УДК 637.325:543.54
ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЭКСТРАКЦИИ
МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ИЗ КОРНЕВИЩ
ИМБИРЯ (Zingiber officinale)
Ельчанинов В.В., к.т.н.
ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, г. Барнаул
Для производства молочного продукта под названием "джиангжинаи" или "джиангжуангнаи" ("jiangzhinai", "jiangzhuangnai" – англ.) в южных регионах Китайской Народной Республики уже более 100 лет применяют сок корневищ имбиря (Zingiber officinale), который проявляет молокосвертывающую активность [1].
Протеиназа, выделенная из корневищ имбиря в 1973 году, в соответствии с общепринятой номенклатурой получила название "зинджибаин" (“zingibain” – англ.) [2]. В том же году, методом ионообменной хроматографии (ИОХ), зинджибаин был разделен на 2 изофермента - GP I и GP II (GP = ginger protease, англ.) [3]. Позднее Choi et al. (1999) и Choi and Laursen (2000) определили первичную и третичную структуру GP II и установили, что протеиназа имбиря является цистеиновой пептидазой, относящейся к семейству пептидаз С1 (семейство папаина), которые характеризуются наличием цистеина в активном центре фермента [4,5]. Аскорбиновая кислота предохраняет зинджибаины от инактивации, а ионы Са2+, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и дитиотреитол (ДТТ) – способствуют активации этих ферментов [1,6,7]. Ионы тяжелых металлов - Cu2+, Fe2+, Cd2+, Hg2+ - ингибируют активность протеиназ имбиря [7]. Протеиназы имбиря гидролизуют нативный коллаген, преимущественно по связям, в которых Pro занимает положение Р2 [8]. В связи с этим, до недавнего времени основной интерес к зинджибаинам был связан, главным образом, с их протеолитической активностью и перспективами использования этих ферментов в мясоперерабатывающей промышленности для тендеризации (размягчения) сырья [4,8,9].
В 2011 году опубликована процедура выделения и частичной очистки молокосвертывающего фермента из имбиря методом ИОХ [10]. По данным SDS-электрофореза и изоэлектрофокусирования, фермент имеет молекулярную массу (ММ) порядка 31 кДа и представлен тремя изоформами с pI около 5,58, 5,40 и 5,22. Температурный оптимум протеолитической активности (ПА) изоферментов коагулянта молока из имбиря лежит в диапазоне 40-600С, а максимальная молокосвертывающая активность (МА) проявляется при 700С. Зинджибаины способны гидролизовать изолированные αS1-, β- и κ-казеины, при этом в наибольшей степени протеолитической деградации подвержен αS1-казеин. К-казеин гидролизуется более специфично, чем αS1- и β-казеины. При увеличении температуры от 400С до 700С, скорость гидролиза к-казеина возрастает, тогда как аффинность и специфичность - уменьшаются. В молекуле κ-казеина зинджибаины, преимущественно, гидролизуют связи Ala90-Glu91 и His102-Leu103. Молокосвертывающая активность, аффинность и специфичность по отношению к к-казеину указывают на то, что коагулянты молока из имбиря могут рассматриваться как перспективные аналоги натурального сычужного фермента, дефицит которого наблюдается во всем мире на протяжении последних 30 лет.
Актуальность исследования связана с возможным использованием коагулянтов молока из имбиря в сыроделии, в качестве заменителя натурального сычужного фермента [1,10].
Цели и задачи. Целью исследования является разработка технологии выделения и частичной очистки молокосвертывающего фермента (ферментов) имбиря. В задачи данной работы входила предварительная оценка параметров получения коагуляционно активных экстрактов из корневищ имбиря.
Материалы и методы. Удельную МА жидких препаратов, в условных единицах на миллилитр (УЕ/мл), определяли по ранее опубликованной методике [11]. Для определения удельной МА использовали субстрат сухой стандартизированный (Субстрат-СТ.3), производства ОАО "МЗСФ" (г. Москва). Контролем служил отраслевой контрольный образец сычужного фермента (ОКО СФ), серии 2012/2013, производства ОАО "МЗСФ" (г. Москва).
Корневища имбиря, приобретенные на местном сельскохозяйственном рынке, промывали холодной проточной водой, высушивали фильтровальной бумагой и нарезали на пластинки, размером ~6 х 10 х 1 мм, с использованием терки из нержавеющей стали. Измельченную ткань корневища смешивали с 20 mМ Na-ацетатным (Na-Ac) буфером (рН=5,5) в соотношении 1:2 (масса : объем). Готовили контрольный (только Na-Ac буфер) и 2 опытных образца: в опыте №1 буфер содержал 5 mМ ЭДТА, в опыте №2 - 5 mМ ЭДТА и 5 mМ ДТТ. Контрольную и опытные смеси гомогенизировали с использованием блендера (Philips HR-2094, максимальные обороты, 5 минут при комнатной температуре). Получали три типа гомогенатов в 20 mМ Na-ацетатным буфере: контроль (без добавок), опыт №1 (+ЭДТА), опыт №2 (+ЭДТА, +ДТТ). Каждый из гомогенатов разделяли на 2 равные части и в одну из них вносили NaCl до конечной концентрации 2%, мягко перемешивали в течение 60 минут при комнатной температуре и фильтровали через нейлоновые фильтры типа NY1H, с диаметром пор 100 мкм (Millipore, Франция). Таким способом получали 1 контрольный и 5 опытных образцов (см. информацию к рисунку 1). В полученных фильтратах определяли удельную МА.
Результаты и обсуждение. Результаты определения удельной МА экстрактов из корневищ имбиря представлены на рисунке 1.
Мы видим, что коагуляционную активность проявляют образцы №3, №5 и №6 - в состав которых входит протектор сульфгидрильных групп (ДТТ) и/или хелатирующий агент (ЭДТА). Это хорошо согласуется с данными других авторов [1,6,7]. Наиболее активен экстракт с ЭДТА и ДТТ, без хлорида натрия (образец №5). Максимальную молокосвертывающую активность обеспечивает наличие в экстрагенте протектора сульфгидрильных групп (образец №5, сравните его с образцом №3, в котором присутствует только хелатирующий агент), что свидетельствует о важности SH-групп в поддержании каталитической способности молокосвертывающего фермента (или ферментов) имбиря.
|
|
Рисунок 1 - Удельная молокосвертывающая активность экстрактов из корневищ имбиря.
Все образцы содержат 20 mМ Na-Ac буфер (рН=5,5). Состав контрольных и опытных образцов:
№1. Контроль (только буфер);
№2. Опыт (+2% NaCl);
№3. Опыт (+5 мМ ЭДТА);
№4. Опыт (+5 мМ ЭДТА, +2% NaCl);
№5. Опыт (+5 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ);
№6. Опыт (+5 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, +2% NaCl).
|
В присутствии ЭДТА и ДТТ, хлорид натрия в концентрации 2% подавляет коагуляционную активность экстрактов. Разница в молокосвертывающей активности экстрактов без хлорида натрия (№5 - 66,7 УЕ/мл) и в присутствии 2% NaCl (№6 - 27,0 УЕ/мл) составляет ~40%. Снижение коагуляционной активности может быть обусловлено чувствительностью коагулаз имбиря к высокой ионной силе, что подтверждается данными Huang, et al. [10], согласно которым, хлорид натрия в концентрации 2% приводит к резкому уменьшению МА очищенных препаратов зинджибаинов (на 40-50%). Вместе с тем, экстракция в гипертонических условиях, должна усиливать освобождение (выход) фермента из растительной ткани. При этом не исключено, что при снижении ионной силы (например, обессоливанием) после проведения экстракции, МА препарата не только восстановится, но и увеличится (проведение экспериментов по снижению ионной силы методом гель-фильтрации является одной из задач будущих исследований).
Таким образом, использование в качестве экстрагента 20 mМ Na-Ac буфера (рН=5,5) с добавлением 5 мМ ЭДТА и 5 мМ ДТТ, позволяет получить из корневищ имбиря экстракты с наибольшей молокосвертывающей активностью.
Вывод. Для получения коагуляционно активного экстракта из корневищ имбиря, в состав экстрагента необходимо вводить хелатирующий агент (ЭДТА) и протектор сульфгидрильных групп (ДТТ).
Список литературы.
1. Su, H.P. Characterization of ginger proteases and their potential as a rennin replacement. /H.P. Su, M.-J. Huang, H.-T. Wang // J. Sci. Food Agric.- 2009.- V. 89.- P. 1178–1185.
2. Thompson, E.H. Ginger rhizome: A new source of proteolytic enzyme. /E.H. Thompson, I.D. Wolf, C.E. Allen // J. Food Sci.- 1973.- V. 38.- P. 652–655.
3. Ichikawa, Y. Purification of ginger protease. / Y. Ichikawa, H. Sana, K. Michi // J. Jap. Soc. Food Nutr.- 1973.- V 26.- P. 337–383.
4. Choi, K.H. The 2.1 angstrom structure of a cysteine protease with proline specificity from ginger rhizome, Zingiber officinale /K.H. Choi, R.A. Laursen, K.N. Allen // Biochemistry.- 1999.- V. 38.- P. 11624–11633.
5. Choi, K.H. Amino-acid sequence and glycan structures of cysteine proteases with proline specificity from ginger rhizome Zingiber officinale. / K.H. Choi, R.A. Laursen // Eur. J. Biochem.- 2000.- V. 267.- P. 1516–1526.
6. Adulyatham, P. Stabilization and partial purification of a protease from ginger rhizome (Zingiber officinale Roscoe). /P. Adulyatham, R. Owusu-Apenten // Food Chem. Toxicol.- 2005.- V. 70.- P. 231–234.
7. Ohtsuki, K. Purification of ginger proteases by DEAE-Sepharose and isoelectric focusing. / K. Ohtsuki, K. Taguchi, K. Sato, M. Kawabata // Biochim. Biophys. Acta.- 1995.- V. 1243.- P. 181–184.
8. Kim, M. Plant collagenase: Unique collagenolytic activity of cysteine proteases from ginger. / M. Kim, S.E. Hamilton, L.W. Guddat, C.M. Overall // Biochim. Biophys. Acta.- 2007.- V. 1770.- P. 1627–1635.
9. Naveena, B.M. Tenderization of buffalo meat using plant proteases from Cumumis trigonus Rosb (Kachri) and Zingiber officinale Roscoe (ginger rhizome). / B.M. Naveena, S.K. Mendiratta, A.S.R. Anjaneyulu // Meat Sci.- 2004.- V. 68.- P. 363–369.
10. Huang, X.W. Purification, characterization, and milk coagulating properties of ginger proteases / X.W. Huang, L.J. Chen, Y.B. Luo, H.Y. Guo, F.Z. Ren // J. Dairy Sci.- 2011.- V. 94.- № 5.- Р. 2259-2269.
11. Ельчанинов, В.В. Молокосвертывающий фермент из сычугов северного оленя / В.В. Ельчанинов, М.С. Уманский, А.Н. Белов, А.Д. Коваль, В.Г. Шелепов // Сыроделие и маслоделие.- 2005.- №4.- С.13-16.
Реферат
УДК 637.325:543.54
ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЭКСТРАКЦИИ
МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ИЗ КОРНЕВИЩ
ИМБИРЯ (Zingiber officinale)
Ельчанинов В.В., к.т.н.
ГНУ Сибирский научно-исследовательский институт сыроделия Россельхозакадемии, г. Барнаул
Исследовано влияние хелатирующего агента (этилендиаминтетраацетата), протектора сульфгидрильных групп (дитиотреитола) и хлорида натрия на эффективность экстракции молокосвертывающего фермента из корневищ имбиря. Показано, что хлорид натрия в концентрации 2% подавляет молокосвертывающую активность экстрактов. Установлено, что использование в качестве экстрагента 20 mМ Na-Ac буфера (рН=5,5) с добавлением 5 мМ этилендиаминтетраацетата и 5 мМ дитиотреитола, позволяет получить из корневищ имбиря экстракты с наибольшей молокосвертывающей активностью. |
