На правах рукописи
Шестернина Наталия Владимировна
Роль желатиназы как патогенетического фактора формирования экспериментальной язвы желудка
14.03.03 – патологическая физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Ростов-на-Дону
2011
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет Министерства зравоохранения и социального развития Российской Федерации»
Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент
Рогова Людмила Николаевна
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор
Кожин Александр Алексеевич
доктор биологических наук, профессор
Франциянц Елена Михайловна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится “___” _________ 2011 года в____часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.03 при ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет (344022, Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета
Автореферат разослан “_____” ___________ 2011 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета,
кандидат медицинских наук Л.А. Хаишева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Язвенная болезнь желудка относится к числу широко распространенных заболеваний, не имеет тенденции к ограничению и встречается у человека и практически у всех видов животных (Антунян В.В., 2008; Бредихина Н.А., 2008; Казимирова А.А., 2010). Распространенность язвенной болезни среди взрослого населения составляет в разных странах от 5 до 15% (в среднем 7-10%), (Ивашкин В.Т., 2006; Blaser M.J., 2005).
Общепризнано, что ведущим звеном в патогенезе язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки является нарушение равновесия между факторами агрессии и механизмами защиты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки (Кононов А.В., 2006; Фадеев П.А., 2009).
В современной концепции патогенеза язвенной болезни желудка отводится важная роль Helicobacter pylori, состоянию местного и системного иммунитета, определяющих в значительной мере противомикробную резистентность организма и течение репаративных процессов (Couturier M.R., Tasca E., 2006). Данные рандомизированных исследований показали, что рецидивы язвенной болезни желудка наступают у 5—10 % больных и после эрадикации. С одной стороны, не вызывает сомнений роль Helicobacter pylori в этиопатогенезе язвы желудка, с другой стороны, очевидна значимость факторов локальной резистентности тканей гастродуоденальной зоны (Кононов А.В., 2006; Казимирова А.А., 2010; Behera A.K., 2009).
Важную роль в механизмах локальной резистентности отводится матриксным металлопротеиназам, выполняющим двоякую функцию: дезинтеграция внеклеточного матрикса и ремоделирование поврежденных тканей.
Формирование и развитие любого деструктивно-воспалительного процесса в различных тканях, включая ткани желудочно-кишечного тракта, несомненно, происходит при участии матриксных металлопротеиназ и, в частности желатиназы В, деградирущей не только коллаген I, II типов, но и IV типа – главный элемент базальных мембран, который подвергается деструкции во время миграции лейкоцитов, участвующих в воспалении (Dass K., 2008; Fu X. 2008).
В настоящее время активно изучаются механизмы регуляции активности этих ферментов (Берк Б.С., 2006; Сухих Г.Т. 2007; Рыбко А.Р., 2008; Ганусевич И.И., 2010). В условиях in vitro выявлено активирующее влияние свободных радикалов на прометаллопротеиназы. Кроме того, реактивные формы кислорода не только активизируют прометаллопротеиназы, но и ингибируют функции многих протеазных ингибиторов, усиливая дальнейшую деградацию внеклеточного матрикса (Manuel J. A., 2006).
Высказывается предположение, что определенную роль в регуляции активности матриксных металлопротеиназ играет Mg2+. Установлено, что в условиях дефицита Mg2+ в организме развивается аномальный метаболизм соединительной ткани, связанный по мнению авторов (Трошин И.Ю., Громова О.А., 2008), с повышенным содержанием металлопротеиназ. Наряду с этим дефицит Mg2+ приводит к нарушению активности ферментов энергообразования и энергопотребления и нарушает механизмы пролиферации (Старавойтов В.А., 2009).
Анализ литературных данных показывает, что при ряде патологических процессов достаточно широко обсуждается роль матриксных металлопротеиназ, включая желатиназу В (Берк Б.С., 2006; Потеряева О.Н., 2006; Dass. K., 2008; Fu X. 2008; Wu Z.S., 2008), однако её роль в деструкции и ремоделировании язвенного дефекта желудка изучена явно недостаточно. Мало известно о механизмах регулирования её активности в зоне язвенного дефекта, в частности в условиях in vivo недостаточно изучена ингибирующая роль Mg2+ на металлопротеиназы, не изучены способы коррекции развившихся нарушений.
Цель исследования – установить закономерности нарушений магниевого баланса и интенсивности экспресии желатиназа В-позитивных клеток, механизмы её активации в тканях язвенного дефекта в период завершения формирования экспериментальной язвы желудка и разработать способы коррекции развившихся изменений.
Задачи исследования
1.Определить удельное число и интенсивность экспресии желатиназа В-позитивных клеток в тканях зоны изъязвления на фоне завершения формирования экспериментальной ацетатной язвы желудка.
2. Определить интенсивность свободнорадикального и перекисного окисления липидов, активность антиоксидантной системы в тканях язвенного дефекта, а также региональной крови и лимфе, оттекающих от тканей желудочно-кишечного тракта, и степень осмотической стойкости эритроцитов у крыс со сформировавшейся язвой желудка, и определить их взаимосвязь с интенсивностью экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в тканях язвенного дефекта.
3. Выявить нарушение баланса Mg2+,Ca2+ в жидких средах организма и определить их корреляцию с удельным числом и интенсивностью экспрессии желатиназа В – позитивными клетками в зоне изъязвления и площадью язвы.
4. Разработать патогенетический критерий риска изъязвления слизистой желудочно-кишечного тракта.
5. Оценить влияние магнийсодержащей композиции на удельное число и интенсивность желатиназа В-позитивных клеток и морфологические показатели в зоне язвенного дефекта, интенсивность пероксидации в тканях желудка и жидких средах, содержание Mg2+, Ca2+ в крови и лимфе, осмотическую стойкость эритроцитов.
Научная новизна
Впервые определено увеличение удельного числа и интенсивности экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии и в СПСО желудка (клеточный компонент) в зоне язвенного дефекта.
Определяется положительная связь между уровнем магнигистии, числом и степенью экспрессии желатиназа В-позитивных клеток В покровном эпителии и отрицательная – между числом и интенсивностью экспрессии изучаемого фермента в СПСО желудка (клеточный компонент) в исходном состоянии. Через 7 суток с момента моделирования язвенного дефекта выявляется отрицательная связь между уровнем внутриэритроцитарного магния, удельным числом, экспрессией желатиназа В-позитивными клетками СПСО желудка, последние имеют отрицательную корреляцию с площадью язвенного дефекта, с активностью КА, СОД в тканях желудка и положительную – с интенсивностью пероксидации в них.
Впервые показано, что разделение животных на группы с высокой и низкой ОСЭ в исходном состоянии сохраняется на фоне экспериментальной язвы желудка, при этом у крыс с низкой ОСЭ формируется язва большей площади.
МСК вызывает уменьшение числа и интенсивности экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии и в СПСО (клеточный компонент), содержания первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тканях, крови и лимфе и площади язвенного дефекта.
Практическая значимость
Получены новые сведения о роли желатиназы В в формировании язвенного дефекта желудка.
Показана целесообразность применения МСК для коррекции механизмов формирования язвенного дефекта желудка: применение МСК приводит к уменьшению числа и интенсивности экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии и в СПСО желудка (клеточный компонент), площади язвенного дефекта, а так же к снижению уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ в тканях, крови и лимфе.
На основании показателей ОСЭ можно прогнозировать риск изъязвления слизистой желудка. У крыс с низкой ОСЭ формируется язвенный дефект большей площади (патент № 2391666).
Положения, выносимые на защиту
1. На фоне экспериментальной ацетатной язвы желудка уменьшение содержания магния во внутриклеточном секторе сопровождается увеличением удельного числа и интенсивности экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии и в СПСО желудка (клеточный компонент), усилением пероксидации и снижением антиоксидантной защиты в тканях, крови, лимфе.
2. На фоне исходной низкой осмотической стойкости эритроцитов формируется экспериментальный дефект большей площади, что может быть использовано для прогноза риска изъязвления слизистой оболочки ЖКТ.
3. Под влиянием МСК уменьшение площади язвенного дефекта сопряжено с увеличением содержания внутриэритроцитарного магния, уменьшением удельного числа и силы экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии и в СПСО желудка (клеточный компонент), а также снижением содержания МДА и ДК, при одновременном повышении активности ферментов антиоксидантной защиты в тканях желудка и жидких средах организма.
Апробация работы
Материалы работы представлены на региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2009); открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2009, 2010, 2011); материалах 7 Научной сессии Института гастроэнтерологии и клинической фармакологии СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2010); VI международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011); ХVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011); XI съезде хирургов Российской Федерации (Волгоград, 2011); итоговой научной конференции КГМУ, Центрально-черноземного научного центра РАЕН, посвященной 76-летию Курского государственного университета (Курск, 2011).
Получен патент на изобретение №2391666: Способ прогнозирования риска изъязвления слизистой оболочки желудка / Н.В. Чемордакова, Л.Н.Рогова. Патент зарегистрирован в государственном реестре Российской Федерации 10 июня 2010 года.
Публикации
По материалам диссертационного исследования опубликовано 18 работ, в том числе 5 в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Внедрение результатов исследования
Внедрены результаты изобретения «Способ прогнозирования риска изъязвления слизистой желудка» в учебный процесс кафедр патологической физиологии Ставропольской государственной медицинской академии и Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами, 7 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, библиографического указателя, включающего в себя 184 источника литературы, в том числе 109 отечественных и 75 зарубежных, и приложения.
Материалы и методы
Работа носила экспериментальный характер. Эксперименты выполнены на 153 половозрелых белых крысах обоего пола линии Вистар массой 198±3,8 г. Животные содержались в обычных условиях вивария на стандартной диете. Все эксперименты проводились в утренние часы натощак под нембуталовым наркозом (40 мг на 1 кг массы животного) с соблюдением стандартов.
На каждом этапе исследования выполнялось по четыре серии экспериментов. В первой серии определяли изучаемые параметры в исходном состоянии, во второй (контрольная серия) выполняли те же манипуляции, что и в опытной (третья серия), но не моделировали язвенное повреждение желудка, в третьей серии моделировали экспериментальную ацетатную язву желудка, в четвертой серии моделировали ацетатную язву желудка с последующем применением МСК.
Перед включением животных в экспериментальные группы проводилась рандомизация животных по исходным показателям с целью формирования репрезентативных выборок. Первый этап исследования заключался в определении, удельного числа желатиназа В-позитивных клеток в тканях слизистой оболочки желудка, морфологических характеристик тканей желудка, а так же уровня Mg2+ в эритроцитах крови из воротной вены. На втором этапе исследования проводили определение уровня Mg2+ в эритроцитах и плазме из подключичной и портальной вены, лимфе ОКЛП в исходном состоянии и через 7 суток с момента моделирования язвы. На третьем этапе исследования проводили определение содержания МДА, ДК, активности КА, СОД в гомогенате тканей желудочно-кишечного тракта и жидких средах организма в исходном состоянии и через 7 суток с момента моделирования ацетатной язвы. На четвертом этапе исследования определяли ОСЭ из подключичной и портальной вены (таблица 1).
Таблица 1
Общая характеристика материала исследования по этапам и сериям
Этапы исследования
|
Характеристика серий
|
Количество животных
|
Определение удельного числа и активности желатиназа В-позитивных клеток в тканях желудка
|
Исходное состояние
|
6
|
Контрольная серия
|
6
|
Ацетатная язва без лечения
|
6
|
Ацетатная язва с лечением МСК
|
6
|
Определение Mg2+ в эритроцитах и плазме из подключичной и портальной вены и лимфе из ОКЛП
|
Исходное состояние
|
10
|
Контрольная серия
|
10
|
Ацетатная язва без лечения
|
10
|
Ацетатная язва с лечением МСК
|
10
|
Определение МДА, ДК, КА, СОД в эритроцитарной массе и плазме крови из подключичной и портальной вены, гомогенате слизистой оболочки желудка и лимфе из ОКЛП
|
Исходное состояние
|
23
|
Контрольная серия
|
10
|
Ацетатная язва без лечения
|
10
|
Ацетатная язва с лечением МСК
|
4
|
Определение ОСЭ из подключичной и портальной вены
|
Исходное состояние
|
10
|
Контрольная серия
|
10
|
Ацетатная язва без лечения
|
16
|
Ацетатная язва с лечением МСК
|
6
|
Экспериментальную ацетатную язву моделировали по методу S.Okabe (2005) (Okabe S. et al., 2005). Кровь забирали из подключичной, воротной вены, лимфу получали из ОКЛП путем его катетеризации.
Морфологически язвенный дефект оценивали через 7 суток с момента моделирования экспериментальной ацетатной язвы желудка. Морфологические изменения, количество клеток воспалительного инфильтрата оценивали в препаратах по визуально-аналоговой шкале (Аруин Л.И., 1998). Исследование экспрессии ММП-9, было проведено иммуногистохимическим методом по стандартной методике с использованием антител фирмы «Новокастра» ММП-9 (NCL–ММР9, для парафиновых блоков, рабочее разведение 1:40), (Кокосадзе Н.В., Заводиленко К.В., 2006; Mac C.D. et al., 1993). В препаратах при 400-кратном увеличении оценивали удельное число (в %) положительно окрашенных клеток в 5-ти случайно выбранных полях зрения (≥500 клеток). Реакция окрашивания оценивалась как негативная – 0 баллов, слабая – 1 балл, средняя (умеренная) – 2 балла и выраженная – 3 балла.
Диеновые коньюгаты определяли спектрофотометрическим методом, малоновый диальдегид – по реакции с тиобарбитуровой кислотой, активность каталазы – по методу Королюк М.А. (1988), активность супероксиддисмутазы – по реакции торможения реакции окисления кверцетина, осмотическую стойкость эритроцитов оценивали по стойкости эритроцитов в смеси с разным объёмным содержанием изотонических растворов хлористого натрия и мочевины (Камышников В.С., 2004).
Концентрацию магния в эритроцитах определяли по реакции с титановым жёлтым. Для определения концентрации магния плазмы и лимфы использовали набор фирмы «Лахема» (Чехия). Для определения концентрации кальция плазмы крови и лимфы использовали набор фирмы «Ольвекс диагностикум» (Камышников В.С., 2000).
Для коррекции магниевого баланса использовались суппозитории, содержащие природный полиминерал бишофит, суппозитории вводили per rectum в течении 7-ми дней в количестве равном 6,25 мг бишофита (Рогов В.А., 2007).
Для статистической обработки результатов исследования использовали критерий Стьюдента (средние величины выражали как М±m) и корреляционный анализ Пирсона – при нормальном распределении величин. При распределении, отличном от нормального, использовали критерий Вилкоксона (средние величины выражали как Ме [25 и 75 перцентиль]) и корреляцию по Спирмену. Проверка рядов на нормальность распределения проводилась методами Колмогорова – Смирнова, Лиллиефорса и Шапиро-Уилки. Нулевые гипотезы отвергались при достигнутом уровне значимости р<0,05 и Q<0,05 соответственно (Лапач С.Н., 2002).
|
