Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата окситоцина в лечении гнойных ран при сахарном диабете

Стуктурно-функциональные изменения гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной системы (ГГНС) и поджелудочной железы при моделировании аллоксанового диабета у крыс, в т.ч в условиях раневой инфекции.

Светооптические исследования супроаптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса крыс, у которых мы вызывали аллоксановый диабет, показали существенные изменения нейросекреторных клеток (НСК). Этопрежде всего проявилось в возрастании числа пикноморфных элементов (рис.7).

Данные изменения наиболее рельефно прослежены у животных с нанесением раневых дефектов задних конечностей крыс и особенно при инфицировании S.aureus и E. coli. В этих случаях мы отмечали явления отека нейросекреторных центров гипоталамуса, а также дегенеративные изменения нейросекреторных элементов (рис.8).

При моделировании аллоксанового диабета, в т.ч. при формировании раневых дефектов конечностей крыс, и особенно при экзогенном инфицировании бактериальными патогенами, наблюдается феномен блокирования высвобождения нонапептидного секреторного материала (у 57-67% нейросекреторных клеток гипоталамуса крыс). (Таблица 5.).

При этом терминали аксонов данных нейроцитов имели существенные признаки ультраструктурных дегенеративных изменений (рис.9). Они проявлялись в дезинтеграции мембранных компартментов клеток, кариопикнотических изменениях, в уплотнении нейроплазмы, увеличении и сегрегации липосом, ламеллярных телец и аутофагосом.

Таблица 5

Соотношение количества пептидергических гранул к числу «пустых пузырьков» в терминалях аксонов НСК гипоталамуса (%) у крыс (М±m). Раневой процесс на фоне аллоксанового диабета (стадия 10 сут).

Интактные животные	0,78±0,09
Аллоксановый диабет (без раневого дефекта)	8,11±0,14
Аллоксановый диабет (раневой дефект)	9,88±0,61
Аллоксановый диабет (+S.aureus)	11,61±1,08
Аллоксановый диабет (+E. сoli)	14,80±1,32

Всё это свидетельствует о неблагоприятном характере структурно-функциональной реорганизации нонапептидергической нейросекреторной системы гипоталамуса, наблюдаемой в условиях аллоксанового диабета и усугубляемой раневым процессом в мягких тканях задних конечностей экспериментальных животных, особенно при инфицировании ран.

В своей совокупности эти обстоятельства, безусловно, лимитировали адаптивные возможности гипоталамического нейроэндокринного регуляторного воздействия на функциональную деятельность тканей и их репарацию. Это в свою очередь приводит к существенным ограничениям адаптивных возможностей данной регуляторной системы относительно регенераторных и пластических потенций тканей.

Морфофункциональные нарушения паренхимы и стромы поджелудочной делезы в условиях экспериментального аллоксанового диабета, проявляются в быстро наступающей дегрануляции β-клеток. Вслед за этим развиваются дегенеративные процессы, начинающиеся со сморщивания тела β-клеток и пикноза их ядер. Клетки теряют связь друг с другом, распадаются в островке беспорядочно, границы их остаются неотчетливыми, цитоплазма β-клеток вакуолизируется, нередко в ней накапливаются глыбки гликогена. Развиваются некротические процессы с распадом большей части β-клеток и превращением их в неравномерную зернистую массу. В результате сохранившиеся островки состоят преимущественно из α-клеток (рис 10).

При электронно-микроскопическом исследовании обнаружены изменения в виде уменьшения оптической плотности β-гранул. В цитоплазме многих β-клеток изменялась структура гранулярного эндоплазматического ретикулума с резким расширением цистерн канальцев и формированием вакуолей. В митохондриях развивались дегенеративные изменения с разрушением внутренней мембраны и снижением электронной плотности матрикса. Указанные изменения приводили к некрозу подавляющего числа β-клеток. Обнаруживалось значительное уменьшение количества островков поджелудочной железы.

Гистологические исследования показали, что в результате некроза тканей, кровоизлияний из разрушенных и тромбированных сосудов микроциркуляторного русла, формируется очаги лизиса ацинусов и выводных протоков, а также дефомация и разрушения островков Лангерганса (рис 11).

Наличие инфицированной раны на фоне аллоксанового диабета усугубляет состояние инсулярного аппарата. Это проявляется появлением кариопикнотических инсулиноцитов, отеком интерстициальной стромы, исчезновением базофильных инсулоцитов, небольшим количеством ацидофильных клеток, что свидетельствует о деструктивном изменении. Из данных можно сделать предположение гнойная рана мягких тканей при экспериментальном аллоксановом диабете сопрежены с прогрессивным усугублением инсулярного аппарата поджелудочной железы.

Клинико-морфологическая оценка эффективности местного применения препарата окситоцина в лечебной коррекции репарации гнойных ран у экспериментальных животных на фоне аллоксанового диабета.

В третьей серии опытов на 12 животных изучено течение раневого процесса инфицированных ран (St.aureus – 6 животных, E.coli – 6 животных), в лечении которых местно, путем орошения, применялся окситоцин (1,5 ЕД) на фоне сахарного диабета.

Динамика площади гнойных ран крыс при местном применении окситоцина представлена в таблице 6.

Таблица 6

Сроки	Раны, инфицированные S. Aureus S±s (n)	Раны, инфицированные E. Coli S±s (n)
На момент нанесения	99,9±2,4 (n-12)	99,3±1,9 (n-12)
3 сутки	82,2±1,8 (n-12)	81,9±1,5 (n-12)
7 сутки	30,3±1,7 (n-8)	31,2±1,9 (n-8)
14 сутки	0,9±0,8 (n-4)	1,2±0,7 (n-4)

К 3-м суткам в инфицированных ранах на фоне сахарного диабета при местном применении окситоцина наблюдается более выраженная лейкоцитарная и макрофагальная реакции, что приводит к более быстрому очищению раны. Гнойная инфильтрация тканей умеренная, отёк и гиперемия краев и дна раны идут на убыль. Незначительное количество гнойного отделяемого из ран. Более выраженная контракция ран по сравнению со второй серией опытов (рис. 12).

На седьмые сутки гнойное отделяемого из ран практически нет, не наблюдается выраженных признаков воспаления: отсутствует отек и гиперемия тканей, местное повышение температуры. Происходит значительное уменьшение площади ран, выраженные процессы образования грануляционной ткани и начальные явления краевой эпителизации (рис 13).

На четырнадцатые сутки при местном применении препарата окситоцина наблюдается практически полное закрытие раневого дефекта, частично область формирующегося рубца покрыта корочками, под которыми идет процесс эпителизации. Вокруг раны происходит восстановление волосяного покрова (рис 14).

Помимо фенотипического описания раневого процесса мы использовали весьма информативную методику (Гостищев В.К., Ханин А.М., 1999) применительно к цитологическому анализу реорганизации кожи (таблица 7).

При цитологическом исследовании на первые сутки в цитограммах II-IV серий опытов соотношение клеточных элементов соответствует дегенеративно-воспалительному типу фазы воспаления.
Таблица 7.

Цитологическая характеристика инфицированного раневого процесса у экспериментальных животных

Показатель,%	3 сут			7 сут
	Без лечения	Окситоцин	Антибиотик	Без лечения	Окситоцин	Антибиотик
Число лейкоцитов (абс.) в усл. полях зрения*	91,1±1,3	69,2±1,2	70,6±1,3	90,0±1,2	44,2±1,6*	60,9±1,3
Деструкция лейкоцитов %	92,1 ± 1,6	46,1 ± 2,1*	57,2 ± 2,2	70,8 ± 2,2	35,1 ± 1,8*	44,1 ± 1,9
Кариопикноз эндотелио-цитов %	33,1 ± 2,1	19,3 ± 2,0*	31,6 ± 1,9	30,1 ± 2,4	13,9 ± 1,3*	27,5 ± 1,8
Макрофаги %	2,5±1,2	10,3±0,4	9,7±0,6	2,8±0,6	14,5±1,2	12,7±2,1
Фибро-бласты %	-	11,4±2,1	10,4±1,9	-	21,1±1,4*	14,3±1,2
Плазмати-ческие клетки %	-	0,03 ± 0,01	-	-	0,07 ± 0,01	-
Эпителио-циты %	единич-ные клетки	единичные клетки	единичные клетки	единичные клетки	группы диффе-ренциро-ванных и пролифе-рирующих клеток	единичные клетки

* окулярная вставка 25 мм², об. 90, ок. 10

Примечание: звездочкой (*) отмечены показатели, достоверно отличающиеся от таковых в сериях без лечения и при применении антибиотика, р<0,05
В третьей серии опытов при местном применении препарата окситоцина на третьи сутки отмечена смена дегенеративно-воспалительного типа цитограмм на воспалительный и воспалительно-регенераторный. Цитограммы, в основном, состоят из нейтрофилов, но их количество снизилось до 69,2±1,2%, деструктивные лейкоциты при этом уменьшились до 1,5±0,6%. Неизмененные формы составили 63,0±2,5%, фагоцитоз 4,7±0,3%. В цитограммах определялись фибробласты 11,4±2,1%. Количество макрофагов составило 10,3±0,4%. На пятые сутки местного применения окситоцина преобладали цитограммы регенераторно-воспалительного типа и на седьмые сутки – в основном регенераторного типа.

Таким образом, исследуя биоптаты, изъятые из области гнойно-некротических ран задних конечностей крыс, при местном применении препарата окситоцина, мы получили существенные морфологические отличия в характере раневого процесса. При этом уменьшалась выраженность некробиотических и некротических изменений в тканях кожи, гиподермы, локализованных в гнойно-некротическом очаге. Одновременно усиливались регенераторные потенции эндотелиоцитов гемокапилляров.

Под действием препарата окситоцина уже на 3 сутки в ране происходили позитивные изменения в сторону активации пролиферативных процессов: появление клеточных элементов грануляционной ткани, умеренно инфильтрированной нейтрофильными лейкоцитами. Она отличается отсутствием выраженных зон некротического детрита, покрывающего грануляции, и существенных повреждений поверхностных слоёв раны кровоизлияниями.. При тщательном морфологическом исследование слоев грануляционной ткани отмечалось дифференцировка клеточных элементов, в частности, фибробластов, а также отмечено резкое увеличение количества лейкоцитов. В значительной мере усиливался процесс васкулогенеза. В этой фазе заживления гнойных ран отмечалось трансформация моноцитов в макрофаги, с последующим резким увеличением их количества, росло и число лаброцитов. Наличие данного факта и последующая утилизация продуктов распада обеспечивала эффективное очищение очага воспаления и последующего развития репаративных процессов эпителиальных и соединительнотканных структур.

Местное применение окситоцина в определенной степени коррегировало нарушенную (в условиях данной патологии) клеточную репродукцию (в частности, эндотелиальных элементов). Это подтверждается ростом митотической активности у эндотелиальных клеток кровеносных сосудов. Это в свою очередь приводит к усилению васкулогенеза, особенно в демаркационной зоне, где интенсивно развивается малодифференцированная (грануляционная) соединительная ткань с формированием новых петель гемокапилляров, ориентированных в различных плоскостях гистологического среза. Одновременно возрастала репродуктивная деятельность клеток фибробластического дифферона и адвентициальных клеток.

Анализ гистопрепаратов, изготовленных из участков раны задних конечностей крыс с аллоксановым диабетом и получавшим в лечебной коррекции только антибиотик, показал наличие существенных некробиотических и некротических изменений эпидермиса, его дериватов, сосочкового и сетчатого слоев дермы и подкожной жировой клетчатки. Наиболее манифестными эти изменения прослеживались среди сосудов микроциркуляторного русла и клеток соединительной ткани. В структурах артериол, гемокапилляров и артериоло-венулярных анастомозов данные изменения сводились к плазморрагическому повреждению базальных мембран, набуханию, лизису и десквамации эндотелиоцитов, что в полной мере укладывается в морфологическую картину микроангиопатии. При этом наблюдается выраженная лимфогистиоцитарная инфильтрация стенок кровеносных и лимфатических сосудов, что свидетельствовало о прогрессивном васкулите. Кроме того идентифицированы (в большом количестве) гемокапилляры, сладжированные эритроцитами и другими форменными элементами крови, а также артериолы и венулы, в просветах которых обнаруживались красные и смешанные микротромбы. Для подавляющего большинства клеток были характерны сморщивание ядер с резкой конденсацией и маргинизацией хроматина (кариопикноз), а также кариорексис и кариолизис.

В последующем наступают пролиферативные процессы клеток и тканей в соответствии с их гисто- и органобластическими возможностями. В наших исследованиях показано, что данный этап, направленный на восстановление поврежденных тканей, как правило, связан с активацией камбиальных (малодифференцированных) клеток, сопровождающейся возрастанием численности лимфоцитов, моноцитов. В очаге воспаления при этом наблюдаются клеточные дифференцировки фибробластического дифферона, увеличивается число плазмоцитов и макрофагов. Одновременно стимулируются к репаративным гистогенезам эпителиоциты, эндотелиальные клетки, лейомиоциты. При этом их последующая репродукция и вторичная функциональная дифференцировка теснейшим образом связаны с темпами дифференцировки соединительной ткани в области раны. В этой связи следует заметить, что новообразование и вторичная дифференцировка соединительнотканных элементов у исследованных животных (особенно у тех, кто в лечебной коррекции не получал окситоцин) были ограниченны и характеризовались существенными уклонениями от нормального хода гистогенеза.

Новообразование малодифференцированной (грануляционной) соединительной ткани в случае лечебного воздействия окситоцина показало реализацию более широкого и адекватного гистотипического диапазона камбиальных элементов (адвентициальных клеток, малодифференцированных фибробластов, миоэпителиальных клеток желез кожи, базальных эпителиоцитов эпидермиса) (рис. 15). В совокупности это привело к формированию отчетливых эпителиальных и сосудистых пролифератов с менее выраженной воспалительной реакцией, что предполагает более раннее и эффективное рубцевание хирургической раны.

Отмечалось и опережение процессов краевой эпителизации у животных, которым применялся окситоцин. К 7 суткам картина острого гнойно–некротического воспаления существенно уменьшалось, наблюдалась отчетливая картина формирования малодифференцированной (грануляционной) соединительной ткани (рис. 16). Она богата новообразованными гемокапиллярами, через стенки которых происходитло усиленная экстравазация плазмы и форменных элементов крови (особенно лейкоцитов). Во всех исследованных объектах эпителиальные структуры на этой стадии эксперимента находились в состоянии деструкции, некробиоза и некроза, в то время как по периферии гнойно – некротического очага формировалась соединительнотканная капсула, включающая в себя малодифференцированные фибробласты, гистоицитарные макрофаги и большое число гранулоцитов, среди которых большое преобладание нейтрофилов.

По краям раны был виден нарастающий на грануляционную ткань тонкой слой эпителия (рис. 17), в последующие дни его ширина увеличивалась. При гистологическом изучение ростовой зоны эпителия были замечены обширные очаги митотического деления камбиальных клеток, что способствует ускорению эпителизации раневых дефектов. В соединительнотканном слое увеличивалось количество коллагеновый волокон. Значительный рост фибробластов и эпителиальных клеток на 7 и 14 сутки, при применение окситоцина свидетельствуют о преобладании пролиферативных процессов, ускорение регенерации и более раннем появление эпителизации (рис. 18).

Таким образом, применение препарата окситоцина создает более благоприятные условия для последующей дифференцировки грануляционной ткани и продолжающегося новообразования кровеносных сосудов микроциркуляции, что приводит к более эффективному заживлению раневой области (рис. 19).
Рис. 19 Эпителизация раневой поверхности. Стадия: 14 сут, окситоцин. Фиксация: 10% раствор нейтрального формалина. Окраска: гематоксилин Майера и эозин. Ув. об. ×10, ок. 10.
Исследования гистологических препаратов показали, что окситоцин оказывает положительную динамику не только на кожные пролифераты, но и влияет на структуру поджелудочной железы (по сравнению с сериями опытов животных, которым применялся цефабол). Окситоцин уже на 3 сут способствует уменьшению некробиотических и некротических изменений паренхиматозных и стромальных структур органа, снижается отек, способствуя сохранности дифференцированных элементов поджелудочной железы. Окситоцин активирует пролиферацию разрушенных участков поджелудочной железы, тем самым способствуя восстановлению секреторной функции исследуемого органа.


ВЫВОДЫ

1. 
   Воспроизведена экспериментально-гистологическая модель аллоксанового диабета для изучения корригирующих репаративных эффектов воздействия окситоцина при его местном применении в условиях гнойно-некротических ран мягких тканей задних конечностей крыс.
   
2. 
   Морфологические преобразования в гнойно-некротических ранах мягких тканей задних конечностей крыс коррелировали с усугублением деструктивных изменений в инсулоцитах поджелудочной железы экспериментальных животных, что в свою очередь утяжеляло течение аллоксанового диабета (как по показателям углеводного обмена, так и по критериям оценки репаративных гистогенезов).
   
3. 
   Изменения в неинфицированных и, особенно, инфицированных ранах на фоне аллоксанового диабета коррелируют с дестабилизацией состояния гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной системы, выражающейся в разбалансировке синтеза и выведения нейрогуморальных веществ, содержащихся в нонапептидергических нейросекреторных центрах гипоталамуса (супраоптические и паравентрикулярные ядра подбугорья).
   
4. 
   Гипоталамические нонапептидергические нейрогомоны оказывают позитивное влияние в обеспечении сохранности, функциональной активности, фенотипических структурных характеристик, реализации регенераторных возможностей раневых дефектов мягких тканей, паренхимы и стромы поджелудочной железы в условиях аллоксанового диабета.
   
5. 
   Проведенные исследования обосновывают оптимизирующее влияние окситоцина на течение репаративных гистогенезов в раневых дефектах мягких тканей задних конечностей крыс (в том числе в условиях инфицирования), включая улучшение состояния инсулоцитов поджелудочной железы и показателей уровня глюкозы в крови экспериментальных животных.
   
6. 
   Светооптические, электронно-микроскопические исследования клеточных структур ран констатируют позитивную динамику (по фазам воспаления) течения репаративных процессов у животных с аллоксановым диабетом при экзогенном введении окситоцина. Это проявилось в оптимизации (улучшении) процессов васкулогенеза, развитии грануляционной (малодифференцированной) соединительной ткани и эпителизации раневых поверхностей.
   

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. 
   Синельщиков, Е.А. К вопросу о формировании экспериментальной модели сахарного диабета / Е.А. Синельщиков, // «Онкология: Актуальные проблемы»: материалы IX межобластной научно-практической конференции хирургов и онкологов. Бугуруслан, 2010. – С. 124-126.
   
2. 
   Синельщиков, Е.А. Экспериментально-морфологическое обоснование применения препарата окситоцина при оптимизации репаративных гистогенезов гнойных ран при экспериментальном сахарном диабете / Е.А. Синельщиков, А.С. Куштым // Актуальные вопросы морфологии и репаративных гистогенезов. Материалы научно-практической конференции, Оренбург, 2011. –
   С. 25-30.
   
3. 
   Синельщиков, Е.А. Течение гнойных процессов мягких тканей на фоне экспериментального сахарного диабета при местном применении окситоцина/ Е.А. Синельщиков, В.К. Есипов, С.Д. Валов // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2011 – № 4 (80). – С. 284-287.
   
4. 
   Синельщиков, Е.А. Морфофункциональное обоснование применения препарата окситоцина в лечение гнойных ран при сахарном диабете / Е.А. Синельщиков, А.С. Куштым // Вестник РГМУ. – 2011. – Спец. выпуск № 1. – С. 326-327.
   
5. 
   Влияние окситоцина на течение раневого процесса при экспериментальном сахарном диабете / В.К. Есипов, С.Д. Валов, Е.А. Синельщиков, А.С, Куштым // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. – 2011. – Вып 11. – С.14-16.
   
6. 
   Синельщиков, Е.А. Гистологическое обоснование применения препарата окситоцина в лечебной коррекции гнойных ран при сахарном диабете в эксперименте. Е.А. Синельщиков // Морфология. – 2011. – т.140. - №5. – С. 114-115.