Диагностика y -вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье
Скачать 469.64 Kb.
|
На правах рукописи Вологин Семен Германович диагностика Y-вируса картофеля и штаммовый состав патогена в Среднем Поволжье Специальность 06.01.07 – защита растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в отделе сельскохозяйственной биотехнологии Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства Россельхозакадемии Научный руководитель: Замалиева Фания Файзрахмановна доктор сельскохозяйственных наук Официальные оппоненты: Упадышев Михаил Тарьевич доктор сельскохозяйственных наук, заведующий центром защиты и биотехнологии растений ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии Усков Александр Иринархович кандидат биологических наук, заведующий отделом биотехнологии и иммунодиагностики ГНУ ВНИИКХ им. А.Г. Лорха Россельхозакадемии Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Казанский государственный аграрный университет Защита состоится «17» декабря 2013 г. в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д220.043.04 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова, д. 15, тел./факс: (499) 976-24-92, e-mail: dissovet@timacad.ru. С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И. Железнова РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева. Автореферат разослан «13» ноября 2013 г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований. Y-вирус картофеля (YВК) широко распространен во всем мире и относится к числу наиболее вредоносных агентов поражающих культуру картофеля. Инфицирование YВК приводит к снижению урожайности на 30-90% [Struik, Wiersema, 1999]. К причинам широкого распространения патогена относят нарушение агротехнических приемов возделывания, использование зараженного семенного материала, а также несовершенство методов обнаружения вируса [Иванюк и др., 2005]. Область диагностики и идентификации вирусов является важным элементом в сфере защиты растений от болезней. Современные системы ведения семеноводства картофеля на оздоровленной безвирусной основе предусматривают применение диагностического контроля вирусного поражения на различных этапах семеноводческого процесса с целью своевременного удаления инфицированных партий посадочного материала из агропромышленного производства [Замалиева, 2009]. Также методы лабораторной диагностики применяются в ходе селекционного процесса при создании сортов картофеля устойчивых к YВК [Салихова и др., 2012]. В последние годы в России разработаны тест-системы для обнаружения вирусов картофеля, основанные на иммунобиологических и молекулярно-генетических методах исследования [Бобкова и др., 2003; Drygin et al., 2007; Бызова и др., 2009; Рязанцев, Завриев, 2009; Комаров и др., 2013]. При этом остаются не достаточно изученными аспекты, связанные преаналитической подготовкой биоматериала, условиями его обработки и хранения. Также, практически не уделяется внимание вопросам, связанным с биометрической интерпретацией данных. Эти аспекты могут оказывать влияние на достоверность результатов фитосанитарного мониторинга. В настоящее время большую значимость приобретает фитосанитарный мониторинг, предусматривающий оценку видового и штаммового состава вирусов растений. Известно, что YВК обладает сложной популяционной структурой, включающей несколько штаммов, приводящих к образованию различных симптомов на растениях картофеля [Smith, Dennis, 1940; De Bokx, Huttinga, 1981; Beczner et al., 1984; Chrzanowska, 1987; Le Romancer et al., 1994; Blanco-Urgoiti et al., 1998; Chikh Ali et al., 2008; Chikh Ali et al., 2010]. Наибольшую угрозу для агропромышленного производства представляют штаммы, индуцирующие некротическое поражение клубней картофеля, приводящие к значительному снижению их товарного вида и пищевой ценности [Вайдеманн и др., 1999; Иванюк и др., 2005]. Также серьезную опасность несут рекомбинантные формы YВК, характеризующиеся высокой эффективностью переноса с помощью насекомых [Verbeek et al., 2010]. В результате быстрого распространения рекомбинантных штаммов YВК, способных к индукции некрозообразования, многие сорта картофеля потеряли свою привлекательность для сельскохозяйственного производства [Basky, 2002]. В Средневолжском регионе России сосредоточены значительные площади посадок семенного и товарного картофеля. Кроме того, здесь функционирует ряд крупных селекционных и семеноводческих учреждений. В связи с этим, исследование аспектов связанных с лабораторной диагностикой и фитосанитарным мониторингом популяционного состава YВК на территории данного региона является актуальным. Цель и задачи исследования. Целью работы явилось установление особенностей диагностического выявления YВК и штаммового состава патогена в Среднем Поволжье. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Научная новизна. Впервые установлен эффект повышения достоверности результатов лабораторной диагностики при использовании комплекса преаналитических факторов: однократного цикла замораживания-оттаивания разрушенной листовой ткани растений, а также внесения в состав листовых и клубневых проб картофеля мертиолята натрия и тиосалициловой кислоты. С помощью биометрического анализа выявлено существование взаимосвязи между результатами ИФА и процессом распространения патогена в вегетативных поколениях картофеля. Впервые на территории Среднего Поволжья обнаружена циркуляция штаммов YВКNTN и YВКN-Wi, индуцирующих развитие симптомов кольцевого некроза клубней картофеля. На территории европейской части России показано распространение изолятов YВК, обладающих рекомбинантной формой генома. Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть применены в испытательных лабораториях системы Россельхознадзора и Россельхозцентра, а также в учреждениях, связанных с семеноводством и селекцией картофеля. Разработанный алгоритм преаналитической подготовки исследуемого материала используется в ГНУ ТатНИИСХ при диагностическом выявлении вирусов в системе семеноводства картофеля на оздоровленной основе. Охарактеризованные изоляты YВК могут быть использованы в селекционных исследованиях при создании форм растений устойчивых к патогену, а также могут быть применены при создании диагностикумов и контрольной панели образцов, предназначенной для оценки качества работы диагностических тест-систем. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа проводилась в соответствие с темами 04.15.01 и 04.15.02 Программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению агропромышленного комплекса Российской Федерации на период 2006-2010 и 2011-2015 гг. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора (2005-2013 гг). Положения выносимые на защиту.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XI Международной школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2007), IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro» (Зеленоград, 2008), научно-практической конференции «Картофелеводство: результаты, инновации, практический опыт» (Москва, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения» (Казань, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные разработки молодых ученых – АПК России» (Казань, 2010), Международной научно-практической конференции «Состояние и перспективы научных исследований по картофелеводству, овощеводству и бахчеводству» (Алматы, 2011), III международного симпозиума «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России» (Екатеринбург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение агропромышленного комплекса России» (Казань, 2012), VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012), I международного симпозиума «Молекулярные аспекты редокс-метаболизма растений» (Казань, 2013), научной конференции «Молекулярно-генетические подходы в таксономии и экологии» (Ростов-на-Дону, 2013), Всероссийской научной конференции с международным участием «Биотехнологии: наука и практика, инновации и бизнес» (Астрахань, 2013) Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 20 научных работ, из них 2 статьи в ведущих рецензируемых изданиях, 9 – в материалах всероссийских и международных конференций. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Диссертация содержит 21 таблицу, 23 рисунка и 1 приложение. Список литературы включает 189 литературных источников, в том числе 122 на иностранном языке. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования служил биоматериал различных сортов и гибридов картофеля (Solanum tuberosum L.). Листовые образцы отбирали со среднего яруса растений, находившихся в фазе цветения. Образцы клубней выдерживали при комнатной температуре в защищенном от света месте до выхода этиолированных ростков. Культивирование растений в асептической культуре in vitro осуществляли в стеклянных пробирках на среде Мурасига-Скуга при комнатной температуре и 16 часовом световом периоде. Для диагностических исследований использовали побеги растений достигших размера 10-15 см. Инфицирование растений картофеля вирусом проводили в марлевом изоляторе, расположенном на территории ГНУ ТатНИИСХ (г. Казань). Для этого нарушали пространственную изоляцию и в течении 14 суток с помощью естественного лёта насекомых, происходил перенос YВК с инфицированных растений обсадки на здоровые экспериментальные растения. В дальнейшем пространственную изоляцию восстанавливали, жизнедеятельность насекомых-переносчиков прерывалась применением инсектицидного препарата. Идентификация штаммовой принадлежности YВК проводилась согласно алгоритму, описанному в работе [Шуберт и др., 2004]. Искусственное заражение растений табака (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) проводили в марлевом изоляторе с помощью механической инокуляции инфицированным биоматериалом картофеля. Иммуноферментный анализ проводили на полистироловых планшетах ОАО «Медполимер» (Россия) с использованием наборов поликлональных (Bioreba, Швейцария) и моноклональных (Neogen Europe, Великобритания) антител к вирусам картофеля. Детекцию осуществляли на многоканальном фотометре «Opsys MR» (Dinex Tech., США) при длине волны 405 нм против референсного светофильтра (620 нм). Рассчитывался коэффициент позитивности – отношение величины оптической плотности исследуемого образца (ОП405) к значению критического порога (Р). Реакцию ОТ-ПЦР проводили с использованием реактивов НПФ «СибЭнзим» (Россия) на приборах «Терцик МС-2» (ДНК-технология, Россия) и «Mastercycler Gradient» (Eppendorf, Германия). Для ПЦР-диагностики вирусов картофеля, идентификации штаммового состава и секвенирования P1-гена YВК применяли олигонуклеотиды описанные в работах [Фолимонова и др., 1998; Nie, Singh, 2001; Зайнуллин, Зайнуллина, 2003; Volkov et al., 2009]. Определение сайтов рекомбинации в генах HC-Pro и VPg осуществляли в системе мультиплексной ОТ-ПЦР согласно работе [Lorenzen et al., 2006]. Для конструирования оригинальных праймеров использовали программу Oligo 6.0. Очистка ПЦР-продуктов и процедура секвенирования проводилась в лаборатории ЗАО «Синтол» (Россия) на приборе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программ BioEdit 7.1.3.0, BLAST, Mega 5.1 и SimPlot. Математическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Excel 2003 и Statistica 6.0. Построение вариационных рядов выполняли согласно [Лакин, 1990]. Расчет достоверности различий при нормальном распределении признака осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента, в случае не соответствия признака нормальному распределению – непараметрического T-критерия Уилкоксона [Реброва, 2002]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Преаналитическая подготовка растительного материала Первым элементом преаналитической подготовки служит стадия разрушения растительного материала, способствующая переходу фитопатогенов из биологических тканей в диагностически-доступную водосодержащую фракцию пробы. Исследование трех способов разрушения листовых и клубневых образцов показало, что во всех случаях разрушенный биоматериал оказался неоднородным и содержал в своем составе включения разрушенных растительных компонентов (РРК). Было исследовано влияние на результаты ИФА состава биопроб и условий их температурного хранения. При исследовании листовых проб, содержащих включения РРК и хранившихся в условиях холодильной камеры (температура +2…+8 ○С) на протяжении 16 часов, был выявлен более низкий уровень детектируемого сигнала (рис. 1а), по сравнению с пробами не содержащих этих включений (p<0,01). В тоже время, в пробах, хранившихся в условиях морозильной камеры (температура -18…-25 ○С) и, таким образом, подвергнутых однократному циклу замораживания-оттаивания, обнаружено достоверное возрастание величины коэффициента позитивности (p<0,01). Анализ листовых проб, подвергнутых центрифугированию и, таким образом, не содержавших в своем составе РРК, не выявил значимого влияния процедуры замораживания-оттаивания на результаты диагностики (p>0,05).
|
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Приложение меры борьбы с неблагоприятными климатическими условиями России, приводит к неурожаю и голоду. Так, в 1920-1921 гг в Поволжье была страшная засуха, которая загубила урожай зерновых. Это... | | Беседничество и старчество в Среднем Поволжье Список лиц, имеющих право на участие в годовом общем собрании акционеров составлен по данным реестра владельцев именных ценных бумаг... |
 | Применение физического метода в защите яровой пшеницы от болезней... Утверждение тем рефератов по истории отрасли науки для сдачи кандидатского экзамена по дисциплине «История и философия науки» | | Культура здоровья народов среднего поволжья в XIX столетии Охватывают XIX столетие. Оно выбрано потому, что в это время в Среднем Поволжье наиболее отчетливо проявились ценности традиционной... |
| Продуктивность яровой пшеницы и плодородие чернозема южного при длительном... Конкурсная документация на проведение открытого публичного конкурса на получение грантов Правительства Российской Федерации для государственной... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Известно, что на каждый гектар возделывания зерновых приходится в среднем перевозить около 25 т грузов. А при возделывании картофеля,... |
| Реферат Вирусы и вирусные вакцины «вирусы и вирусные вакцины», я ориентировалась на проблемы лечения вирусных заболеваний в современной медицине. При стремительном... | | Императорское Русское Географическое Общество (ирго) – рго ан СССР... Волжское понизовье (воложеская русь) – поволжье (по «Водному кодексу рф») территория вокруг акваторий куйбышевского, саратовского... |
| Психолого педагогическая диагностика психолого-педагогическая диагностика Пособие содержит формализованные схемы содержания первого раздела курса «Психолого-педагогическая диагностика» («Основы»), тематический... | | Рабочая программа учебной дисциплины техническая диагностика локомотивов... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Программа вступительных испытаний творческой направленности по специальности... Ровня (среднем (полном) общем образовании, среднем профессиональном образовании или высшем профессиональном образовании). При приеме... | | Влияние азотных удобрений, регуляторов роста и приемов обработки... |
| Учебный план календарный учебный график Практика «Функциональная диагностика и ультразвуковая диагностика» | | Контрольное управление информационный обзор материалов интернета Россельхознадзор запретил вывоз картофеля из зоны карантина в Костромской области 2 |
| Картофель важнейшая продовольственная, техническая и кормовая культура Цель: углубить и расширить знания учащихся по систематике, биологии, агротехнике картофеля | | Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птиц |
