Разработка технологии параллельного иммуноферментного и генамплификационного (nat) минипул- тестирования донорской крови на вич, вирусы гепатитов в и с
Скачать 343.24 Kb.
|
| W.K. Roth и E. Seifried, (2002) подтвердили ретроспективным анализом отсутствие трансмиссии HCV в течении трёх лет после введения минипул-ПЦР-тестирования в институте Франкфурта на Майне и отсутствие сероконверсии архивных образцов, тестируемых в индивидуальных ПЦР. Сообщение T.J. Legler et al (2000) о том, что тестирование индивидуальных донаций крови на РНК HCV значительно уменьшает остаточный риск HCV- инфицирования по сравнению с минипул- NAT- тестированием, в этой связи является малодоказательным. Вопрос выбора размеров минипулов для NAT-тестирования решается на основе реальной чувствительности (лимита детекции вирусов), которая устанавливается путем тестирования разведений международных стандартов с известной концентрацией HIV, HCV и HBV, концентрирования вирусов в минипуле и определения процента выхода РНК и ДНК в процессе экстракции их из плазмы конкретным методом. В качестве примера можно привести уже упомянутые нами в первой главе данные Японского Красного Креста по минипул-NAT-тестированию донаций крови из 500 и 50 образцов. Поскольку частота NAT-положительных донаций при использовании минипулов из 50 образцов была выше, чем в минипулах из 500 образцов, в настоящее время служба крови Красного Креста Японии проводит NAT-скрининг донорской крови в минипулах из 50 образцов. Такой сравнительный опыт NAT-тестирования донорской крови в минипулах из 4, 8, 10, 12, 16 и 32 образцов был получен и нами. К началу нашей деятельности мы не располагали международными или национальными рабочими стандартами для определения лимита детекции, и мы не имели автоматического самплера для приготовления минипулов из 96 образцов в формате микропланшета. После того, как были созданы международные стандарты на NAT- тестирование HIV, HCV и HBV, появилась реальная возможность осуществить дополнительное NAT- скринирование донорской крови методом минипулов, чтобы уменьшить затраты времени и материалов на тестирование одной донации. В обнаруженном ПЦР-положительном пуле из 96 образцов в микропланшетном формате вирус-содержащая донация определяется путем ретестирования первичных минипулов из 8 и 12 донаций как показано на рис.2 и 3. Однако с учетом небольших объёмов анализируемой донорской крови (в пределах 1000 донаций в месяц) определение вирусов, в основном, проводилось в небольших минипулах из 8 или 10 донаций, как и при исследованиях аналогичного уровня в некоторых зарубежных банках крови. Работа с такими пулами из нескольких образцов целесообразна на первом этапе проведения NAT-тестирования и для СПК, типа нашей, с пропускной способностью около 10000-15000 донаций в год. Важным этапом организации минипул-NAT-тестирования является обеспечение пулирования плазмы в течение первых суток после получения крови и архивирования исследуемых образцов с целью последующей идентификации NAT-положительных донаций в NAT-положительном минипуле и ретроспективные исследования посттрансфузионных случаев инфицирования реципиентов. Мы не применяли коммерческие системы для экстракции ДНК и РНК из плазмы или лейкоцитов крови. Наш первый опыт минипул-NAT-тестирования состоялся только благодаря тому, что Н.А. Федоровым и А.А. Ёловым был создан однопробирочный, быстрый способ одновременной экстракции РНК и ДНК с последующей обратной транскрипцией РНК ВИЧ и HCV в полученном осадке НК, что позволило исключить потери их, особенно, очень лабильной РНК. Второй необходимой предпосылкой нашего опыта были in-house ПЦР и РТ-ПЦР тест-системы на ДНК HBV и РНК HIV и HCV, содержащие внутренние стандарты, которые необходимы для исключения ложно-отрицательных результатов NAT-тестирования и для полуколичественной оценки содержания вируса в пробе. Весьма полезной оказались и оригинальная компоновка реагентов в наших ПЦР-тест-системах, поскольку исключена необходимость их хранения в замороженном виде, и получение ПЦР-смесей в пробирке под слоем парафина для проведения ПЦР с горячим стартом. И, наконец, в процессе нашей работы по минипул-NAT-тестированию была апробирована оригинальная видеокомпьютерная установка «Шатёр» для регистрации полученных методом электрофорезной детекции продуктов ПЦР, созданная А.В. Виноградовым и соавт. (ТОО «Дельта-Тех»). Более 8 000 донаций, исследованные нами методом минипул-NAT-тестирования получены от кадровых доноров плазмы были серонегативные. Вторая группа, более 3 500 донаций, получены от первичных доноров, и ПЦР- и ИФА- тестирование проводили одновременно. В свете наших и литературных данных, частота вирусных маркеров среди первичных доноров, в среднем, на порядок выше, чем среди кадровых серонегативных доноров. Сравнение процента РНК HCV- и ДНК HBV-положительных в этих двух группах доноров показывает, что среди серонегативных доноров было 0, 023% HBV и 0,00% HCV-положительных, подтвержденных при ПЦР-тестировании индивидуальных донаций, а среди первичных доноров было 0, 076-0,09% HBV- и 0,13-0,69% HCV-положительных, подтвержденных при ПЦР-тестировании индивидуальных донаций. Важно отметить, что группа серонегативных доноров в 2,5 раза больше по численности, чем группа первичных доноров, но, тем не менее, среди неё не выявлено ни одной HCV-положительной донации. Такая низкая частота хорошо согласуется с аналогичной частотой среди серонегативных доноров по данным литературы. На СПК ФУ «Медбиоэкстрем» в инициативном плане совместно с Гепатологическим консультативным центром КЗ г. Москвы (руководитель д.м.н., проф. Н.П. Блохина) создана программа «Клинико-лабораторного исследования доноров с положительными результатами ИФА- и ПЦР- анализов на вирусные гепатиты В и С», имеющая целью изучить возможности реабилитации доноров с положительными реакциями ИФА, но отрицательными результатами ПЦР- анализа на вирусы гепатитов В и С путем комплексного изучения в динамике специфических антител, антигенов, вирусных РНК и ДНК в крови и биоптатах печени, биохимических показателей, функционального состояния печени и клинического статуса. В настоящее время начато формирование трех регистров доноров: с высокими значениями оптической плотности ИФА-анализа на антитела к HCV и HbsAg; серонегативные в ИФА, но положительные на РНК HCV и ДНК HBV; положительные как по результатам ИФА, так и по результатам ПЦР. По-видимому, лица, серопозитивные, но не содержащие самих вирусов, имеют большую вероятность благоприятных исходов инфекций HCV и HBV. Весьма интересен в этом смысле факт, что уровни АЛТ у HCV ИФА- и ПЦР-положительных доноров были достоверно, в среднем в 3 раза, выше по сравнению с донорами ИФА- позитивными, но ПЦР- отрицательными на РНК HCV (W. K. Roth et al., 2001) ВЫВОДЫ
Публикации по теме диссертации
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | эпидемиологическая характеристика внутрибольничных гепатитов в и... Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского амн украины, заведующий лабораторией вирусных гепатитов и... | | Конспект урока "Группы крови. Переливание крови. Донорство" (Тема... ... |
 | Возможности лаборатории Центра крови 1-го мгму имени И. М. Сеченова Обследование доноров: определение hbsAg, антител к вирусу гепатита С, вич, сифилису | | Городского округа красноуфимск постановление О внесении изменений в постановление главы городского округа Красноуфимск №43 от 24. 01. 2011 года «Об утверждении комплексного плана... |
| Автор: Лебедева Ольга Дмитриевна Координаты ... | | Название урока Ознакомление с окружающим миром ... |
| Название На ІІ ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным... Разработка нормативной документации, программа по элективным курсам и курсам по выбору учащихся, компьютерной базы | | Сейчас в мире, пожалуй, нет взрослого человека, который не знал бы,... Вич-инфекция захватила практически все страны. В 2004 году в мире насчитывалось около 40млн вич-инфицированных – примерно 38 млн... |
| Реферат по биологии на тему: «Вирусы» Вирусы живут пока сражаются и погибают от бездействия. Они очень прихотливы к пище, живут «взаймы» за счёт клеток животных, растений... | | Конспект урока. Учитель Филаевская Н. В. Тема урока Графы ... |
| Конспект урока биологии в 8 классе Тема урока. Внутренняя среда организма.... Сформировать представление о составе внутренней среды организма, продолжить формирование знаний о составе крови, функциях клеток... | | Урок по вич статистика и история развития эпидемии Занятие необходимо начать с постановки проблемы: с начала эпидемии спида 64 млн человек в мире были инфицированы вич, 40 млн из них... |
| Учебный модуль Профилактика вич-инфекции среди пин, лечение и социальное сопровождение с вич/спидом | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Кровь, её состав и значение в обеспечении жизнедеятельности организма. Клеточные элементы крови эритроциты, лейкоциты, тромбоциты.... |
| Программа профилактики вич-инфекции в общеобразовательном учреждении... Вич/спида образовательной среде в разработке программ по профилактике вич-инфекции следует руководствоваться принципом многоаспектности.... | | Тема: «Компьютерные вирусы. Свойства и классификация» Научиться находить компьютерные вирусы с помощью программого обеспечения «Антивирус Касперского 2011» |
