Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата окситоцина в лечении гнойных ран при сахарном диабете

Скачать 415.55 Kb.

Название	Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата окситоцина в лечении гнойных ран при сахарном диабете
страница	2/3
Дата публикации	28.01.2015
Размер	415.55 Kb.
Тип	Автореферат

100-bal.ru > Право > Автореферат

1 2 3

инфицированных ран выполнялось путем введения в края раны 1 мл микробной взвеси штаммов золотистого стафилококка в дозе 2×10⁶микробных клеток и кишечной палочки в дозе 2×10⁶микробных клеток и 0,25 мл 25% раствора сульфата магния. В работе использованы музейные штаммы микроорганизмов, полученные в Институте клеточного и внеклеточного симбиоза УрО РАН (директор – член-корр. РАН, акад. РАМН Бухарин О.В.).

Сульфат магния применялся в связи с тем, что помимо микроорганизмов в развитии гнойного очага большое значение имеет наличие некротических тканей. Подобное мнение высказывали Жадинский Н.В. с соавт. (1989).

Гнойный очаг у подопытных животных возникал через 4-7 суток. Он возвышался над окружающими тканями, появлялась гиперемия, отечность кожи, симптом флюктуации.

После получения экспериментальной модели гнойно-воспалительного очага производили его хирургическую обработку в объеме, обеспечивающем удаление нежизнеспособных тканей. Оперативное вмешательство выполняли под местной новокаиновой анестезией.

Было проведено 5 серий опытов.

Первая серия опытов проводилась на 12 животных, у которых изучалось течение раневого процесса при неинфицрованных ранах без применения лечения на фоне сахарного диабета.

Во второй серии опытов на 12 животных изучалось течение раневого процесса инфицированных ран (St.aureus – 6 животных, E.coli – 6 животных), без применения лечения при сахарном диабете.

В третьей серии опытов на 12 животных изучалось течение раневого процесса инфицированных ран (St.aureus – 6 животных, E.coli – 6 животных), в лечении которых местно, путем орошения, применялся окситоцин (1,5 ЕД) на фоне сахарного диабета.

Четвертая серия опытов проводилась на 12 животных с экспериментальным сахарным диабетом и инфицированными ранами (St.aureus – 6 животных, E.coli – 6 животных), у которых изучалось течение раневого процесса при лечении антибиотиком (цефаболом).

Пятая серия опытов проводилась на 12 животных с моделью экспериментального сахарного диабета и изучалось течение раневого процесса при неинфицированных ранах, в лечении которых местно, путем орошения, применялся окситоцин (1,5 ЕД).

Все эксперименты выполнялись с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР № 775 от 12.08.1977 г. и Федеральному закону РФ « О защите животных от жестокого обращения» от 01.12.1999 г.
Методики морфологического исследования.
У подопытных животных помимо учета клинических данных, производили гистологические исследования тканей из края ран через 3, 7, 14 сут лечения, проводили исследование морфофункциональных изменений в гипоталамо-гипофизарной-адренокортикальной нейросекреторной системе (ГГАКНС) в соответствии с методиками Nachlas M.M., Seligman A.M. (1960), Gomori G. (1939).

Животных выводили из опыта путем ингаляции летальной дозы эфира. Ткани для светооптических исследований фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и спирт-формоле. Объекты исследованы на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях. Гистосрезы толщиной 6-8 мкм, изготовленные на ротационном микроскопе МПС-2, после депарафинирования окрашивали гематоксилином Майера и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон, метиловым зеленым и пиронином по Браше, перйодатом К и реактивом Шиффа по Мак-Манусу. Гистохимические реакции сопровождались соответствующими энзиматическими контролями (Пирс Э., 1962).

Для электронной микроскопии материал фиксировали в охлажденном (t-4º) 2,5% растворе глютарового альдегида на S-коллединовом буфере (рН 7,3 2 час при комнатной температуре) по методике Hayat М.А. (1989). В дальнейшем материал постфиксировали в 2% растворе четырехоксида осмия 2 час при t^°+4^°C (Millonog G., 1961), обезвоживали в ацетоне возрастающей крепости (от 50°С до 100°С) и заливали в смолу ЭПОН-812 по прописи Уикли Б. (1975). Ультратонкие срезы, изготовленные на ультратоме LKB-5 (Sweeden, Bromma), подвергали двойному контрастированию в 5% спиртовом растворе уранил-ацетата и цитрате свинца (Reynolds E.S., 1963). Просмотр срезов и фотографирование осуществляли на электронном микроскопе ЭВМ 100 АК при увеличении × 12000 до 50000.

Необходимая количественная информация получена в ходе морфометрических исследований гистологических срезов с помощью винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15^×У4.2 и окулярных сеток Автандилова Г.Г. (1990). Количественная оценка ультраструктур проводилась на электронограммах с использованием наложения на фотоотпечатки сетки Стропуса В.С. (Ягубов А.С., Кац В.А., 1984).

Для определения экспрессии проапоптотического белка р 53, выявления интрануклеосомальной фрагментации ДНК, а также для определения экспрессии антиапоптотического белка bcl-2, объекты фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина с последующей спиртовой деградацией и заливкой в парафин целлоидин. Затем серийные гистостезы (толщиной 5-6 мкм) инкубировали с соответствующими моноклональными антителами (фирма «Дако», Дания) в рабочем разведении 1:50. Для визуализации структур использовали стретавидин-биотиновый пероксидазный метод с дополнительным окрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера. Для определения внутрифазной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag Plus Peroxidaze in Situ Apoptosis Detection Kit» (фирма «Intergen», Канада). Визуализацию ядер проводили 0,5% раствором метиленового зеленого на 0,1 М ацетатном буфере. При постановке Apoptag теста ядерный хроматин клеток, вступивших в апоптоз, приобретал коричневое окрашивание. Все иммуноцитохимические реакции были проведены согласно рекомендациям Киясова А.П. (2001). Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных (иммунопозитивных) клеток, исходя из анализа не менее 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения серийных гистопрепаратов.
Цитологическая оценка динамики раневого процесса.
Для контроля за течением раневого процесса, определения его фазы, эффективности хирургической обработки раны производилось изучение цитологических отпечатков.

С этой целью на 3, 5, 7 сут эксперимента у животных II, III и IV серий выполняли отпечатки с поверхности открытой раны. Затем, после окраски препаратов азур-эозином, под микроскопом определяли клеточный состав, подсчитывая от 100 до 300 клеток в различных местах препарата в зависимости от однородности клеточного состава.

Оценка результатов цитологического исследования раневых отпечатков проводилась по пяти типовой характеристике цитограмм (Покровская М.П., Макаров М.С., 1942; Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1991):

Некротический тип – объект состоит из детрита и остатков разрушенных нейтрофилов, массивная микрофлора находится внеклеточно.
Дегенеративно-воспалительный тип – в препарате содержится большое число нейтрофилов в состоянии дегенерации и деструкции в виде кариопикноза и кариорексиса, цитолиза.
Воспалительный тип – нейтрофилы средней степени сохранности составляют 85 – 90%, а 5 – 10% клеток приходится на долю лимфоцитов и моноцитов, отдельных макрофагов и полибластов.
Воспалительно-регенераторный тип – количество нейтрофилов уменьшается до 60 – 70%, сохранность их увеличивается. 20 – 35% клеток составляют тканевые недифференцированные полибласты, фибробласты, лимфоциты, а также макрофаги, увеличение числа которых до 5 – 10 % присуще процессу очищения раны. Микрофлора наблюдается в небольшом количестве в состоянии активного фагоцитоза.
Регенераторный тип – содержание нейтрофилов составляет 40 – 50%. Резко преобладают молодые клетки грануляционной ткани, про- и фибробласты, макрофаги, эндотелий, полибласты, эпителий. Микрофлора практически отсутствует.

Таким образом, I – III типы цитограмм соответствовали первой фазе раневого процесса, IV – V типы – второй и третьей фазам.
Методы статистической обработки материала
Данные, полученные в результате исследования, были обработаны на ПК Pentium IV с помощью программного комплекса Windows XP, Word и Excel 2007 с использованием параметрических и непараметрических методов вариационной статистики. При обработке материала определяли:

- среднюю арифметическую ряда (М);

- дисперсию ряда - среднее квадратичное отклонение ();

- среднюю ошибку средней величины (m);

- критерий значимости (t) Стъюдента - Фишера для выявления существенных различий между средними величинами рядов;

- вероятность значений разницы (р), разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Приступая к изложению собственных результатов, полученных в ходе настоящего исследования, мы приводим фактический материал, касающийся морфофункциональной оценки гистологических структур вызванного раневого дефекта у крыс в условиях экспериментального аллоксанового диабета.

Аллоксановая модель сахарного диабета характеризуется прямым повреждение β-клеток поджелудочной железы крыс, сопровождающимся нарастанием глюкозы крови с первых же суток после введения аллоксана, однако у крыс возможна регенерация части островков, поэтому уровень гипергликемии у животных, в отличие от больного сахарным диабетом, носит волнообразный характер и выраженность нарушений углеводного обмена со временем уменьшается (Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Экспериментальный сахарный диабет., 1983).

Введение аллоксана приводит к появлению гипергликемии, подтвержденной нами при проведении лабораторных проб на сроке 10-й день после введения аллоксана (уровень глюкозы крови составлял 11,3±1,86 ммоль/л). Уровень глюкозы у интактных животных составлял 5,1±0,41 ммоль/л. Гипергликемия сохранялась до конца эксперимента (25 суток).
Уровень глюкозы крови у животных всех серий экспериментов на протяжении всего периода исследования остается высоким (таблица 2).
Таблица 2

№ n/n	Наименование серии опытов	Кол-во животных	Сроки наблюдения
3 сут.	Наименование серии опытов	Кол-во животных	7сут.	14сут.
I.	ЭСД, неинфицированная рана без лечения	12	4	4	4
II	ЭСД, инфицированная рана (S.aureus),без лечения	6	2	2	2
II	ЭСД, инфицированная рана (E.coli),без лечения	6	2	2	2
III.	ЭСД, инфицированная рана (S.aureus) + окситоцин	6	2	2	2
III.	ЭСД, инфицированная рана (E.coli) + окситоцин	6	2	2	2
IV.	ЭСД, инфицированная рана (S.aureus) + антибиотик	6	2	2	2
IV.	ЭСД, инфицированная рана (E.coli) + антибиотик	6	2	2	2
V.	ЭСД, неинфицированная рана + окситоцин	12	4	4	4
Всего		60	20	20	20

Сроки	Животные первой серии опытов M±m (n-12)	Животные второй серии опытов M±m (n-12)	Животные третьей серии опытов M±m (n-12)	Животные четвертой серии опытов M±m (n-12)	Животные пятой серии опытов M±m (n-12)
До нанесения раны	11,9±0,56	11,4±,52	12,1±0,89	11,8±0,64	10,9±0,91
3 сутки	11,7±0,68	13,6±0,68	9,0±0,39*	12,4±0,84	9,2±0,79**
7 сутки	11,0±0,67	13,4±0,77	8,4±0,44*	12,9±0,59	8,2±0,59**
14 сутки	10,8±0,78	12,9±0,52	7,6±0,71*	12,7±0,58	7,1±0,58**

Примечание: звездочкой (*) отмечены показатели, достоверно отличающиеся от таковых II и IV серий (без лечения и при применении антибиотика), р<0,05; двумя звездочками (**) отмечены показатели, достоверно отличающиеся от таковых I серии (без лечения), р<0,05.

В разные сроки наблюдения динамика уровня глюкозы следующая: в сериях опытов без лечения и в серии, где применялся антибиотик, наблюдается сохранение уровня гипергликемии, причем, наличие инфицирования приводит к её усугублению. Напротив, в сериях опытов, где в лечебной коррекции применялся окситоцин, отмечается достоверное снижение уровня гипергликемии. Это говорит о положительном влиянии окситоцина не только на раневой процесс, но и на оптимизацию регенераторных процессов в поджелудочной железе.

Первая серия опытов проводилась на 12 животных, у которых изучено течение раневого процесса при неинфицированных ранах без применения лечения на фоне сахарного диабета.

Без инфицирования раневой процесс в области дефекта протекал соответственно известным этапам воспаления: альтерация, экссудация, пролиферация. Однако, были отмечены морфологические признаки диабетической микроангиопатии. Это проявилось в резком утолщении базальных мембран гемокапилляров (рис. 1), возникновении в раневой области многочисленных плазморрагий с локальным повреждением эндотелия сосудов микроциркуляторного русла (рис. 2).

Рис. 1. Фрагмент раневого дефекта.3 сут (стрелкой показано утолщение базальной мембраны гемокапилляра). Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. × 40, ок. 10.

Рис. 2. Фрагмент раневого дефекта.3 сут. Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина.

Окраска: гематоксилин Майера и

эозин. Ув. об. × 40, ок. 10.

На этапе пролиферации мы регистрировали изменения эндотелия и адвентициальных клкток, завершающиеся склерозом и гиалинозом стенок кровеносных сосудов. Данные гистологических изменений являются по существу «расплатой» микроциркуляторного русла за попытку вывести недоокисленные балластные продукты обмена за пределы гемоциркуляции. Поэтому диабетическую микроангиопатию безусловно следует рассматривать как существенный компонент сахарного диабета и одно из характерных его морфофункциональных проявлений.

Описанные изменения, свидетельствующие о нарушении гемодинамики в ране, подтверждаются фактами сладжирования и микротромбоза кровеносных сосудов, ишемизации гистоструктур, кровоизлияниями и очагами дегенерации клеток и неклеточных структур с образованием выраженных экссудативных и липидных отложений.

В около раневых участках нами было установлено резкое истончение эпидермиса, атрофия дериватов кожи, значительное уменьшение эластических волокон соединительной ткани, огрубление коллагеновых фибрилл, резкое утолщение базальных мембран гемокапилляров, артериол и венул за счет отложения в них ШИК-позитивных субстратов. Существенным было резкое снижение просвета кровеносных сосудов. Всё это происходило на фоне гипертрофии ядер эндотелиоцитов и выраженной периваскулярной инфильтрации лимфоцитарными элементами и дегранулированными лаброцитами.

На седьмые сутки площадь ран уменьшается на 50-60% от размеров начальной, отмечается краевая эпителизация.

К четырнадцатым суткам происходит практически полное закрытие раневого дефекта и рост волос вокруг раны (таблица 3).

Таблица 3

Динамика площади неинфицированных ран крыс без лечения

Сроки	Раны S±s, мм² (n)
На момент нанесения раны	98,4±2,1 (n-12)
3 сутки	79,1±3,6 (n-12)
7 сутки	41,2±2,8 (n-8)
14 сутки	5,2±2,3 (n-4)

Во второй серии опытов на 12 животных изучено течение раневого процесса инфицированных ран (St.aureus – 6 животных, E.coli – 6 животных), без применения лечения при сахарном диабете.

Экзогенное инфицирование раневой области (S.aureus и особенно E. сoli) приводило к развитию нагноительных процессов, всё более приобретающих дистрофических характер (рис. 3).

Рис. 3. Участок раневой зоны, 7 сут (дополнительное инфицирование

E. сoli). Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин.

Ув. об. ×10, ок. 10.

К 3-м суткам в инфицированных ранах на фоне сахарного диабета наблюдаются выраженная гнойная инфильтрация тканей, отёк и гиперемия краев и дна раны. Отделяемое из ран гнойное, с клеточным детритом и участками некротизированных тканей (рис. 4)

К 7-м суткам происходит уменьшение явлений гнойной инфильтрации тканей, очищение раны от некротических масс, гнойного отделяемого практически нет, также отмечается уменьшение отека и гиперемии краев и стенок ран, наблюдаются начало формирования грануляционной ткани (рис.5). Тем не менее, отмечается замедление течение гнойно-воспалительного процесса, по сравнению со стандартными сроками.

На 7 сутки площадь инфицированы ран по сравнению с неинфицированными ранами составляла 79,3±1,9 мм² против 41,2±2,8 мм² (таблица 4).

Таблица 4

Динамика площади инфицированных ран крыс без применения лечения

Сроки	Раны, инфицированные S. aureus S±s, мм² (n)	Раны, инфицированные E. coli S±s, мм² (n)
На момент нанесения	99,4±2,9 (n-12)	100,1±1,8 (n-12)
3 сутки	91,1±1,6 (n-12)	91,8±1,7 (n-12)
7 сутки	79,3±1,9 (n-8)	80,2±2,0 (n-8)
14 сутки	20,2±2,1 (n-4)	19,9±2,2 (n-4)

Рис 4. Гнойная рана 3 сут
Рис 5. Гнойная рана 7 сут
Рис 6. Гнойная рана 14 сут

На 14 сутки гнойно-воспалительный процесс стихает, исчезают признаки воспаления, в частности отек и гиперемия краев раны, происходит уменьшение площади самих ран (данные представлены в таблице), выраженные явления образования грануляционной ткани, практически полностью замещается раневой дефект. Отмечается появление краевой эпителизации с частичным закрытием раневого дефекта (рис. 6).

Таким образом, заживление гнойных ран на фоне сахарного диабета характеризуется десинхронизацией фаз воспаления и регенерации, проявляющейся в пролонгировании воспалительных изменений на фоне ослабленной макрофагальной реакции и расстройств системы микроциркуляции. Одновременно происходит торможение процессов репарации, что приводит к возникновению длительно незаживающих ран.

1 2 3

	Течение беременности при сахарном диабете. Заболевания щитовидной железы и беременность		Количественная и качественная характеристика сульфатированных гликозаминогликанов... Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии...
	История изучения сахарного диабета В истории научных представлений о сахарном диабете можно выделить смену следующих парадигм.[4]		Иммунотерапия при сахарном диабете 2 типа, осложненном синдромом... Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский...
	Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с диабетической полинейропатией... Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт...		Антимикробная активность препарата Миковелт и его применение при... Терапевтические средства, применяемые при лечении больных дерматомикозами животных
	Отчет о результатах клинического исследования, проведеного по ограниченной... «Открытое исследование по изучению эффективности и переносимости препарата лома люкс псориаз, раствор для внутреннего применения...		Методическая разработка для студентов по дисциплине «Сестринское... «Сестринский процесс при сахарном диабете» подготовлена с учетом требований государственного образовательного стандарта по дисциплине...
	Клинико-лабораторное обоснование применения ортокератологических...		Клинико-морфологическое обоснование периодической гипобарической... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная...
	Отчет об экспериментальном доклиническом изучении безопасности лекарственной... «Герпезал, мазь для местного и наружного применения 1 %» производства зао «интелфарм»		Российской академии наук институт философии ран гребенщикова елена... Диссертация выполнена в секторе междисциплинарных проблем научно-технического развития Учреждения Российской Академии Наук Института...
	Бионормализующее действие препарата пдс при восстановлении воспроизводительной... Д 220. 004. 01 при фгоу впо «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 308503		Внимание! Эта книга о диабете предназначена для взрослых больных Работа выполнена при поддержке ргнф, проект 06-06-00449а «Структура и диагностика личностного потенциала»
	Рабочая программа элективного курса «Замечательные неравенства, их обоснование и применения» Федерального компонента Государственного образовательного стандарта среднего (полного) общего образования по математике на базовом...		Экспериментальное обоснование применения временныхнесъемных зубных... Для общества вопрос о знании этих социальных институтов и умении направлять их развитие имеет первостепенное значение уже потому,...

Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата окситоцина в лечении гнойных ран при сахарном диабете

№

Наименование серии опытов

Сроки наблюдения

3 сут.

7сут.

14сут.

I.

ЭСД, неинфицированная рана без лечения

II

Похожие: