первых реагирует углеводный обмен, который может быстро удовлетворить повышенные на этот момент потребности печени в энергии, что предусматривает расход гликогена. В иных случаях, когда гликоген не расходуется, как в 1991-1992 и 2000-2003 гг., организм рыб переходит на другую стратегию адаптации к действующим чрезвычайным факторам среды, используя в качестве энергетического субстрата другие вещества.
В качестве активного участника адаптационных процессов рассматривался также холестерин - основа стероидных гормонов, являющихся регуляторами обмена веществ в клетках. Содержание в крови холестерина реагирует на межгодовые изменения уровня поллютантов разнонаправленными по отношению к ним колебаниями, что наиболее выражено у русского осетра и севрюги. У белуги увеличение загрязнения каспийских вод не влекло за собой существенного снижения в крови холестерина, а сама динамика в гораздо большей степени, чем у осетра и севрюги, имела синхронность в отношении колебаний уровня загрязнения.
Бета-липопротеиды, представляющие собой транспортную форму липидов, переносят преимущественно холестерин и фосфолипиды. Севрюга, как наиболее реактивный вид, реагирует на повышенную загрязнённость вначале постепенным повышением содержания β-липопротеидов в крови, а затем резким снижением с поддержанием этого небольшого уровня в последующие годы. Те же процессы имеют место и у осетра, но без срывов на более низкий уровень. Белуга занимает промежуточное положение с чётко обозначенной реакцией изменения β-липопротеидов на динамику загрязнённости морских вод нефтеуглеводородами и фенолами.
Реакция белкового обмена осетровых на изменения уровня загрязнений в водной среде рассматривалась исходя из трёх показателей: содержания общего белка в крови, водорастворимого белка мышц и коэффициента, характеризующего уровень повреждения мышечных волокон, рассчитываемого как соотношение активностей ЛДГ в сыворотке крови и мышцах. Она представляет собой достаточно сложные взаимоотношения между деградацией мышечных волокон, белками мышц и крови и метаболической активностью печени. Прямой связи между межгодовыми изменениями уровня загрязнённости морских вод и содержанием в крови белков у русского осетра не прослеживается (рис. 5). Однако существенное повышение суммарного НУ+фенолы загрязнения как 1992 и 1998 гг. (10-12 ПДК) влечёт за собой снижение содержания белков в крови, как и длительный по времени (1994-
Рис. 5. Межгодовая динамика содержания в крови русского осетра общего сывороточного белка (ОСБ), водорастворимого белка мышц и коэффициента лизиса мышечных волокон
1996 гг.) повышенный (6-8 ПДК) их уровень. При этом просматривается сопряжённость между уровнем водорастворимых белков мышц и содержанием в крови белков: увеличение первых сопровождается повышением вторых, при росте коэффициент лизиса, свидетельствующего об усилении разрушения мышечных волокон. По-другому реагирует белковая система рыб во второй половине периода исследований. У севрюги реакция на увеличение уровня загрязнённости морской воды нефтеуглеводородами и фенолами проявляется уменьшением содержания белка в крови, при не чётко выраженной реакции водорастворимых белков и коэффициента лизиса мышечных волокон. У белуги просматривается тенденция повышения содержания белков в крови при увеличении загрязнённости морских вод этими поллютантами и сопряжённости межгодовых изменений коэффициента лизиса мышечных волокон и водорастворимого белка в пределах всего исследованного периода. Такая неоднозначность отклика белкового обмена на изменения воздействий на организм основных загрязняющих веществ диктуется различиями стратегий адаптационных возможностей исследуемых видов рыб и связана с особенностями этих воздействий (длительность, интенсивность) как в предшествующие годы, так и в анализируемый период.
Из систем организма рыб, осуществляющих защитные функции, исследовались две: антиоксидантная и иммунная. У всех исследованных видов осетровых рыб АОА в общих чертах соответствовала межгодовым колебаниям интенсивности ПОЛ в мышцах и печени и динамике уровня загрязнения морских вод. Однако в ряде случаев имело место несовпадение подъёма АОА и увеличения ПОЛ в этих тканях. В целом отмечается некоторое угнетение АОА при интенсивном и длительном воздействии на организм рыб поллютантов.
Другая система, выполняющая защитные функции, представлена иммунитетом. Исследование ЕИФ, характеризующего состояние иммунного статуса выявило у осетровых рыб наличие вторичного иммунодефицита: наибольший - у севрюги, наименьший - у белуги. Русский осётр занимал в этом отношении промежуточное положение. Несмотря на некоторые различия, у всех видов он оценивался как умеренный.
Таким образом, функционирование рассмотренных физиологических систем трансформируется в зависимости от силы и длительности воздействия и участия их в адаптационно-компенсационных процессах.
|
