Результаты и обсуждение
При формировании язвенного дефекта развивается воспалительная инфильтрация, отек, образование фибриноида и грануляционной ткани, и как следствие изменяется структура тканей. Это связано с воспалительной инфильтрацией и пролиферацией клеток в СПСО и ПО (Аруин Л.И., 1998). Через 7 суток после моделирования ацетатной язвы площадь изъязвления составляла 30,95± 6,7 мм2.
Таблица 2
Показатели воспалительного инфильтрата в тканях желудка (в баллах)
(Ме [25 и 75 перцентили])
Показатели
|
СПСО
|
ПО
|
Исходное состояние
|
Контроль
|
Ацетатная язва
|
Исходное состояние
|
Контроль
|
Ацетатная язва
|
нейтрофил
|
0[0;0]
|
0,5[0;1]
|
1,5[1;2]**
|
0[0;0]
|
1[1;1]# #
|
1[1;1,75]
|
макрофаг
|
0,5[0;1]
|
0,5[0;1]
|
2[1,25;2]**
|
0,5[0;1]
|
1,5[1;2]
|
1,5[1;2]
|
лимфоцит
|
1[0,25;1]
|
1[0,25;1]
|
2[1,25;2,75]**
|
1[0,25;1]
|
1[1;1,75]
|
2[2;2]**
|
плазмоцит
|
0[0;0]
|
0[0;0]
|
1[1;1,75]
|
0[0;0]
|
0[0;0,75]
|
1[1;1]
|
эозинофил
|
1[1;1,75]
|
1[1;1,75]
|
2[1,25;2]
|
1[1;1]
|
1[1;1]
|
1,5[1;2]
|
## - р<0,05 достоверность различий показателей между исходным состоянием и контролем; ** - р<0,05 - достоверность различий показателей между контролем и ацетатной язвой.
В зоне ацетатного язвенного дефекта в СПСО и ПО выявляется лимфоцит-макрофагальный инфильтрат (таблица 2). Одновременно увеличивается число желатиназа В-позитивных клеток и интенсивность её экспрессии как в покровном эпителии, так и СПСО желудка (клеточный компонент), (таблица 3).
Таблица 3
Удельное число и интенсивность экспрессии желатиназа В-позитивных клеток при экспериментальной ацетатной язве желудка через 7 суток с момента моделирования [25 и 75 перцентили]
Показатели
|
Исходное состояние
|
Контроль
|
Ацетатная
язва
|
Покровный эпителий
|
удельное число
|
10[10;10]
|
42,5[17,5;48,75]
|
52,5[50;62,5]
|
интенсивность экспрессии
|
1,5[1;2]
|
1,5[1;2]
|
3[3;3]*
|
СПСО
(клеточный компонент)
|
удельное число
|
15[2,5;20]
|
32,5[12,5;48,75]
|
77,5[55;100]*
|
интенсивность экспрессии
|
1,5[0,25;2]
|
2[1,25;2]
|
3[3;3]*
|
*− достоверность различий показателей между контролем и ацетатной язвой (Q<0,05)
В процессе активации желатиназы В значимую роль играет эластаза лейкоцитов. Количество лейкоцитов при ацетатной язве в тканях язвенного дефекта несколько увеличивается в ПО и более значимо – в СПСО. Наибольшая активность желатиназы В обнаружена в покровном эпителии СПС желудка. Это, очевидно, связано с большей активностью эластазы, коррелирующей с числом лейкоцитов в тканях (Egeblad M., 2002; Fu X., 2008).
На фоне сформировавшейся ацетатной язвы в тканях язвенного дефекта увеличивается содержание ДК и еще в большей степени МДА при одновременном уменьшении КА (таблица 4).
Таблица 4
Содержание ДК, МДА, активность КА и СОД в тканях слизистой оболочки желудка, лимфе, эритроцитах и сыворотке крови из портальной и подключичной вены у крыс с ацетатной язвой (М±m)
Показатели
|
Исходное
состояние
|
Контроль
|
Ацетатная
язва
|
Р
|
Гомогенат
тканей
|
ДК, ед А/мл
|
0,10±0,01
|
0,13±0,0039**
|
0,16±0,01
|
<0,01
|
МДА,
мкмоль/л
|
2,95±0,28
|
3,98±0,66
|
11,7±2,5
|
<0,05
|
КА, мкатал/л
|
53,6 ±1,8
|
39,4±2,8*
|
19,42±1,5
|
<0,001
|
СОД, Ед/мл
|
131,57±3,1
|
67,005±5,9***
|
56,178±9,04
|
>0,1
|
Лимфа
|
ДК, ед А/мл
|
0,091±0,007
|
0,067±0,0016
|
0,07±0,004
|
>0,1
|
МДА, мкмоль/л
|
4,7±0,42
|
5,34±0,80
|
8,3±0,64
|
<0,01
|
КА, мкатал/л
|
12,83±1,5
|
11,95±0,29
|
4,2±0,68
|
<0,001
|
Эритроциты (портальная вена)
|
ДК, ед А/мл
|
0,039±0,005
|
0,033±0,002
|
0,047±0,006
|
<0,01
|
МДА, мкмоль/л
|
4,2±0,47
|
5,68±0,26**
|
7,6±0,76
|
<0,05
|
КА, мкатал/л
|
37,30±2,32
|
36,49±1,92
|
27,97±1,55
|
<0,05
|
СОД, Ед/мл
|
25,0±0,408
|
15,18±1,78***
|
4,669±0,717
|
<0,001
|
Эритроциты (подключичная вена)
|
ДК, ед А/мл
|
0,045±0,006
|
0,03±0,03 **
|
0,073±0,015
|
<0,05
|
МДА, мкмоль/л
|
5,28±0,51
|
5,42±0,83
|
7,12±0,75
|
<0,01
|
КА, мкатал/л
|
62,56±2,60
|
55,70±2,09
|
35,15±1,27
|
<0,001
|
СОД, Ед/мл
|
19,92±2,34
|
13,457±1,61*
|
6,46±1,96
|
<0,01
|
Сыворотка (портальная вена)
|
ДК, ед А/мл
|
0,06±0,005
|
0,065±0,014
|
0,066±0,005
|
>0,1
|
МДА, мкмоль/л
|
5,58±0,58
|
6,21±1,02
|
6,46±0,37
|
>0,1
|
СОД, Ед/мл
|
30,6±1,36
|
29,34±2,125
|
26,081±2,125
|
>0,1
|
Сыворотка (подключичная вена)
|
ДК, ед А/мл
|
0,051±0,005
|
0,053±0,015
|
0,057±0,003
|
>0,1
|
МДА, мкмоль/л
|
5,13±0,50
|
5,28±1,40
|
6,33±0,37
|
>0,1
|
СОД, Ед/мл
|
33,08±2,9
|
23,5±1,2**
|
22,8±1,946
|
>0,1
|
* - р<0,01; ** - р<0,05; ***- р<0,001 - достоверность различий показателей между исходным состоянием и контролем; Р - достоверность различий показателей между контролем и язвой.
Продукты первичной и вторичной пероксидации, очевидно, активирует желатиназу В в слизистой ЖКТ, так как активные формы кислорода выступают в качестве сигнальных молекул, запускающих каскад метаболических превращений коллагена (Kawaguchi Y., 1996; Siwik D.A., 2001; Лупач Н.М. 2010).
Выявлена прямая корреляционная связь между показателями ДК в тканях и площадью язвенного дефекта (r=0,61), а также отрицательная сильная связь между размером язвы и активностью КА (r= - 0,51).
На фоне сформировавшейся ацетатной язвы желудка интенсивность пероксидации увеличивается не только в зоне формирования и развития язвы, но и в крови.
Определено, что в эритроцитарной массе крови из воротной и подключичной вен содержание ДК и МДА значительно увеличивается на фоне язвы (таблица 4). Сопоставление интенсивности пероксидации в тканях язвенного дефекта и в эритроцитарной массе крови, полученной на фоне язвы, показывают, что ПОЛ идет наиболее активно в тканях, влияя, вероятно, на аналогичные показатели в крови. Формируется порочный круг. Пероксидация в крови влияет на пероксидацию в тканях, а в свою очередь, пероксидация в тканях влияет на пероксидацию в крови. Инициация пероксидации в крови происходит, наиболее вероятно, через лимфатическую систему. В пользу этого предположения, свидетельствует наибольшая концентрация первичных продуктов пероксидации в лимфе кишечного протока в сравнении с эритроцитарной массой, полученной из портальной вены.
Результаты корреляционного анализа показали, что площадь язвенного дефекта коррелирует с уровнем ДК в эритроцитарной массе крови из воротной вены (r= 0,64), в лимфе из ОКЛП (r=0,93). Выявлена отрицательная корреляционная зависимость между площадью язвенного дефекта и активностью КА в лимфе (r= - 0,8), СОД в крови из подключичной вены (r= - 0,6) и из воротной вены (r= - 0,85).
Известно, что свободнорадикальное и ПОЛ является универсальным повреждающим механизмом для цитоплазматических мембран, влияя на фосфолипидный состав липидного бислоя, увеличивая «текучесть» мембраны и транспорт веществ в клетку. Как вытекает из результатов проведенного нами исследования и показано в работе Болдырева А.А. с соавт. (2006) пероксидация усиливается в эритроцитарной массе крови из разных регионов, влияя в первую очередь, на мембрану эритроцитов, что отражается на ОСЭ. Эритроциты являются универсальными клетками, функциональное состояние которых отражает нарушение различных механизмов резистентности (Новицкий В.В., 2006).
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Рисунок 1. ОСЭ крови из подключичной вены в I и II группах в исходном состоянии (*− достоверность различий между показателями в I и II группах, р<0,05; ***-р<0,001).
В нашем исследовании, показано, что в исходном состоянии по величине показателей ОСЭ крови из подключичной вены экспериментальные крысы могут быть поделены на две группы: с высокой ОСЭ (I группа) и низкой (II группа), (рисунок 1). Процент гемолиза эритроцитов в исходном состоянии у крыс II группы больше чем у крыс I группы при 1-ом разведении (соотношение изотонических растворов мочевина : хлорид натрия = 2 : 3) на 75,7 % (р<0,05), при 2-ом разведении (3 : 4) – на 74,09 % (р<0,001), при 3-ем (1 : 1) – на 48,68 % (р<0,001), при 4-ом (4 : 3) – на 22,54 % (р<0,001), при 5-ом (3 : 2) – на 14,4 % (р<0,001), при 6-ом (2 : 1) – на 6,01 % (р>0,1).
У крыс I группы через 7 суток с момента моделирования язвы по отношению к исходному состоянию отмечалось снижение ОСЭ крови в 4 и 5 разведении на 16,17% и 8,69% (р<0,01, р<0,01), соответственно.
*
*
*
*
*
*
*
*
Рисунок 2. ОСЭ крови при ЭАЯ желудка в I и II группах через 7 суток с момента моделирования (*− достоверность различий между показателями в I и II группах, р<0,05; **- р<0,01; ***-р<0,001).
В I группе у экспериментальных крыс формируется язвенный дефект меньшей площади, в сравнении со II-ой, изначально с более низкой ОСЭ. Более низкая ОСЭ сохраняется при язве практически во всех разведениях, кроме второго.
Корреляционный анализ показал, что ОСЭ крови из подключичной вены зависит от концентрации ДК в 1-ом (r= 0,3), 3-ем (r=0,32), 4-ом (r= 0,31) разведениях, от содержания МДА в 1-ом (r= 0,49), 2-ом (r= 0,41), 3-ем (r=0,43), 4-ом (r=0,37), 5-ом (r= 0,38), 6-ом (r= 0,41) разведениях и от активности СОД во 2-ом (r= -0,35), 4-ом (r= -0,43), 5-ом (r= -0,46), 6-ом (r= -0,4) разведениях. Полученные результаты по изменению ОСЭ как в исходном состоянии, так и при язвенном дефекте позволяют косвенно оценить механизмы резистентности тканей ЖКТ и прогнозировать риск изъязвления тканей гастроинтестинального тракта.
Одним из факторов, влияющим на баланс между агрессивными и защитными факторами, является содержание магния в тканях и жидких средах организма (Рогова Л.Н., Старавойтов В.А., 2009). Нами было исследовано содержание внутриэритроцитарного магния и плазменного кальция из подключичной и воротной вены. В группе животных с ЭАЯ желудка на сроке 7 суток в эритроцитарной массе крови из подключичной вены концентрация магния по сравнению с контролем снизилась на 26 % (p<0,05), а плазменного кальция на 28,9% (p<0,05). В то время как в крови из воротной вены их уровень практически остался неизменным. Это, очевидно, связано с перераспределительными процессами в пользу поврежденных тканей. При сформированной ацетатной язве желудка концентрация кальция в плазме крови из подключичной вены уменьшилась на 28,99 % (р<0,001), в плазме крови из воротной вены и лимфе достоверно не изменялась. Нами был проведен корреляционный анализ взаимосвязи содержания внутриэритроцитарного магния и показателей ПОЛ и АОС. При сформированной ацетатной язве выявлена корреляционная связь уровня внутриэритроцитарного магния из подключичной вены с активностью КА (r= -0,7) и содержанием МДА (r= 0,7), а так же обнаружена корреляционная зависимость между содержанием внутриэритроцитарного магния из воротной вены с активностью КА (r= -0,91) и содержанием ДК (r= 0,48). Корреляционный анализ выявил положительную зависимость между удельным числом желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии и СПСО желудка (клеточный компонент) зоны изъязвления и площадью язвенного дефекта (r= 0,7), (r= 0,33) и интенсивностью экспрессии в желатиназа В-позитивных клеток в СПСО (клеточный компонент) (r= 0,74). Из полученных результатов следует, что гипомагнигистия выступает одним из факторов активации желатиназы В. В условиях гипомагнигистии снижается активность ферментов АОЗ, увеличивается ПОЛ, что в свою очередь влияет на изменение показателей ОСЭ, и в конечном итоге увеличивается площадь язвенного дефекта (Схема 1).
Схема 1. Роль желатиназы В в патогенезе экспериментальной язвы желудка
После применения МСК площадь изъязвления уменьшалась с 30,95±6,7 мм2 до 4,6±1,02 мм2 (p<0,001), увеличилось количество грануляционной ткани в дне язвы (Q<0,05) по сравнению с животными без коррекции.
Изменился характер клеточного состава воспалительного инфильтрата в поврежденных тканях: в СПСО желудка возрастала инфильтрация нейтрофилами до 3[3;3], макрофагами – 3[3;3] и плазмоцитами – 2,5[2;3] балла, в ПО – лимфоцитами – 3[3;3] и нейтрофилами – 2,5[2;3]. Известно, что макрофагальная реакция активирует механизмы пролиферации, а увеличение числа нейтрофилов ассоциирует с антимикробной активностью, и вызывает снижение обсемененности слизистой ЖКТ спиралевидными микроорганизмами (Иванов Л.Н. с соавт., 2005; Yang Y. H.et al., 2006).
Данные полученные Роговой Л.Н., Старавойтовым В.А.(2009), Franz K.B. (2004) показали, что применение МСК приводит к возрастанию внутриклеточного магния, калия, активности магний-зависимых ферментов. На фоне применения МСК отмечалось увеличение магния в эритроцитарной массе крови из воротной и подключичной вен по сравнению с контрольной группой животных на 18,9% (p<0,001) и 28,26% (p<0,001), соответственно. Под влиянием МСК происходит уменьшение удельного числа и интенсивности экспрессии желатиназа В-позитивных клеток как в покровном эпителии СОЖ, так и в СПСО желудка (клеточный компонент) (рисунок 3).
 138%
*
*
*
100%
*
*
*
50%
23,5%
*
*
*
% 0%
#
*
*
#
*
*
-7,69%
#
*
*
-33,3%
-76,5%
Рисунок 3. Удельное число и интенсивность экспрессии желатиназа В-позитивных клеток в покровном эпителии СПСО и клеточном компоненте стромы СПСО при ЭАЯ желудка на фоне применения МСК через 7 суток с момента моделирования
* − достоверность различий показателей при экспериментальной ацетатной язве желудка с контрольной группой Q<0,05; # − достоверность различий между показателями при экспериментальной ацетатной язве желудка и на фоне применения МСК, Q<0,05
МСК приводит к снижению пероксидации и активация ферментов АОЗ в тканях слизистой оболочки желудка, лимфе из ОКЛП, эритроцитарной массе из воротной и подключичной вен (рисунок 4).
*
*
*
*
*
*
***
**
*
***
***
***
*
**
*
%
Рисунок 4. Содержание ДК, МДА, активность КА и СОД в тканях слизистой оболочки желудка, лимфе из ОКП, гемолизате эритроцитов и сыворотке из портальной и подключичной вен крови у крыс с ацетатной язвой до и после применения МСК (*- р<0,01; ** - р<0,05; ***- р<0,001 достоверность различий показателей между ацетатной язвой и ацетатной язвой на фоне применения МСК).
Полученные результаты позволяют полагать, что МСК обладает антиоксидантным действием. Поскольку под влиянием МСК активируется пролиферация, увеличивается образование грануляционной ткани, снижаются признаки воспалительной реакции в зоне язвенного дефекта, можно предположить возможность ингибирующего влияния МСК на интенсивность липопероксидации.
Корреляционный анализ выявил прямую зависимость удельного числа и интенсивности экспрессии желатиназа В-позитивных клеток от уровня первичных и вторичных продуктов пероксидации в тканях желудка. На фоне применения МСК сохраняется разделение животных на две группы по уровню ОСЭ. Во II группе животных на фоне применения МСК ОСЭ была достоверно ниже чем у животных из I группы практически во всех разведениях, за исключением первого.
Таким образом, применение магнийсодержащей композиции приводит к уменьшению площади язвенного дефекта, увеличению объема грануляционной ткани в дне язвы, увеличению концентрации магния в клетках, снижению уровня пероксидации, активации антиоксидантных ферментов, увеличению ОСЭ и как следствие к снижению удельного числа и интенсивности экспрессии желатиназы В.
|
