Разработка технологии параллельного иммуноферментного и генамплификационного (nat) минипул- тестирования донорской крови на вич, вирусы гепатитов в и с
Скачать 343.24 Kb.
|
Материалы и методы исследованияИсследования проводились на образцах плазмы донорской крови, заготавливаемой на СПК ФУ «Медбиоэкстрем» при Минздраве РФ и от кадровых и безвозмездных доноров СПК КЗ г. Москвы. Наша работа по ПЦР детекции HIV, HBV и HCV в начальной стадии была произведена на пробах, обрабатываемых TRIAZOLом, поскольку такая обработка давала более интенсивные сигналы РТ-ПЦР, но она включает один перенос в процессе экстракции (водной фазы для осаждения нуклеиновых кислот изопропанолом) и использует токсичный реагент – фенол. В связи с этим нами был адаптирован однопробирочный метод выделения нуклеиновых кислот из образцов биоматериалов, разработанный в ЦНИИ ТММТ АМТН (Н.А.Федоров, А.А.Елов, Ю.С.Суханов. Патент № 2134871, приоритет от 01.12.98). Наблюдавшееся при электрофорезе ослабление РТ-ПЦР сигналов по сравнению с теми же самыми образцами, обработанными TRIAZOLом, стало несущественным после применения предподготовки проб посредством центрифугирования и удаления супернатанта и введения дополнительной отмывки осадка нуклеиновых кислот 70% этанолом. Одна из основных проблем на пути внедрения метода генотестирования связана с выделением РНК и ДНК (НК) любого происхождения в пригодной для ПЦР форме. Эта проблема особенно актуальна для РНК-содержащих структур в связи с нестойкостью РНК из-за рибонуклеазного гидролиза. Для одновременного выделения вирусных, бактериальных и клеточных ДНК и РНК лизис биологического материала мы осуществляли раствором 6М NaI, содержащим РНК-носитель, при этом, раствор полученных НК пригоден как для ДНК-ПЦР, так и для РТ-ПЦР. Полученный осадок суммы ДНК и РНК обрабатывали обратной транскриптазой в буфере, содержащем трифосфаты и антисмысловые праймеры к определяемым РНК. При этом без изоляции РНК получали смесь всех содержащихся в биопробе ДНК и ДНК-копий (кДНК) ПЦР-тестируемых РНК, которая далее вводилась в ПЦР-анализы (Н.А.Федоров, А.А.Елов, Ю.С.Суханов. Патент № 2164532, приоретет от 11.07.2000). Набор реагентов для высокочувствительного обнаружения РНК и ДНК вирусов при анализе минипулов методом двукратной ПЦР состоял из: а) раствора для обратной транскрипции, содержащего оптимальный для обратной транскриптазы MuLV солевой буфер без дитиотрейтола, трифосфаты и aнтисмысловые праймеры на ВИЧ и вирус гепатита С (RTB IC); б) рабочего раствора обратной транскриптазы MuLV в буфере для хранения этого фермента, содержащим дитиотрейтол; в) растворов реагентов для первой ПЦР – a1-HI для ВИЧ и a1-HC для гепатита С, содержащих трифосфаты, внешние праймеры и ДНК внутреннего контроля в количестве 10 молекул на пробу; г) растворов реагентов для второй ПЦР – a2-HI для ВИЧ и a2-HC для гепатита С, содержащих трифосфаты и внутренние праймеры; д) раствора реагентов для однократной ПЦР на вирус гепатита В, содержащего праймеры, трифосфаты и внутренний стандарт в количестве 100 молекул на пробу; е) двукратного буфера с ферментом Taq-пoлимepазoй (2хБФ); ж) воды для ПЦР; з) масла для ПЦР; и) положительного контроля - раствора РНК или ДНК, содержащего амплифициpyeмый участок. Для ПЦР-анализа на РНК ВИЧ, РНК вируса гепатита С и ДНК вируса гепатита В использовали осадок НК, полученный по технологии однопробирочного метода. Обратную транскрипцию РНК ВИЧ и вируса гепатита С проводили одновременно с растворением сухого осадка НК. Перечисленные выше реагенты, изготовлены в ЦНИИ ТММТ АМТН по проекту «Ген-гем-тест». Порядок работы для серии проб минипулов числом n. 1. Готовили раствор для обратной транскрипции путём смешивания реагента RTB IC (буфер, содержащий трифосфаты и aнтисмысловыe праймеры на ВИЧ и вирус гепатита С), воды и реагента RT (рабочий раствор обратной транскриптазы MuLV) в соотношении 15:15:1 в количестве 31x(n+3) мкл. Далее вносили по 30 мкл полученного раствора в пробирки с сухими остатками НК и суспендировали эти осадки на вортексе. 2. Три пробирки на 0,5 мл для контролей маркировали как HIV+ (положительный контроль на ВИЧ), НСV+ (положительный контроль на гепатит С) и K- (Отрицательный контроль) и вносили в эти три пробирки по 30 мкл готового раствора для обратной транскрипции. 3.Добавляли в пробирку HIV+ 3 мкл положительного контроля HIV+, а в пробирку НСV+ - 3 мкл положительного контроля НСV+. В oтрицaтельный контроль (К-) добавляли 3 мкл воды. Кратко центрифугировали все пробирки с пробами и контролями для сбора жидкости на дне и инкубировали их 30 мин. в микротермостате при 42° С для проведения обратной транскрипции. 4. Готовили смеси для ПЦР-обнаружения вирусов. Для ВИЧ смешивали 5x(n+3) мкл воды, 5х(n+3) мкл реагента а1-HI (раствор, содержащий праймеры, трифосфаты и внутренний стандарт), и 10х(n+3) мкл 2хБФ (двукратный буфер с ферментом Taq-пoлимepазoй), после чего распределяли смесь по 20 мкл в n + 3 пронумерованных пробирок для ПЦР. Для вируса гепатита C смешивали 10x(n+3) мкл реагента а1-НС и 10х(n+3) мкл 2хБФ и распределяли смесь по 20 мкл в n + 3 пpoнумepoвaнных пробирок для ПЦР. Для вируса гепатита В смешивали 5x(n+3) мкл воды, 5х(n+3) мкл реагента аНВ и 10x(n+3) мкл 2хБФ и также распределяли смесь по 20 мкл в n + 3 прoнумepoванных пробирок для ПЦР. 5. Добавляли по 2 капли масла во все пробирки для ПЦР. Пробирки с пробами после обратной транскрипции центрифугировали 1 мин. при 14 000 об/мин. для отделения нерастворившегося осадка. Пробирки с контролями, не содержащие осадка, не центрифугировали. 6. Из пробирок после обратной транскрипции с помощью автоматической микропипетки одноразовыми наконечниками отбирали по 5 мкл прозрачного супернатанта и вносили его под масло в пробирки для ПЦР в следующей последовательности: 7. Вначале раствор из пробирки К- вносили в отрицательные контроли для всех трех вирусов, затем в соответствующие пробирки вносили растворы всех проб после обратной транскрипции и, в последнюю очередь, в пробирки для ПЦР вносили положительные контроли: для ВИЧ и гепатита С - соответственно по 5 мкл растворов из пробирок HIV+ и НСV+ после обратной транскрипции, а для гепатита В -3 мкл контрольного раствора ДНК вируса гепатита В (HBV+). Оставшиеся пробирки со смесью для ПЦР (по одной для каждого вируса) использовали как дополнительные отрицательные контроли, в которые раствор после обратной транскрипции не вносится. 8. Далее кратко центрифугировали все пробирки для разделения слоев и проводили ПЦР по программе 94° С 3 мин; далее 35 циклов: 92° С 30 сек, 55° С 30 сек, 72° С 30 сек, в конце 72° С 3 мин. 9. Смесь после ПЦР для определения вируса гепатита В, для которого достаточно однократной амплификации, анализировали электрофорезом в 2%-ном агарозном геле. Для вируса гепатита С и ВИЧ проводили вторую ПЦР в описанной ниже последовательности: 10. В новых амплификационных пробирках готовили смеси, объемом по 20 мкл каждой путем смешивания 10 мкл 2хБФ и10 мкл реагента а2-НС (для вируса гепатита С) и 10 мкл 2хБФ и 10 мкл реагента a2-HI (для ВИЧ). Затем добавляли масло. 11. Далее из каждой пробирки после первой ПЦР на ВИЧ и вирус гепатита С отбирали по 1,5 мкл реакционной смеси и вносили в соответствующую пробирку для второй ПЦР и проводили вторую ПЦР по программе: 94° С 30 сек; далее 15 циклов: 92° С 30 сек, 60° С 30 сек, 72° С 30 сек, в конце 72° С 3 мин., по окончании которой, анализировали смесь электрофорезом в 2%-ном агарозном геле. В работе использовали: 1) амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» (АО ДНК-Технология, г.Москва); 2) центрифуга «СМ-50» фирмы ELMI, Латвия; 3) трансиллюминатор Biometra TI 1 Германия; 4) Гель-Сканер ГСК –«Шатёр-1000м» ТОО «Дельтатех» научный парк МГУ, г.Москва; 5) Камера для электрофореза ЭФК-140 ТОО «Дельтатех» научный парк МГУ, г.Москва; 6) Микротермостат «Биоком»- TERMO 24-15; 7) Набор автоматических пипеток; 8) Универсальный автоматический комплекс “MICROLAB AT plus 2 / F.A.M.E. фирмы HAMILTON, Щвейцария. Результаты исследования и их обсуждение Первый опыт ручного минипул-ПЦР- тестирования донорской крови на HIV, HCV и HBV нами был получен на остатках плазмы, заключенной в трубочках одноразовой системы аппарата Гемонетик, удаляемой в отходы после проведения плазмафереза. Концы таких трубочек отрезали отдельными ножницами, обработанными раствором соляной кислоты, и выдавливали 1 каплю объёмом около 100 мкл в пробирку Эппендорфа для получения минипула от 10 доноров. Как показано на схеме (Рис.1), далее из этих пулов первого порядка путем объединения 100 мкл аликвот формировали пулы второго порядка из нескольких десятков, но не более чем от 100 доноров.
Рис. 1. Схема приготовления минипулов. По такой ручной технологии минипул-ПЦР-тестирования были исследованы 8849 донаций серонегативной плазмы, полученной методом плазмафереза в период с сентября 1998 года по апрель 1999 года (Таблица 1). Таблица 1. ПЦР анализ серонегативных донаций.
Далее мы получили возможность готовить минипулы из 8 и 12 донаций плазмы автоматически на самплере фирмы «Гамильтон» с использованием разработанной нами компьютерной программы формирования пулов с применением штрих-кодовой регистрации минипулов и индивидуальных донаций. Этот автомат работает с сериями из 96 проб в формате иммунологического 96-луночного планшета. Пулы из 8 и 12 донаций соответствуют столбцам и строкам микропланшета (Рис.2), а путем объединения аликвот этих минипулов можно создавать пул второго порядка, объединяющий все 96 образцов.. Если последний при ПЦР-анализе даст положительный сигнал, то идентификация вирус-содержащих донаций осуществляется путем ретестирования минипулов из 8 и 12 донаций как это показано на рисунках 2 и 3. Эта донация соответствует пересечению строки и столбца, минипулы которых дают ПЦР-положительные сигналы.
Рис. 2. Идентификация вирус-положительных донаций методом перекрестных промежуточных пулов из 8 и 12 донаций. Примечание к Рис. 2. Образцы плазмы, обозначенные цифрами 1-96, объединяются по 8 в промежуточные минипулы 1-12 (по столбцам планшета) и по 12 в минипулы A-H (по строкам планшета), и далее получают общий минипул из 96 образцов. На рисунке показан пример идентификации вирус-содержащей донации по результатам ПЦР-анализа, приведенных далее на рис.3. На пересечении столбца 5 и строки D, минипулы котроых дали положительные сигналы, находят донацию 41, которую следует выбраковать. Если будут две ПЦР-позитивные донации, то они дадут два ПЦР-положительных промежуточных пула из 8 донаций и два ПЦР-положительных промежуточных пула из 12 донаций. Однако на данном этапе при регулярном генотестировании донорской крови мы ограничивались только минипулами из 8 донаций и идентифицировали положительные донации путем ретестирования архивных донаций из 8, как показано на рисунке 4. Такое минипул-NAT-тестирование плазмы на основе полуавтоматической технологии нами проводилось в отношении первичных доноров Станции переливания крови ФУ «Медбиоэкстрем», которые еще не прошли ИФА-скринирование, т.е. не были отведены доноры с ИФА-положительными результатами.А Б1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 к- к+ А B C D E F G H 96 к- к+   Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа при идентификации донации, содержащей вирус гепатита В, в ПЦР-положительном пуле из 96 образцов. Примечание к Рис. 3. Были проанализированы минипулы 1-12, собранные по столбцам планшета (А), и минипулы А-Н, собранные по строкам планшета (Б). Положительные сигналы минипулов 5 и D позволяют точно определить инфицированную донацию 5D как показано на рис.2. Проба 96 – повтор анализа общего пула из 96 образцов, к- и к+ - соответственно отрицательный и положительный контроли. A Б 1 2 3 4 5 к- к+ 1 2 3 4 5 6 7 8 к- к+   Рис. 4. Пример идентификации донации, содержащий вирус гепатита В. Примечание к Рис. 4. ПЦР-анализ 5 минипулов по 8 проб (А) и последующего разложения минипула, давшего положительный сигнал (Б). В данном примере HBV-положительной оказалась донация 7 первого минипула. В Таблицах № 2 и № 3 приведены суммированные данные этих исследований. Прежде всего обращаем внимание на факт значительно большей частоты NAT-положительных донаций как в минипулах, так и при ретестировании индивидуальных донаций: она в несколько раз выше для HBV по сравнению с группой серонегативных доноров (Таблица 1). Группа серонегативных доноров в 6 раз более по численности, но не содержит HCV-NAT- положительных образцов. Соответственно, в группе первичных она составляет 0, 69 %, а в группе серонегативных – 0%. Важно провести сопоставление наших данных по первичным донорам (Таблица 2) с данными аналогичного уровня исследованиями 4231 донаций на РНК HCV в Банке Крови Сан-Пауло (Бразилия), и 2578 донаций в Гане. (Allain J. et al 2000) Таблица 2. ПЦР-анализы первичных доноров на СПК ФУ «Медбиоэкстрем» с 25.10.2000 г. по 26.02.2001 г.
Таблица 3. ПЦР-анализы первичных доноров на СПК ФУ «Медбиоэкстрем» с 01.03.2001 г. по 18.06.2001 г.
Соответственно, выявляемость NAT-позитивных донаций на РНК-HCV составляет 0,69% (СПК ФУ «Медбиоэкстрем»), 0,45% (Банк Крови г. Сан-Пауло, Бразилия) и 0,12% (Гана). Эти цифры одного порядка, но первичные доноры московского региона имеют более высокую частоту. Реальное минипул-ПЦР-тестирование плазмы крови доноров в микропланшетном формате из 96 образцов. Формирование минипула из 96 образцов и промежуточных минипулов из 8 и 12 образцов производили на самплере фирмы «Гамильтон». В штативе № 1 из 96 образцов плазмы доноров в положении D9 находилась плазма донора содержащего HBV в концентрации в 10 раз выше, чем международный стандарт (106 копий HBV/мл). В штативах № 2, № 3 и № 4 в положении D9 находились десятикратные разведения этой HBV-содержащей плазмы крови донора (1:10; 1:100 и 1:1000). Экстракцию ДНК из полученных минипулов производили из 100 мкл как однопробирочным методом, так и щелочным лизисом с последующей нейтрализацией эквимолярным количеством соляной кислоты. 1 2 3 4 к+ к- 0 1:10 1:100 1:1000  Рис. 5. ПЦР-тестирование ДНК HBV в четырех минипулах из 96 образцов, содержащих в положении D9 HBV-позитивную плазму в разведениях 0 (1), 1:10 (2), 1:100 (3), 1:1000 (4) до ультрацентрифугирования. На рисунке 5 представлена видеокомпьютерная распечатка электрофореграммы продуктов ПЦР минипулов плазмы из штативов № 1, № 2, № 3, № 4 до ультрацентрифугирования и после выделения однопробирочным методом. Положительный ПЦР сигнал от образца плазмы D9 отчетливо виден в минипулах из 8 и 12 образцов, обработанных однопробирочным методом (рис. 6), но в минипуле из 96 образцов этот сигнал не обнаруживается при однопробирочном методе выделения, но присутствует при обработке щелочным лизисом. Отсутствие ПЦР-сигнала в 96-образцовом минипуле при использовании однопробирочного метода обусловлено не столько большим разбавлением по сравнению с минипулами из 8 и 12 образцов, сколько наличием одного или нескольких образцов плазмы доноров, в которых содержались ингибиторы ПЦР, а в рядах горизонтали (D) и вертикали (9) таких образцов, содержащих ингибиторы ПЦР нет, поэтому эти минипулы были ПЦР-положительными. Косвенным подтверждением этому являются положительные ПЦР-сигналы в 96-образцовом минипуле после обработки щелочным лизисом. Хорошо известно, что 0,1 N NaOH гидролизует все белки и липиды, в том числе и ингибиторы ПЦР. Промежуточные пулы по 8 образцов (по столбцам): 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 к+ к-  Промежуточные пулы по 12 образцов (по строкам): A B C D E F G H к- к+  Рис. 6. Идентификация HBV-содержащей плазмы в пуле 1 из 96 образцов. Четыре 96-образцовых минипула, содержащих HBV-положительную плазму (D9) в разведениях 0, 1:10, 1:100, 1:1000, были подвергнуты ультрацентрифугированию при 48 000 g в течение 1 часа при + 40 С. Полученные плотные осадки обработаны однопробирочным методом и половину полученного раствора НК взяли для постановки ПЦР. Видеокомпьютерное изображение электрофореграмм представлено на рисунке 7. 1 2 3 4 к+ к- 0 1:10 1:100 1:1000  Рис. 7. ПЦР-тестирование ДНК HBV в четырех минипулах из 96 образцов, содержащих в положении D9 HBV-позитивную плазму в разведениях 0 (1), 1:10 (2), 1:100 (3), 1:1000 (4) после ультрацентрифугирования. Интенсивный сигнала ПЦР виден в 96-образцовом минипуле №1 и четкий, но менее интенсивный ПЦР-сигнал и в минипуле №2, более слабые, но достоверные сигналы видны и в минипулах №3 и №4. Напомним, что эти же 96-образцовые минипулы до ультрацентрифугирования были ПЦР-отрицательные. На рис. 8 представлены видеокомпьютерные изображения электорфореграмм минипулов из 8 образцов, входящие в 96-образцовые минипулы № 1, № 1, № 3 и № 4. Интенсивный ПЦР-сигнал обнаруживался в минипуле № 1 и далее ослаблялся пропорционально разведению. 1 2 3 4 к+ к-  Рис. 8 Девятые пулы по 8 образцов из 1, 2, 3 и 4 минипулов по 96 образцов, которые HBV-содержащую плазму в положении D9 имеют в разведениях 0, 1:10, 1:100 и 1:1000 соответственно. Разумеется, это наше первое реальное ПЦР-минипул тестирование донорской плазмы в формате 96-образцового микропланшета, но оно убеждает нас в том, переход от малых минипулов из 8 и 12 образцов к большим минипулам из 96 образцов во избежание получения ложно-отрицательных результатов в силу разбавления, требует концентрации вируса посредством ультрацентрифугирования при 48000 g 1 час. Одновременно с концентрацией вирусов вместе с отбрасыванием надосадочной жидкости удаляются и ингибиторы ПЦР. Для перехода к пулам из 96 донаций, в соответствии с опытом Германии и других стран Европы, необходимо применить ультрацентрифугирование пулов при 48 000 g в течение одного часа для концентрирования вирусов, а также определять лимит детекции HIV, HCV, и HBV на основе международных стандартов с известной концентрацией этих вирусов. Технология NAT-тестирования донорской крови позволила выявлять вирус-содержащие донации в серонегативных по антителам к HCV или по HBsAg HBV, и тем самым повысить вирусную безопасность трансфузий. Кроме того, NAT-тестирование серопозитивных донаций по антителам к HCV и по HBsAg HBV позволяет отделить группу людей не содержащих РНК и ДНК этих вирусов. Доля таких серопозитивных доноров составляет около 30% и 70% соответственно, по усредненным литературным данным. Весьма близки к ним наши данные, суммированные в таблице 4, которые показывают, что процент таких доноров, не содержащих РНК HCV и ДНК HBV, составляет около 42% и 55% соответственно. Таблица 4. ПЦР-анализ серопозитивных донаций.
Скорее всего, эти результаты отражают иную частоту инфицированности населения России. Разумеется, эти исследования прежде всего важны для ИФА-серопозитивных доноров на HCV и HBV, т.к. имеют отношение к прогнозу и к возможности реабилитации их. Но, не менее важны и для санитарно-эпидемиологической службы, поскольку распространителями вирусов гепатитов будут только лица, содержащие эти вирусы. Создание автоматизированной технологии для дополнительного минипул-NAT-тестирования всей донорской крови не только дает более высокую вирусную безопасность для реципиентов, но и позволяет выявлять бессимптомных вирусоносителей среди доноров и других больших контингентов людей (учащиеся, военные, пациенты стационаров, работники общепита и др.). Международный опыт показал, что разработка и внедрение такой технологии требует, прежде всего, наличия международных NAT-стандартов на разные вирусы для определения лимита детекции этих вирусов выраженном в числе копий в 1 мл, что позволяет применять любые NAT тест-системы, в том числе in-house и любые методы генамплификации. Несмотря на строгий отбор доноров в соответствии со специальными опросниками, скрининг их крови по общепринятым иммунологическим и биохимическим маркерам остаточный риск инфицирования ВИЧ, вирусами гепатитов В и С сохраняется. В основном, он обусловлен донациями, полученными от недавно инфицированных доноров (до сероконверсии). Например, частота HCV-инфицированных производственных пулов серонегативной на антитела к HCV плазмы на1996 год в NIBSC (Англия) составляла 5 %, а в институте П. Эрлиха (Германия)- 39%. В связи с этим, с 1 июля 1999 года в странах Европейского союза NAT-генотестирование пулов плазмы на РНК HCV стало обязательным и гарантируется международными стандартами ВОЗ для определения чувствительности (лимита детекции) в геномэквивалентах вируса в 1 мл.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
, 2, 3, …10
1, 12,13,…20
Похожие:
 | эпидемиологическая характеристика внутрибольничных гепатитов в и... Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского амн украины, заведующий лабораторией вирусных гепатитов и... | | Конспект урока "Группы крови. Переливание крови. Донорство" (Тема... ... |
 | Возможности лаборатории Центра крови 1-го мгму имени И. М. Сеченова Обследование доноров: определение hbsAg, антител к вирусу гепатита С, вич, сифилису | | Городского округа красноуфимск постановление О внесении изменений в постановление главы городского округа Красноуфимск №43 от 24. 01. 2011 года «Об утверждении комплексного плана... |
| Автор: Лебедева Ольга Дмитриевна Координаты ... | | Название урока Ознакомление с окружающим миром ... |
| Название На ІІ ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным... Разработка нормативной документации, программа по элективным курсам и курсам по выбору учащихся, компьютерной базы | | Сейчас в мире, пожалуй, нет взрослого человека, который не знал бы,... Вич-инфекция захватила практически все страны. В 2004 году в мире насчитывалось около 40млн вич-инфицированных – примерно 38 млн... |
| Реферат по биологии на тему: «Вирусы» Вирусы живут пока сражаются и погибают от бездействия. Они очень прихотливы к пище, живут «взаймы» за счёт клеток животных, растений... | | Конспект урока. Учитель Филаевская Н. В. Тема урока Графы ... |
| Конспект урока биологии в 8 классе Тема урока. Внутренняя среда организма.... Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Урок по вич статистика и история развития эпидемии Занятие необходимо начать с постановки проблемы: с начала эпидемии спида 64 млн человек в мире были инфицированы вич, 40 млн из них... |
| Учебный модуль Профилактика вич-инфекции среди пин, лечение и социальное сопровождение с вич/спидом | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Кровь, её состав и значение в обеспечении жизнедеятельности организма. Клеточные элементы крови эритроциты, лейкоциты, тромбоциты.... |
| Программа профилактики вич-инфекции в общеобразовательном учреждении... Вич/спида образовательной среде в разработке программ по профилактике вич-инфекции следует руководствоваться принципом многоаспектности.... | | Тема: «Компьютерные вирусы. Свойства и классификация» Научиться находить компьютерные вирусы с помощью программого обеспечения «Антивирус Касперского 2011» |
