Спектральные методы исследования в биохимии
Скачать 0.56 Mb.
|
| ТЕМА 5. Особенности проведения точной колориметрии. Указания к изучению темы. Точной колориметрией называется измерение количества хромофора, образующегося в ходе реакции. Многие вещества, слабо поглощающие в видимой области, после реакции с другими соединениями дают поглощающие продукты, количество которых однозначно связано с концентрацией исходного вещества. Такие реакции используют для обнаружения и определения концентрации исходных веществ. При определенных стандартных условиях и концентрациях проводят реакцию, а затем измеряют поглощение смеси. В качестве образца сравнения используют ту же смесь, но без исследуемого вещества. При помощи этого контрольного образца устанавливают нулевое значение поглощения. После ряда измерений строят график зависимости поглощения образца от концентрации исследуемого вещества. Теперь, когда нужно определить количество вещества, в стандартных условиях проводят реакцию, измеряют поглощение образца и по градуировочной кривой определяют концентрацию исходного вещества. В биохимии этот способ применяется довольно часто, поскольку во многих случаях удается подобрать такие реакции, когда незначительные количества вещества дают сильное поглощение. В частности, общие колориметрические количественные определения проводятся для определения количества фосфатов (с использованием молибдата аммония), аминокислот (с использованием нингидгина или солей меди), белков, нуклеиновых кислот и сахаров. Калориметрия в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, то есть ее оптической плотности). Как правило, фотоколориметрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным. При проведении колориметрических количественных определений следует помнить следующее:
По принципу работы колориметры делятся на трехлучевые и спектральные. Первые основаны на разложении луча света светофильтрами на три луча, по длине волны близким к цветам триады (красный, зеленый, синий) и сравнении интенсивности прошедших лучей с эталоном. Колориметры этого типа имеют меньшую точность, но позволяют быстрее получать результаты Cпектральные колориметры основаны на получении спектра изучаемого луча и его математической обработке. Они имеют высокую точность и надежность. Исследуемый луч света в них монохроматизируется и направляется в фотоприемник, который последовательно снимает весь спектр. Литература к теме 5:
Вопросы для самоконтроля.
ТЕМА 6. Количественное определение ферментов, кинетический анализ и разностная (дифференциальная) спектрофотометрия. Указания к изучению темы. В том случае, когда продукт или субстрат ферментативной реакции имеет характерный спектр поглощения, можно определить количество присутствующего в смеси фермента, а по изменениям спектров хромофора в ходе реакции – исследовать и кинетику этой реакции. Количественное определение гидролитических ферментов проводят при помощи расщепления ими стандартных субстратов, в результате которых высвобождается окрашенный продукт (например, α-глюкозидаза отщепляет p-нитрофенол от p-нитрофенил-α-D-глюкопиранозида). Количественное определение деполимераз, (например, эластазы) проводят по измерению ферментативного высвобождения красителя (конго красного в случае эластазы) из комплекса полимера с красителем (эластин – конго красный). Эти методы используются и в тех случаях, когда непосредственных спектральных изменений в смеси не происходит, однако продукт ферментативной реакции участвует в другой реакции, которая уже идет с изменением поглощения. Например, альдолаза катализирует превращение фруктозо-1,6-дифосфата в глицеральдегид-3-фосфат и дигидроацетон-фосфат. Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа восстанавливает НАД+, а появление НАД Н сопровождается изменением поглощения при 340 нм. Таким образом, ферментативную активность альдолазы можно определить по кинетике появления НАД Н в присутствии избытка фруктозо-1,6-дифосфата, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и НАД+. Восстановление НАД+ или окисление НАД Н происходит в ходе очень большого числа метаболических реакций. Все вышеописанные определения можно проводить в спектральном диапазоне 330 – 700 нм, с использованием стеклянных кювет. Лучше использовать кюветы тоньше 1 см. В случаях, когда необходимо изучить небольшие изменения поглощения системы с большим значением поглощения, используют методы разностной (дифференциальной) спектрофотометрии. Эти методы используются, например, при определении изменений окислительного состояния компонентов дыхательной цепи в целых фосфорилирующих митохондриях и хлоропластах. Методы дифференциальной спектрофотометрии используют также при определении концентраций компонентов цепи переноса электронов. В отличие от прямого спектрофотометрического метода, по которому оптическую плотность исследуемого раствора измеряют относительно чистого растворителя или так называемого холостого раствора, в котором содержатся все компоненты, кроме определяемого вещества, при использовании разностной спектроскопии исследуемый раствор подвергают определенной обработке и оптическую плотность обработанного раствора определяют относительно исходного, обработанного другим методом. Способов разностной спектроскопии чрезвычайно много. В качестве обработок, воздействующих на вещество и его спектр поглощения, используют: изменения рН раствора; восстановление или окисление и другие реакции; замену растворителя; изменение температуры. Разностный спектр получается вычитанием одного абсолютного спектра поглощения из другого, например вычитанием абсолютного спектра поглощения убихинола из абсолютного спектра поглощения убихинона. Разностные спектры биологических образцов имеют специфические свойства: 1.Значения экстинкции могут быть отрицательными. 2.Максимумы и минимумы поглощений смещены, а значения экстинкций отличаются от их значений на абсолютных спектрах. 3.Точки нулевого поглощения – изобестические точки – соответствуют (в случае определения концентраций компонентов цепи переноса электронов) длинам волн, где восстановленные и окисленные формы вещества поглощают одинаково; изобестические точки используются для обнаружения посторонних веществ. Поместив в кювету сравнения образец с анаэробными митохондриями, а в кювету для образца – тот же самый митохондриальный образец в присутствии окиси углерода, мы промеряем разностный спектр цитохрома a3CO и цитохрома a3, потому что цитохром a3 – последний переносчик электронов в цепи и единственный компонент цепи, взаимодействующий с окисью углерода. Разностный спектр цитохрома с – это спектр разности в поглощении цитохрома свосст. и цитохрома сокисл.. Для суспензии митохондрий разност-ный спектр получается измерением при определенных длинах волн изменения поглощения, когда исследуемый объект переходит,наоборот, из аэробного состояния в анаэробное; при этом получается суммарный разностный спектр для цитохромов a, a3, b, c, c1, НАД+ и флавопротеидов. Литература к теме 6:
Вопросы для самоконтроля.
ТЕМА 7. Исследование флуоресценции биологических объектов. Указания к изучению темы. Флуоресценция – это испускание молекулой света. Спектр флуоресценции сдвинут в длинноволновую область по сравнению со спектром его поглощения; этот сдвиг называется стоксовым. Иногда вещество поглощает в видимой области спектра, а испускает инфракрасное излучение. При комнатной температуре большинство органических молекул находится в основном энергетическом состоянии S. Поглощение фотона сопровождается переходом электрона на более высокий энергетический уровень (S1, S2 и т.д.). Это происходит за 10-15 секунд. После поглощения кванта молекула из-за теплового движения и столкновения с другими молекулами растрачивает часть энергии и переходит на самый нижний колебательный подуровень первого электронного возбужденного состояния. Испустив квант за 10-8 секунд, молекула переходит в основное состояние; такое испускание света называется флуоресценцией. Уменьшение энергии кванта, испущенного молекулой, по сравнению с энергией поглощенного кванта и есть стоксовый сдвиг. Флуоресцируют, однако, не все органические молекулы, хотя большая часть из них поглощает в ультрафиолетовой и (или) видимой области. Поскольку переход с первого возбужденного состояния в основное может происходить на различные колебательные и вращательные подуровни, спектры флуоресценции имеют вид полос. Обычно они не зависят от длины волны возбуждающего света и зеркально симметричны спектрам поглощения. Спектры флуоресценции несут информацию о процессах протекающих быстрее, чем за 10-8 секунд. Квантовый выход Q – отношение числа испущенных квантов света к числу поглощенных – обычно не зависит от длины волны λ поглощенного света. При малых концентрациях молекул интенсивность флуоресценции If cвязана с интенсивностью падающего света Iо соотношением If = Iо2,3εсd Q. If от экстинкции зависит линейно и составляет примерно 1/100хЕ, если экстинкция не превышает 0,2. Обычно значение Е = 0,1 указывается с точностью до 1%, т.е. значение экстинкции 0,101 принимается равным просто 0,1. Интенсивность флуоресценции сильно зависит от температуры, при уменьшении ее от 30 до 200 она падает на 10-50%, поэтому при измерениях необходимо тщательно контролировать температуру. По сравнению со спектрофотометрией в видимой и ультрафиолетовой области флуориметрия имеет ряд преимуществ и недостатков. Благодаря тому, что интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации вещества,во флуориметрах можно использовать сравнительно несложную технику. Спектрофлуориметрические методы обладают высокой чувствительностью и позволяют работать с крайне малыми концентрациями вещества, когда спектры поглощения регистрировать очень трудно; по флуоресценции можно обнаружить, например, 0,01 мкг катехоламинов или НАД Н. Чувствительность флуориметров легко менять в широком диапазоне, усиливая ток фотоумножителя. Спектрофлуориметры обладают хорошей спектральной селективностью, так как, благодаря стоксовому сдвигу, можно использовать два монохроматора – один настроенный на длину волны возбуждающего света, а другой – на длину волны флуоресценции. Во флуориметре не требуется кюветы сравнения, зато надо иметь калибровочную кривую. Основная трудность, возникающая при флуориметрических измерениях, – это тушение флуоресценции, когда энергия возбуждения молекул переходит не в световую, а в тепловую энергию их движения. Получение и сравнение спектров флуоресценции и возбуждения соединений позволяет идентифицировать и изучать эти соединения. Благодаря своей высокой точности, чувствительности и воспроизводимости получаемых результатов, флуориметрия широко применяется в биохимических исследованиях. Особенно важно ее применение при работе с малыми количествами вещества, когда спектрофотометрия не дает надежных результатов. В качестве примеров можно привести количественное определение витамина В1 в пищевых продуктах, НАД Н в митохондриях и микроорганизмах при различных метаболических условиях, АТФ, хлорофилла и кортикостероидов. Использование внутренних стандартов, то есть измерение флуоресценции неизвестных количеств чистого вещества до и после добавления определенного количества стандартного образца, позволяет исследовать как самотушение, так и тушение флуоресценции примесями. Поскольку НАД Н и НАДФ Н флуоресцируют, флуориметрию можно применять для изучения различных метаболических реакций, которые так или иначе связаны с окислением НАД Н или НАДФ Н или восстановле-нием их окисленных форм. Благодаря высокой чувствительности метода ферментативные реакции изучают при низких концентрациях субстрата фермента или кофакторов, то есть в условиях близких к протеканию реакций in vivo; при этом иногда даже не приходится добавлять экзогенные кофакторы. Метод позволяет изучать кинетику окисления и восстановления эндогенного соединения в интактных органеллах или клетках, например НАД+ митохондрий. Поскольку некоторые белки содержат флуоресцирующие хромофоры, например тирозин и ФАД, по изменению их флуоресценции можно исследовать связывание белков с такими соединениями, как ингибиторы, коферменты и аллостерические факторы. С помощью флуоресценции исследуют также конформацию и полимеризацию белков. Литература к теме 7:
Вопросы для самоконтроля.
|
Похожие:
 | Гинекологии для студентов 5 курса Исследование функции яичников. Дополнительные методы исследования: биопсия, диагностическое выскабливание, аспирационная биопсия,... | | Методические рекомендации по изучению дисциплины «Методы исследований... Целью освоения дисциплины «Методы исследования в социальной работе» является формирование целостной системы знаний об основных общенаучных... |
| Программа вступительных экзаменационных испытаний в ординатуру по... Методы исследования пищевода. Рентгенологические методы. Эзофагоманометрия. Фармакодиагностика. Методы выявления гастроэзофагеального... |  | Пояснительная записка Курс «Физико-химические методы исследования» Курс «Физико-химические методы исследования» преподается в течение 6 семестра (одо), предназначен для магистрантов, обучающихся по... |
| Памятка по подготовке к лабораторным методам исследованиям лабораторные методы исследования Лабораторные методы исследования служат важным этапом обследования больного. Полученные данные помогают оценке состояния больного,... | | Учебно-методический комплекс. Рабочая учебная программа для студентов... А. А. Кудрявцев., С. С. Волкова. Спектральные методы исследования в нефтехимии: Учебно-методический комплекс рабочая учебная программа... |
| Примерная программа наименование дисциплины инструментальные методы исследования почв и растений Инструментальные методы исследования почв и растений является предшествующей дисциплиной для следующих дисциплин: история и методология... | | Программа для подготовки аспирантов специальности 07. 00. 09 «Историография,... «Историография, источниковедение и методы исторического исследования» (07. 00. 00 Исторические науки и археология) [Электронный ресурс]... |
| Программа вступительных испытаний по направлению подготовки научно-педагогических... Введение. Биохимия как наука о веществах, входящих в состав живой природы, и их превращениях, лежащих в основе жизненных явлений.... | | «Роль женщины в современном мире» Введение (аннотация, актуальность, проблема, цель и задачи, предмет и объект исследования, гипотеза и методы исследования) |
| Исследования Гипотеза: в результате проведённого исследования будут определены последствия воздействия пк на организм человека, указаны методы... | | Теория, методология и методы психологического исследования Целью курса является формирование у студентов профессиональной компетентности в области планирования и проведения теоретического... |
| Рекомендации по оформлению реферата практикума по курсу Реферат включает в себя следующие блоки: «введение», «глава I. Обзор литературных источников», «глава II. Цель, задачи, методы, организация... | | Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов... Работа выполнена в нил биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии фгаоувпо «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.... |
| Рич Р. К. Политология. Методы исследования: Пер с англ. / Предисл. А. К. Соколова Мангейм Дж. Б., Рич Р. К. Политология. Методы исследования: Пер с англ. / Предисл. А. К. Соколова. – М.: Издательство “Весь Мир”,... | | Аналитический обзор по тематике Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем», проведенной в Саратове 25-27 сентября 2007 г в Институте... |
