Прижизненные исследования механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна
Скачать 292.66 Kb.
|
На правах рукописи КОКУРИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ПРИЖИЗНЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МЕХАНИЗМОВ РЕАКТИВНОЙ ПЕРЕСТРОЙКИ МИЕЛИНОВОГО НЕРВНОГО ВОЛОКНА 03.03.01 физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в лаборатории функциональной морфологии и физиологии нейрона Института физиологии им. И.П. Павлова РАН
Защита диссертации состоится «30» сентября 2013 года в 11.00 часов на заседании Диссертационного Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, г. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН Автореферат разослан «___» __________ 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук Н.Э. Ордян ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Миелиновое нервное волокно - это уникальный симбиоз отростка нейрона и глиальной клетки, характеризующийся сложными структурными и функциональными взаимодействиями. Современная литература пополняется всё новыми фактами о видах нейроно-глиальных взаимоотношений в различных отделах нервной системы. Но до сих пор периферическое миелиновое волокно и присущие ему формы коммуникации остаются не до конца изученными. Одним из видов взаимодействия аксона и шванновской клетки является реактивная перестройка миелинового нервного волокна, которая представляет собой третью промежуточную форму состояния нервного волокна между его нормальным состоянием и дегенерацией. Реактивные изменения миелинового волокна однотипны при нарушении гомеостаза под действием факторов внешней среды и при различных заболеваниях периферической нервной системы (Hildebrand, Johansson, 1991; Doppler, Werner, Henneges et al., 2012). Следовательно, подробное изучение механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна является актуальной проблемой. Поскольку предыдущими исследователями (Robertson, 1958,б; Trapp, Kidd, 2004; Scherer, Arroyo, Peles, 2004) основное внимание уделялось строению миелинового волокна в статике, до сих пор остается под вопросом, каким образом в динамике при реактивной перестройке связаны между собой структурные изменения аксона и шванновской клетки, какую роль они играют в обеспечении неэлектрической функции проводника. Дополнительные исследования требуются для понимания, за счёт каких процессов происходят эти структурные изменения миелинового нервного волокна. Этим мало изученным проблемам посвящена данная диссертационная работа. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось функциональное исследование механизмов реактивной перестройки миелинового нервного волокна и выяснение взаимоотношения осевого цилиндра с миелиновыми структурами глиальной клетки при нарушении гомеостаза под действием факторов внешней среды. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить процесс реактивной структурной кинетики живого миелинового нервного волокна в растворе Рингера. 2. Исследовать взаимозависимость перестройки аксона и миелиновых структур шванновской клетки при изменении тоничности внешней среды. 3. Изучить нейроно-глиальные взаимоотношения структур волокна при его механическом повреждении. 4. Электронно-микроскопически определить плотность распределения цитоскелетных белковых структур реактивно изменённой аксоплазмы. 5. Исследовать процесс передачи жидкой фракции аксоплазмы между аксоном и глией при реактивной перестройке в водных и безводных средах. 6. Определить возможность регуляции интенсивности реактивной перестройки путём изменения осмотического давления аксоплазмы. Научная новизна исследования. Проведённые исследования впервые на живых миелиновых волокнах выявили комплекс ранних, обратимых, реактивных изменений структурных компонентов волокна и продемонстрировали их взаимозависимость. Впервые представлена полная кинетика функционального значимого процесса обратимых изменений волокна. В работе подробно изучены неизвестные ранее процессы, приводящие к изменению структуры миелиновых насечек, а также выявлены и подробно рассмотрены причины, так называемой, "ретракции миелина" в области перехвата Ранвье. Доказано, что функционально значимая варикозная деформация аксона зависит не от набухания, а от его множественного локального сужения при неизменности диаметра волокна. Путём морфометрических исследований впервые показано, что увеличение объёма насечек Шмидта-Лантермана, набухание перехватов Ранвье и перикарионов шванновской клетки связано с транслокацией водной фракции аксоплазмы в структуры миелиновой оболочки. Таким образом, продемонстрирован новый тип функциональных глио-нейрональных взаимоотношений. Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение диссертации состоит, прежде всего, в том, что в работе впервые на живых нервных волокнах рассматриваются новые функциональные механизмы нейроно-глиального взаимодействия. Продемонстрирован взаимосвязанный комплекс всех элементов миелинового волокна, зависимость структурной перестройки сателлитной шванновской клетки от геометрических, пространственных изменений аксона. Впервые выявлен механизм реактивной перестройки, который заключается в транслокации водной фракции аксоплазмы в глиоплазму шванновской клетки, причём показано, что этот процесс протекает и при полном отсутствии внешней воды, в безводных средах. Изменение геометрических параметров миелинового волокна при обратимой реактивной перестройке также имеет большое значение для понимания его электрофизиологических процессов (Bradley, Jaros, Jenkison, 1977; Shrager, Chiu, Ritchie et al., 1987). Работа имеет большое практическое значение поскольку, изучение выявленных новых механизмов глио-нейрональных взаимоотношений в нервной системе определяет направление фармакологического поиска средств терапевтического вмешательства. Практически важным представляются результаты опытов, которые демонстрируют, что развитие реактивных изменений миелиновых волокон, а, следовательно, начальный этап их патологии можно затормозить при увеличении осмотического давления коллоида аксоплазмы за счёт деполимеризации его цитоскелета. Структурная диагностика реактивных изменений биопсийного материала может помочь уточнить прогноз и диагноз ряда заболеваний. Положения, выносимые на защиту.
Апробация материалов диссертации. Результаты работы были представлены на: 1. Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию академика В.Н. Черниговского, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург – Колтуши, 2007); 2. VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008); 3. Научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2008); 4. Конференции молодых учёных, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН, «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (Санкт-Петербург – Колтуши, 2010); 5. II Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); 6. VIII Международном междисциплинарном конгрессе "Нейронаука для медицины и психологии" (Судак, 2012); 7. VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвящённой 220-летию со дня рождения академика К.М. Бэра, «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012). Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные статьи в журналах из списка ВАК, 1 статья в академическом сборнике и 7 тезисов. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав с изложением экспериментальных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 217 страниц. Из них– 82 рисунка, 8 схем и 2 таблицы. Список литературы включает 371 источник: 34 отечественных и 337 зарубежных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа проводилась на живых периферических нервных волокнах седалищного нерва лягушки Rana temporaria. Методика выделения интактных и механически повреждённых волокон. Выделяли седалищный нерв лягушки с фрагментом пояснично-крестцового отдела позвоночника. Для разрушения плотной эпиневральной соединительнотканной оболочки препарат переносили на 40 мин при температуре 21-23оС в 0,4 % раствор проназы (Serva), приготовленный на основе раствора Рингера для лягушек. Затем нерв с фрагментом позвоночника отмывали от протеолитического фермента в физиологическом растворе и помещали на тонкое предметное стекло в каплю раствора Рингера. Двумя острыми электролитически заточенными иглами надрывали эпиневральную оболочку нерва и постепенно снимали её с дистального конца. Далее расправляли полученный препарат, сверху накладывали одиночные волокна стекловаты для его фиксации и накрывали препарат покровным стеклом. Волокна исследовались в двух типах импровизированных микрокамер: проточной микрокамере, когда необходима была смена окружающей среды препарата, и запечатанной микрокамере, когда требовалось не допустить подсыхание препарата и исключить малейшие колебания волокна. Механически повреждённые нервные волокна получали при расщеплении нерва. Наблюдение за препаратом осуществлялось в течение 2-6 часов с помощью компьютерной автоматизированной микровидеоустановки, созданной на базе инвертированного фазовоконтрастного микроскопа БИОМЕД-3И ФК (Россия). Производилась цейтраферная видеосъемка – 1 кадр каждые 10 минут. Из полученных изображений с помощью программы Adobe After Affects 7.0 монтировались фильмы процесса возникновения и развития реактивной перестройки живого миелинового волокна. Методика исследования одиночных нервных волокон при воздействии растворов разной тоничности. Одиночные живые нервные волокна исследовались в проточной микрокамере. С одной стороны от камеры на отрезок фильтровальной бумаги наносили гипотонический раствор, с другой стороны − помещали новый отрезок фильтровальной бумаги. Процедуру периодически повторяли, чтобы не допустить подсыхание препарата. Гипотонические растворы готовились на основе раствора Рингера для лягушки, разбавленного в 2, 3, 4 раза (что соответствовало 50 %, 33 %, 25 % содержанию солей в растворе). Методика исследования нервных волокон в безводных средах. Расщеплённый нерв вначале осторожно обезвоживали на фильтровальной бумаге, затем его помещали на предметное стекло в безводную среду вазелинового масла или перфтордекалина. Затем с помощью двух препаровальных игл расправляли нервные волокна. Сверху помещали волокна стекловаты, медленно накрывали покровным стеклом, придерживая его иглой, и запаивали микрокамеру вазелином Перфтордекалин − жидкое химически инертное вещество, которое является одним из компонентов заменителя крови и обладает способностью к оксигенации тканей и противовоспалительными свойствами (Борисова, Штрыголь, 2004; Усенко, Панченко, Царев и др., 2004; Кузнецова, 2007). Методика электронно-микроскопических исследований. Расщеплённый нерв фиксировали в течение 1-го часа охлажденным 2,5 % раствором глютарового альдегида на основе 0,1 М какодилатного буфера с рН 7,2-7,4. В последующем проводили дофиксацию 1 % охлажденным раствором четырехокиси осмия (OsO4) в течение 1 часа. Далее осуществляли дегидратацию спиртами и заливку материала общепринятым методом для электронно-микроскопических исследований. Фиксированный материал резали на ультратоме LKB-5 (Швеция) и просматривали под фазовоконтрастным микроскопом. Ультратонкие срезы изучали под электронным микроскопом JEM100B (Япония). Негативы сканировали в просвечивающем режиме с помощью сканера HP SсanJet G4050 (Китай). Позитивные изображения подвергали морфологическому анализу. Количественный анализ материала. Прижизненный светооптический материал. У живых миелиновых волокон после механической травмы с помощью программы ImageJ измеряли диаметр волокна и осевого цилиндра вне зоны и в зоне набухших миелиновых насечек Шмидта-Лантермана. Также измеряли диаметр волокна и осевого цилиндра в области миелиновых насечек до и после воздействия гипотонического раствора. Электронно-микроскопический материал. Необходимые измерения параметров живого нервного волокна проводились с помощью программ Slice и ImageJ. Программа Slice, написанная для данных исследований, позволяет определить плотность распределения цитоскелетных структур в аксоне. Плотность расположения структур цитоскелета определялась в аксоне следующим образом: на изображение наносилась прямая линия, автоматически отображался график распределения оптической плотности вдоль этой линии, вычислялись и отображались на графиках локальные максимумы оптической плотности. Отображение локальных максимумов выполнялось с учетом задаваемых значений фонового порога оптической плотности и "ширины полосы", представляющей собой разность между соседними значениями локальных максимума и минимума. Плотность распределения локальных максимумов вычислялась как количество локальных максимумов на единицу длины линии, что соответствовало плотности распределения структур цитоскелета аксона вдоль наносимой линии. На электронно-микроскопических снимках с помощью программы ImageJ измеряли длину микротрубочек осевого цилиндра до и после воздействия колхицина. Полученные данные статистически обрабатывались. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | «419 авиационный ремонтный завод» (оао «419 арз») После войны 139 сам перебазируется и развёртывается на месте своего постоянного базирования в поселке Горелово под Ленинградом и... | | Методическая разработка урока. Тема: Внешняя политика СССР в период перестройки Общие цели: охарактеризовать направления внешнеполити ческого курса СССР в период перестройки |
 | «как ткани ткут и нити прядут» цели урока Обучающие : Научить классифицировать волокна растительного и животного происхождения. Дать понятия определениям ткань, нити, волокна.... | | Введение 3 Историко-теоретические аспекты исследования механизмов реализации (действия) права 7 |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Тмм научная основа новых машин и механизмов. Исторический очерк развития тмм. Цели и задачи курса. Разделы тмм. Основные виды звеньев.... | | Докладе описаны ключевые моменты математического моделирования устройств... В докладе описаны ключевые моменты математического моделирования устройств компенсации реактивной мощности на базе igbt-ключей с... |
| Задачами дисциплины являются Научные и практические исследования. Коллективные и индивидуальные исследования. Роль исследований в различных сферах развития производства.... | | Урок проводится в компьютерном классе. Цор «Открытая физика 5» Сформировать понятия: кпд механизмов, золотое правило механики. Показать проявление золотого правила механики при применении простых... |
| «Социокультурные проблемы современного образования» за 2010 год Осуществелена разработка инструментария и программы исследования влияния различных социально-стратификационных факторов на удовлетворенность... | | Имущества Объектом исследования является: система учета федерального имущества и анализ существующих механизмов организации учета и создания... |
| Отчет о научно-исследовательской работе по проекту: Исследование... «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники», подпрограмма «Топливо и энергетика», раздел «Поиск,... | | Тема: «Совершенствование механизмов привлечения и использования иностранных... Цель исследования: разработка рекомендаций по реализации дифференцированного подхода к привлечению и использованию иностранных работников... |
| Радикальное энергетическое совершенствование трансформаторов и электрических... Аэм. Рассматриваются методы и устройства их энергетического совершенствования на основе принципа циркуляции реактивной мощности и... | | Тема: «Кризис системы и попытки перестройки». 1964-1991 гг.» §§ 34 42 |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Снятие зрительного напряжения (проводится гимнастика для глаз), и для снятия мышечного и нервного напряжений (физ минутки) | | Конструкция отдельно взятого оптического волокна достаточно проста.... Конструкция отдельно взятого оптического волокна достаточно проста. Сердечник из оптически более плотного материала окружен оболочкой... |
