ВЛИЯНИЕ ДИСУЛЬФИДСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА
МОЛИКСАН НА ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+ В МАКРОФАГАХ
Крутецкая З.И., Курилова Л.С., Лебедев О.Е., Крутецкая Н.И.,
Войцехович К.О., Наумова А.А., Шамшев А.В.
Санкт-Петербурский государственный университет, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, (812) 328-94-65, zk@bio.pu.ru
Одним из фундаментальных регуляторных механизмов в биологии и биофизике клетки является редокс-регуляция передачи сигналов и экспрессии генов. Число известных редокс-чувствительных путей передачи сигнала постоянно возрастает, и имеющиеся данные свидетельствуют о том, что регуляция редокс-состояния клетки может быть полезной для лечения СПИДа и некоторых форм рака. Так, синтетический аналог окисленного глутатиона (GSSG) - фармакологический препарат глутоксим (динатриевая соль GSSG с нанодобавкой платины, ФАРМА-ВАМ, Москва) – нашел клиническое применение как иммуномодулятор и гемостимулятор в комплексной терапии бактериальных и вирусных заболеваний, псориаза, лучевой и химиотерапии в онкологии.
Другой новый препарат моликсан представляет собой комплекс глутоксима с нуклеозидом инозином. Препараты глутоксим и моликсан являются представителями нового класса лекарственных веществ тиопоэтиков, обладающих иммуномодулирующим, гепатопротективным и гемопоэтическим действием на клетки.
Ранее нами показано, что глутоксим, а также нуклеозиды инозин и гуанозин вызывают двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, [Ca2+]i, связанное с мобилизацией Са2+ из тапсигаргин-чувствительных Са2+-депо и последующим депо-зависимым входом Са2+ из наружной среды в макрофагах крысы. Однако, аддитивности в действии агентов при совместном введении глутоксима с инозином или гуанозином выявлено не было. В связи с этим, представлялось целесообразным исследовать влияние препарата моликсан, на [Ca2+]i в перитонеальных макрофагах крысы.
С использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM показано, что инкубация макрофагов (25-30 мин) с 100 мкг/мл моликсана в бескальциевой среде вызывает увеличение [Ca2+]i, связанное с мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо. Последующее введение в наружную среду 2 мМ Са2+ индуцирует вход Са2+, обусловленный, по-видимому, опустошением Са2+-депо. Эффект моликсана на [Ca2+]i на 10-20 % превосходит таковой для глутоксима или инозина, что свидетельствует о том, что при использовании этих веществ в составе одного препарата наблюдается аддитивность их действия на [Ca2+]i.
МЕЛАНОИДИНОВАЯ РЕАКЦИЯ В СИСТЕМЕ D-ГЛЮКОЗА/ГЛИЦИН И АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОДУКТОВ РЕАКЦИИ
Кублашвили Р.И., Угрехелидзе Д.Ш.
Тбилисский государственный университет им. И Джавахишвили,
Тбилиси, Багеби, корп. 3, кв. 36, тел. 235492, devi_ugrekhelidze@hotmail.com
Реакция меланоидинообразования играет исключительно важную роль в процессе термообработки пищевых продуктов, фактически определяя их аромат, вкус и биологическую ценность, в том числе и антиоксидантную активность. Мы исследовали меланоидиновую реакцию между D-глюкозой и глицином, и динамику антиоксидантной активности реакционной смеси в процессе реакции.
Смесь D-глюкозы и глицина, глицина-114С или глицина-214С (по 0.001 М каждый) в 0.005 М фосфатном буфере рН=8, нагревали при 100оС в течение 120 мин. Ход реакции контролировали на жидкостном хроматографе высокого давления (Gilson, детектор116 UV, колонка Zorbax ODC), меланоидиновые продукты выделяли путем диализа через мембрану из регенерированной целлюлозы (SPECTRA/POR), которая удерживает соединения с молекулярной массой >3500 дальтон, радиоактивность измеряли на жидкостном сцинтилляционном счетчике LKB 1215 RackBeta II, в гидрофильной системе Брея. Способность реакционной смеси и меланоидиновой фракции, замедлять перекисное окисление липидов определяли в модельной системе, содержащей эмульсию линолевой кислоты, а способность захватывать свободные радикалы - с помощью 1,1-дифенил-2-пикрил-гидразила (ДПГ*).
При взаимодействии D-глюкозы и глицина образуется сперва N-замещенный глюкозиламин, а далее ряд продуктов, в том числе -дикетон, который катализирует распад глицина по схеме Штрекера; в результате такого распада, из 114С-глицина образуется Н-СНО и 14СО2, а из 214С-глицина Н-14СНО и СО2. Количество 14С, включенного в состав меланоидинового пигмента, увеличивается по мере увеличения продолжительности реакции; при этом, за первые 60 минут образование меланоидина происходит более интенсивно, а далее интенсивность процесса снижается. Количество включенного 14С намного больше в случае 214С-глицина, чем в случае 114С-глицина; следовательно, в состав меланоидинового пигмента включается в основном углерод метиленовой группы глицина, предположительно - через формальдегид.
Исходя из механизма распада -аминокислот по Штрекеру следует предположить, что углерод карбоксильной группы глицина не будет включаться в состав меланоидинового пигмента; однако, такое включение происходит, и притом довольно интенсивно; по-видимому, это осуществляется через продукт, который образуется в результате перегруппировки Амадори.
Способность реакционной смеси, замедлять перекисное окисление линолевой кислоты, на первых этапах реакции (10-40 мин.) постепенно усиливается, и достигнув максимальную величину, далее незначительно падает; антиоксидантная активность выделенного меланоидинового продукта (М >3500 дальтон) ниже (на 10-15%) этой максимальной величины. Способность реакционной смеси, захватывать ДПГ*, с начала реакции (10-20 мин.) быстро возрастает (через 20 мин. она эквивалентна кол-ву 1,9 μМ Тролокса в 1 мл реакционной смеси); однако, по ходу реакции, способность реакционной смеси захватывать радикалы ДПГ* почти исчезает. Способность выделенного меланоидинового продукта (М >3500 дальтон), захватывать ДПГ*, весьма слабая. Следовательно, антиоксидантная активность реакционной смеси D-глюкоза/глицин возникает по мере потемнения смеси, однако активность не коррелирует с количеством образующегося меланоидинового пигмента; наиболее активными антиоксидантами являются промежуточные продукты этой реакции.
ПРИРОДА АТЕРОГЕННОСТИ ДИКАРБОНИЛОВ.
Кумскова Е.М., Аксенов Д.В., Ланкин В.З.
ФГУ «РКНПК Росмедтехнологий», 121552, г. Москва, ул.3-я Черепковская 15А Тел. (495) 414-65-17, elena.kumskova@gmail.com.
Окислительный стресс при атеросклерозе и карбонильный стресс при сахарном диабете типа 2 (СД-2) сопровождаются накоплением низкомолекулярных диальдегидов, способных вызывать модификацию белков по свободным аминогруппам. Этот процесс играет ведущую роль в модификации ε-аминогрупп лизиновых остатков апопротеина В100 липопротеидов низкой плотности (ЛНП), что приводит к изменению структуры частицы и их усиленному захвату моноцитами-макрофагами стенки сосуда. Перегруженные липидами макрофаги трансформируются в пенистые клетки, способные образовывать кластеры, в результате чего происходит формирование зоны липоидоза в стенке сосуда. Целью настоящей работы было сравнительное исследование эффективности процесса модификации ЛНП под действием природных низкомолекулярных дикарбонильных соединений, образующихся при окислительном (МДА) и карбонильном стрессе (глиоксаль - Гл и метилглиоксаль - МГл). Показано, что при хронической гипергликемии уровень липогидропероксидов в ЛНП значительно выше, чем при атеросклерозе с гиперхолестеринемией. Таким образом, окислительная модификация ЛНП может протекать более интенсивно при наличии СД-2 по сравнению с атеросклерозом. Выявлено, что шиффовы основания с наибольшей скоростью образуются при инкубации ЛНП с МДА, при инкубации ЛНП с МГл и Гл скорость накопления флуорофоров значительно меньше. При электрофоретическом исследовании ЛНП обнаружено, что практически все МДА-модифицированные ЛНП остаются на старте, тогда как ЛНП, модифицированные Гл и МГл, входят в гель на 35% и 44%, соответственно. Гл- и МГл-модифицированные ЛНП более подвержены спонтанной агрегации, чем МДА-модифицированные ЛНП. При исследовании модификации L-лизина под действием МГл, но не МДА, обнаружено усиление хемилюминесценции люцегенина, которое практически полностью ингибировалось добавлением супероксиддисмутазы (СОД) – т.е. наблюдалось неферментативное генерирование супероксидного анион-радикала. Эффект неферментативного генерирования супероксида при взаимодействии МГл со свободными аминогруппами может влиять на скорость агрегации ЛНП: добавление СОД снижает скорость агрегации ЛНП в присутствии МГл, но не влияет на скорость агрегации ЛНП в присутствии МДА. В ходе иммуноферментных исследований были обнаружены существенные различия в антигенных свойствах альдегид-модифицированных ЛНП: моноклональные антитела, полученные к МДА-модифицированным ЛНП, не связывались с ЛНП, модифицированными какими-либо другими дикарбонилами. Выявлена сильная положительная корреляция между уровнем МДА-модифицированных ЛНП в сыворотке крови пробандов и биомаркерами атеросклероза – уровнями общего холестерина и холестерина ЛНП. Таким образом, нами выявлены качественные различия в физико-химических свойствах ЛНП, модифицированными различными альдегидами, что влияет на их атерогенность. Обнаружена возможность генерирования супероксидного анион-радикала при карбонильном стрессе, что может приводить к усилению окислительного стресса при сахарном диабете.
ВЛИЯНИЕ ЛЕВОРИНА А2 НА ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ
ЛИПИДОВ
Курбанов О.Г., Касумов Х.М.
Институт Ботаники Национальной АН Азербайджана, г. Баку, AZ-1073, Патамдартское шоссе, 40, тел.: +99 (412) 5106591
E-mail: ogtay07@gmail.com
Известно, что при патологии (ишемия, стенокардия, аритмия и инфаркт миокарда) в сердечной мышце значительно активизируются перекисные процессы, приводящие к появлению короткоцепочечных альдегилов, типичным представителем которых является малоновый диальдегид. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) рассматривается как постоянно протекающий физиологический процесс, биологическое значение которого состоит в обновлении липидного бислоя клеточных мембран. Существует особая антиоксидантная система, в которую входят различные ферменты и низкомолекулярные соединения, препятствующие чрезмерному развитию свободнорадикальных процессов в организмов в процессе. Активация ПОЛ приводит к изменению важнейших дезадаптационных механизмов, способствующих развитию утомления и снижению работоспособности организма. При значительной активации в организме перекисных процессов антиоксидантная защита оказывается слабо эффективной. В результате свободнорадикальное окисление оказывает выраженное повреждающее воздействие на биологические мембраны, изменяя их проницаемость, нарушая функционирование мембраносвязанных ферментов и рецепторов, инициируя в организме различные патологические процессы. Важной задачей является исследование возможности предупреждения усиления свободнорадикальных реакций путем использования экзогенных мембраноактивных соединений, повышающих мощность антиокислительной защиты организма. Наши исследования показали, что полиеновый антибиотик леворин А2 в растворах диметилсульфоксида (ДМСО) эффективно подавляет свободнорадикальное окисление в мембранах. Исходный леворин А2 оказался наиболее эффективным из изученных полиеновых антибиотиков. Результаты экспериментов по влиянию раствора леворина А2 в ДМСО на интенсивность протекания процессов ПОЛ в гомогенатах ткани печени крыс показали, что по мере возрастания концентрации леворина, концентрация образованных свободных радикалов уменьшается. Таким образом, леворин А2 проявляет антиоксидантную активность, что выражается в процентах ингибирования реакций ПОЛ при различных концентрациях антибиотика. При концентрации антибиотика 10-7 М уже наблюдается 15-%-ное подавление ПОЛ в гомогенате по сравнению с контролем. При увеличении концентрации антибиотика наблюдается усиление эффекта подавления ПОЛ, который достигает максимального значения (около 50%) при концентрации антибиотика 5.10-5 М. Дальнейшее увеличение концентрации антибиотика приводит к снижению антиоксидантной активности препарата. При концентрации 10-4 М антиоксидантная активность препарата падает на 10%, а при концентрации 5.10-4 М – на 40% по отношению к максимальной активности. Полученные данные показывают возможность торможения при соответствующих концентрациях леворина А2 роста свободных радикалов в мембранах мышечных клеток.
ПЕРСПЕКТИВЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИОКСИДАНТА ИЗ MARRUBIUM VULGARE L. И М. ALTERNIDENS RECH.
Курбатова Н.В., Музычкина Р.А.
Казахский национальный университет им. аль-Фараби, г.Алматы
Казахстан, 050012, г.Алматы, ул. Карасай батыра, 95А,
e-mail: kurbatova_nv77@mail.rи
В Казахстане произрастает 2 вида, относящихся к роду Marrubium L. - Marrubium vulgare L. (шандра обыкновенная) и М. alternidens Rech. (ш.разнозубая) - многолетние травянистые растения из семейства Lamiaceae Lindl. Проведенное исследование выполнено для образцов сырья заготавливаемых ежегодно в 2007-2009 гг. в естественных условиях произрастания и в культуре по фазам вегетации. Такое систематическое сравнительное исследование с использованием фито- и хроматографического анализов позволило отобрать оптимальный экстрагент (вода и 50% спирт), установлена динамика накопления доминирующих групп БАВ у культивируемых и дикорастущих образцов в зависимости от фаз развития; максимальное накопление БАВ наблюдается в фазы бутонизация и начала цветения, поэтому для промышленных заготовок сырья был рекомендован сбор растений в фазы бутонизации - цветения.
Методами хроматографии (БХ и ТСХ) в сравнении со стандартными образцами основных групп растительных веществ установлено наличие 12 групп БАВ (дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типа, эфирные масла, аминокислоты, углеводы, фенолы, фенолокислоты, флавоноиды, алкалоиды, сапонины, кумарины, полисахариды, гликозиды), из них идентифицировано 20 БАВ (углеводов - 4, фенолов - 1, фенолокислот - 5, флавоноидов - 3, аминокислот - 7).
Исследуемые образцы по компонентному составу и количественному содержанию практически значимых биологически активных веществ превосходят аналогичные виды, произрастающие в других географических зонах. Например, аминокислоты 5.85-8.37%; дубильные вещества 2-7%; флавоноиды 1-2%; сапонины, полисахара, кумарины, органические кислоты 4.7-8.0% и др.
Вышеуказанный состав позволил рекомендовать виды рода Marrubium L. в качестве лекарственного сырья и сырья для получения препарата. Разработана и утверждена Временная Фармакопейная статья Республики Казахстан, получено Регистрационное удостоверение Минздрава РК на лекарственное растительное сырье.
Из травы Marrubium vulgare L. получен комплексный фитопрепарат (20.5 г), который прошел апробацию на антиоксидантную активность в исследовательском центре Института химии г.Карачи (Пакистан). Выявленная антиоксидантная активность препарата (95%) превышает СО пропилгаллата (94.12%), что позволяет сделать заключение о целесообразности использования исследованного вида в качестве сырья для получения препарата с антиоксидантной активностью.
ВЛИЯНИЕ КАЛИКУЛИНА А НА ЭФФЕКТ ОКИСЛЕННОГО
ГЛУТАТИОНА И ПРЕПАРАТА ГЛУТОКСИМ НА
ВНУТРИКЛЕТОЧНУЮ КОНЦЕНТРАЦИЮ Са2+ В МАКРОФАГАХ
Курилова Л.С., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Игловикова О.И., Крутецкая Н.И., Шамшев А.В., Бутов С.Н.
Санкт-Петербурский государственный университет, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, (812) 328-94-65, cozzy@mail.ru
В настоящее время повысился интерес к функционированию редокс-систем клеток и влиянию окислителей и восстановителей на различные клеточные процессы в норме и при патологии. Так, фармакологический аналог окисленного глутатиона (GSSG) препарат глутоксим (динатриевая соль GSSG c платиной с наноконцентрации) рассматривается как иммуномодулятор широкого спектра действия, который стимулирует процессы кроветворения, активирует системы фагоцитоза, способствует функциональной дееспособности тканевых макрофагов. В то же время механизмы, опосредующие действие GSSG и глутоксима на клетки, до сих пор практически не изучены. Ранее нами было впервые показано, что GSSG и глутоксим вызывают двухфазное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, [Ca2+]i, отражающее мобилизацию Са2+ из тапсигаргин-чувствительных Са2+-депо и последующий вход Са2+ из наружной среды. С использованием широкого спектра фармакологических агентов, влияющих на компоненты сигнальных систем в клетке, впервые показано, что в регуляторном действии GSSG и глутоксима на [Ca2+]i в макрофагах участвуют тирозинкиназы, тирозинфосфатазы, фосфолипаза С, протеинкиназа С, фосфатадилинозитолкиназы, а также малые G-белки семейства Ras. Кроме того, с использованием агентов, вызывающих деполимеризацию актиновых филаментов латрункулина В и цитохалазина D, впервые показано, что кратковременная (в течение 5 мин) инкубация клеток с этими агентами вызывает усиление обеих фаз Са2+-ответа, индуцируемого глутоксимом или GSSG, в то время как более длительная преинкубация (в течение 20 мин) приводит к практически полному подавлению Са2+-ответов, вызываемых глутоксимом или GSSG. Представлялось также целесообразным исследовать влияние агентов, вызывающих стабилизацию микрофиламентов, на вызываемое GSSG или глутоксимом увеличение [Ca2+]i в макрофагах.
С использованием флуоресцентного Са2+-зонда Fura-2AM исследовано влияние стабилизатора актиновых филаментов каликулина А на Са2+-ответы, индуцированные GSSG или глутоксимом, в макрофагах. Показано, что предварительная инкубация клеток со 100 нМ каликулина А в течение 10 мин до введения 100 мкг/мл GSSG или глутоксима вызывает значительное (на 50 %) уменьшение фазы мобилизации Са2+ из депо и последующего входа Са2+ из наружной среды, вызываемых GSSG или глутоксимом. Полученные данные свидетельствуют об участии актиновых филаментов в комплексном сигнальном каскаде, вызываемом GSSG или глутоксимом, и приводящим к увеличению [Ca2+]i в макрофагах. На основании результатов, полученных в настоящей работе и ранее, можно предположить, что GSSG и глутоксим трансактивируют рецепторы с собственной тирозинкиназной активностью и запускают комплексный сигнальный каскад, в котором участвуют тирозинкиназы, тирозинфосфатазы, фосфатидилинозитолкиназы, фосфолипаза С, протеинкиназа С, малые G-белки и элементы актинового цитоскелета, что приводит к увеличению [Ca2+]i в макрофагах. В данной работе выявлен новый компонент в этой сигнальной цепочке – актиновые филаменты. |
