Роль аномалий гена bcr-abl в развитии резистентности к терапии иматинибом у больных хроническим миелоидным лейкозом
Скачать 337.71 Kb.
|
| Обследованные пациенты разделены на 3 группы в зависимости от эффективности лечения иматинибом в соответствии с критериями ELN (табл.3). Первую группу составили пациенты (n=118) с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Вторую группу (n=35) – пациенты с субоптимальным ответом. Третью – пациенты (n=215) с отсутствием ответа на проводимую терапию. В свою очередь в последней группе выделены пациенты с первичной резистентностью к проводимой терапии ХМЛ иматинибом, и пациенты с вторичной резистентностью. В качестве критерия вторичной резистентности (рецидива) рассматривались утрата достигнутого цитогенетического и/или молекулярного ответа, как при оптимальном, так и субоптимальном ответах на терапию иматинибом. Таблица 3. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование
Для выявления мутаций гена BCR-ABL исследовали нуклеотидную последовательности кДНК киназного домена гена BCR-ABL по оригинальной методике с одноэтапной амплификацией. РНК выделяли из образцов крови гуанидин-тиоционат хлороформ-фенольным методом. Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор RT-Dx Kit («IPSOGEN»). Амплификация интересующего фрагмента кДНК гена BCR-ABL производилась в один этап. Для амплификации использовались: 5’BCR праймер – F – gaagtgtttcagaagcttctc и 3’ABL праймер – R – tccatgcggtagtccttctc. Амплифицировали участок длиной 1407 пн (в случае варианта b2a2 гена BCR-ABL) или 1482 пн (при варианте b3a2). Реакция выполнена в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 8 мкл очищенной воды («Sigma»), 5 мкл полученной кДНК, 4 мкл 5-кратного ПЦР-буфера (12,5мМ MgCl2), 0,3 мкл TaqF ДНК-полимераза («АмплиСенс»), 2 мкл смеси dNTP и по 0,5 мкл каждого праймера. Реакцию амплификации проводили по схеме: 94 0С, 10 мин; 45 циклов:940С – 30 сек, 640С – 30 сек, 700С – 120 сек; 700С – 5 мин. Результаты оценивались путем проведения горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле. Ампликоны кДНК BCR-ABL выделяли из геля и очищали методом сорбции на борсиликатной мембране с помощью колонок AxyPrep™ DNA Gel Extraction Kit («Axygen»). Реакцию секвенирования проводили с помощью наборов Beckman Coulter Genome Lab Method Development Kit («Beckman Coulter») и праймеров собственного дизайна. После проведения реакции, продукты ее очищались и подвергались капиллярному электрофорезу с использованием генетического анализатора Beckman Coulter CEQ-8000. Анализ нуклеотидной последовательности и поиск мутаций проводился при помощи программного обеспечении CEQ-8000 Genetic Analysis System v.6.0.75 («Beckman Coulter»). Референтная последовательность ДНК, мРНК гена ABL, а также аминокислотная последовательность ABL-тирозинкиназы получена из баз данных «The National Center for Biotechnology Information» (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (U.S.Department of Health and Human Services, http://www.nih.gov/). Для определения дополнительных копий гена BCR-ABL проводили молекулярно-цитогенетическое исследование (FISH). Для определения слитного гена BCR-ABL использовались гибридизационные пробы к локусам 9q34 (ABL) и 22q11 (BCR) Vysis® LSI® BCR/ABL Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe («Abbott»). Пробоподготовка и исследование проводилось согласно протоколу производителя. Анализу подвергались не менее 200 интерфазных ядер клеток костного мозга. При необходимости, в случае обнаружения менее 2-х ядер с искомой аномалией на 200 проанализированных, число анализируемых ядер увеличивали в 3-5 раз (до 600-1000 интерфазных ядер), с целью подтверждения наличия аберрации и уточнения величины [amp(BCR-ABL)+] клона. Процедура статистической обработки полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1 и электронных таблиц MS Excel 2007 - 2010. Расчеты выполнены в соответствии с рекомендациями О.Ю. Ребровой (2002) по обработке численных результатов экспериментов в медицине. Анализ включал определение медианы возраста, длительности терапии иматинибом, длительности предшествующей иматинибу терапии, выживаемости (общей и безрецидивной) для каждой группы наблюдения, определение частоты мутаций и амплификации гена BCR-ABL, в зависимости от фазы заболевания и вида резистентности, а также изменение указанной частоты от длительности рефрактерного течения. Методом множительных оценок Каплана-Мейра проведен анализ вероятности достижения большого, полного цитогенетического и большого молекулярного ответов в зависимости от наличия или отсутствия мутаций киназного домена гена BCR-ABL, а также в зависимости от появления дополнительных копий BCR-ABL в исследованных группах. Проведен дискриминантный анализ позволяющий выделить признаки, в наибольшей степени ответственные за различия между группами исследованных пациентов. Проверка соответствия изучаемых данных нормальному распределению проведена с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для сравнения бинарных данных использовались точный критерий Фишера и 2. Для изучения связи изучаемых показателей использовали параметрический корреляционный анализ Пирсона (r), а также непараметрические методы корреляционного анализа Спирмена (r). Исследования проводились в течение 5 лет (2007 - 2012гг.) на базе лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние мутаций киназного домена гена BCR-ABL на развитие резистентности у пациентов с ХМЛ к терапии иматинибом. Для выяснения роли мутаций гена BCR-ABL в развитии невосприимчивости к терапии ХМЛ иматинибом проведено определение нуклеотидной последовательности киназного домена гена BCR-ABL у 104 больных ХМЛ (56 мужчин и 48 женщин) с первичной и вторичной резистентностью, из которых в хронической фазе заболевания находилось 80 человек, в фазе акселерации – 24 человека. Мутации гена BCR-ABL обнаружены у 42 больных (21 – муж., 21 – жен.) из 104, что составило 40,4% от всех изученных резистентных случаев. При этом в группе пациентов находящихся в хронической фазе ХМЛ мутации киназного домена обнаружены у 28 (соотношение мужчин/женщин – 15/13) человек из 80, что составило 35,0% (рис.1).  Рис.1. Частота обнаружения мутаций у пациентов резистентных к терапии иматинибом в зависимости от фазы заболевания. В группе пациентов находящихся в фазе акселерации мутации обнаружены у 14 (соотношение мужчин/женщин – 6/8) из 24 человек – 58,3%. Выявленные различия в частоте обнаружения мутаций в разных фазах заболевания статистически достоверны (p=0.0221). Различия по полу достоверными не являются (p=0.2585) (рис.1). Среди 68 пациентов (38 мужчин и 30 женщин), не достигших к 18 месяцам полного цитогенетического ответа, что соответствует понятию первичной резистентности или рефрактерности, мутации обнаружены у 23 (13 мужчин и 10 женщин), что составляет 33,8% (рис.2). Из 36 пациентов (18 мужчин и 18 женщин) с вторичной резистентностью, которым проведено аналогичное исследование, мутации выявлены у 19 (10 мужчин и 9 женщин) (52,8%). Выявленная разница в частоте встречаемости мутаций внутри группы резистентных больных ХМЛ статистически достоверна (p=0.0317). Различия по гендерному признаку не достоверны (p=0.4276).  Рис.2. Частота обнаружения мутаций киназного домена BCR-ABL в зависимости от типа резистентности к терапии иматинибом. Среди пациентов с первичной резистентностью обнаружены 27 миссенс-мутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABLтирозинкиназы, которые являются причиной неэффективности терапии иматинибом согласно данным литературы (O’Hare T. et al., 2005): М244V/I (5), L248V (5), G250E (3), Q252E/L(2), Y253H(2), G255E/V (2), F311L (1), T315I (1), M351T(2), F359I (1), H396R (1), F401L (1), Y435C(1) (рис.3). В 6 случаях в опухолевых клетках обнаружены по 2 мутации гена BCR-ABL. Проведенный анализ показал, что большая часть мутаций находятся в локусе, кодирующем P-петлю. Так, в этом участке обнаружено 19 (70,4%) мутаций из 27 (рис.3).  Рис.3. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих P-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (IB), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у пациентов с первичной резистентностью. В структуре ABL-тирозинкиназы имеются 2 гибкие петлевые структуры – АТФ-связывающая петля (P-петля) и активационная петля (А-петля). Данные регионы характеризуются специфичным, стабилизирующим структуру белка, пространственным расположением при неактивной конформации BCR-ABL. Иматиниб действует как конкурирующий ингибитор АТФ-связывающего домена, при этом взаимодействует с киназным доменом BCR-ABL киназы, образуя контакты минимум с 21 аминокислотой. Мутации в участке гена BCR-ABL, кодирующем Р- и А- петли, дестабилизируют их расположение так, что домен киназы не может перейти в неактивную пространственную организацию, необходимую для связывания с иматинибом. Среди пациентов с вторичной резистентностью обнаружены 23 миссенс-мутаций, приводящие к заменам аминокислот в киназном домене ABL-тирозинкиназы, и 2 мутации сплайсинга, приводящие к делеции экзонов 4 и 7 ABL домена (рис. 4): G250E(6), Q252L (1), Y253H(2), E255V/K(2), L273M (1), F311L (1), T315I (2), M351T (1), F359V/I (5), H396R (2), delL184-K274 (1), delR362-A424 (1). Данные мутации согласно литературным данным являются причиной неэффективности терапии иматинибом O’Hare T., Walters D.K., Stoffregen E.P. et al., 2005). Анализ мутаций гена BCR-ABL у пациентов с ХМЛ, утративших большой или полный цитогенетический ответ, показал, что только 11 (47,8%) из 23 мутаций локализуются в локусе, кодирующем P-петлю (рис.4)  Рис.4. Схематическое изображение локализации и количества выявленных мутаций в областях гена BCR-ABL, кодирующих P-петлю (Р), иматиниб связывающий домен (IB), каталитический домен (С) и активационную петлю (А) киназного домена BCR-ABL тирозинкиназы у пациентов с вторичной резистентностью к иматинибу. При исследовании динамики выявления мутаций у резистентных к терапии иматинибом пациентов с ХМЛ обнаружено увеличение доли пациентов с мутациями от 10% на 12 месяцев терапии до 32% после 6 лет терапии иматинибом (рис.5) Для определения зависимости цитогенетического и молекулярного ответов на терапию иматинибом от наличия обнаруженных мутаций киназного домена гена BCR-ABL рассчитаны показатели кумулятивной вероятности цитогенетического (БЦгО и ПЦгО) и молекулярного (БМО) ответов на терапию иматинибом.  12 18 24 36 48 Время (мес.) Рис.5. Изменение частоты встречаемости мутаций гена BCR-ABL с течением времени при отсутствии эффекта в лечении ХМЛ иматинибом. В группе больных ХМЛ без мутаций (n=62) кумулятивная вероятность достижения на 60 месяцев терапии БЦгО составила 88,6%, ПЦгО – 81,6%, БМО – 67,9% (рис. 6).  Рис. 6. Кумулятивная вероятность достижения а. БЦгО, ПЦгО и БМО в общей группе пациентов. б. БЦгО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL. в. ПЦгО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL. г. БМО в группе пациентов с мутациями гена BCR-ABL (n=42). Случаи без мутаций – синяя линия Пациенты с мутациями BCR-ABL – красная линия. В группе пациентов, у которых при проведении молекулярно-генетических исследований обнаружены мутации киназного домена гена BCR-ABL, вероятность достижения БЦгО, ПЦгО и ПМО достоверно снижается: БЦгО на 60 месяцев терапии иматинибом составила 62,4% (p<0,0001) (рис.6б), ПЦгО – 22,6% (p<0,000001) (рис.6в), БМО – 5,9% (p<0,000001) (рис.6г). Интересно, что в группе больных ХМЛ с мутациями только у одного пациента достигнут БМО после 5 лет терапии иматинибом. У данного больного ХМЛ обнаружена мутация F311L после 24 месяцев терапии иматинибом в дозе 400 мг/сутки. Доза была повышена до 600мг/сут, а затем до 800мг/сут. В конечном итоге повышение дозы иматиниба позволило преодолеть резистентность и достичь БМО. У остальных пациентов (41 человек) снижения уровня экспрессии BCR-ABL ниже 0,1% (IS) не достигнуто. Еще более убедительные данные о неблагоприятном влиянии мутаций киназного домена гена BCR-ABL получены при сравнении вероятности достижения ПЦгО и БМО в группах резистентных пациентов с мутациями и без мутаций. Оценка влияния мутаций на цитогенетический ответ в группе резистентных больных производилась на основе анализа вероятности достижения полного цитогенетического ответа, так как ПЦгО по нашему убеждению является более строгим критерием оценки эффективности терапии, чем большой цитогенетический ответ (БЦгО). Анализ вероятности достижения ПЦгО в диапазоне от начала терапии до 24 месяцев лечения показал, что динамика достижения ПЦгО в группе резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL достоверно не различается с динамикой ответа группы пациентов без мутаций (рис. 7а). При этом в обеих группах резистентных больных вероятность достижения ПЦгО достоверно ниже, нежели в группе пациентов с оптимальным ответом на терапию иматинибом. Далее, в период от 24 до 60 месяцев в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL вероятность достижения ПЦгО повышается и начинает достоверно отличаться от аналогичного показателя группы резистентных пациентов с мутациями гена BCR-ABL. При этом вероятность достижения ПЦгО не достигает таковой у пациентов контрольной группы (различие достоверно). И наконец после 5 лет терапии вероятность достижения полного цитогенетического ответа в группе резистентных пациентов без мутаций гена BCR-ABL приближается к таковой в группе больных ХМЛ с оптимальным ответом (различие становится статистически недостоверно). При этом вероятность достижения ПЦгО в группе пациентов с мутациями киназного домена гена BCR-ABL остается стабильно низкой. Аналогичные особенности динамики наблюдались и в достижении большого молекулярного ответа. В течение первых 36 месяцев терапии иматинибом вероятность достижения БМО в группах резистентных пациентов без мутаций и с мутациями киназного домена гена BCR-ABL практически не различается, тогда как к 5 годам различие также становится значительным и статистически достоверным (рис. 7б). В данной ситуации особенно интересно, что резистентные пациенты без мутаций могут достигать БМО в более чем 50% случаев. Вероятность достижения БМО у пациентов с мутациями гена BCR-ABL в течение всего периода наблюдения остается минимальной.  Рис.7. Кумулятивная вероятность достижения ПЦгО (а) и БМО (б) у резистентных больных ХМЛ с мутациями гена BCR-ABL (красная линия), резистентных больных ХМЛ без мутаций гена BCR-ABL (красная пунктирная линия) и у больных с оптимальным ответом (синяя линия). Таким образом, наличие мутаций гена BCR-ABL достоверно снижает вероятность достижения большого и полного цитогенетического ответов, а также делает практически невозможным достижение большого молекулярного ответа. При этом обнаружены различия в вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов не только между пациентами общей группы и группы с мутациями гена BCR-ABL, но и внутри группы резистентных пациентов: с одной стороны тех, у кого выявлены мутации гена BCR-ABL, с другой – без изменений нуклеотидной последовательности онкогена. Данное обстоятельство указывает на то, что резистентность, развивающаяся вследствие мутаций гена BCR-ABL, приводит к стойкому снижению вероятности достижения цитогенетического и молекулярного ответов, в отличие от резистентности, обусловленной другими причинами. Особенно важным моментом является достоверное снижение вероятности достижения большого молекулярного ответа в случае возникновения мутаций киназного домена гена BCR-ABL, так как в настоящее время доказано, что быстрое и своевременное достижение большого молекулярного ответа – основной критерий успешного подавления опухолевого клона, и как можно более быстрое достижение БМО и ПМО является основной целью терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ. Следовательно, появление мутаций гена BCR-ABL является крайне неблагоприятным прогностическим фактором. | |||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Роль дисфункции эндотелия в развитии поражения почек у больных с... Работа выполнена на кафедре терапии медицинского факультета Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального... | | Темы рефератов для поступающих в аспирантуру по направленности «Онкология» Методы лучевой терапии злокачественных опухолей. Подготовка больных к лучевой терапии |
| Гбоу впо первый мгму им. И. М. Сеченова кафедра поликлинической терапии... Хроническая обструктивная болезнь легких (хобл). Роль участкового терапевта в тактике ведения больных с данной патологией | | Гбоу впо первый мгму им. И. М. Сеченова кафедра поликлинической терапии... Хроническая обструктивная болезнь легких (хобл). Роль участкового терапевта в тактике ведения больных с данной патологией |
| Патентам и товарным знакам (19) О л. Цитофлавин препарат патогенетической терапии туберкулеза легких // Врач. 2007. 10. С. 43-46. Бельских а. Н. Применение антиоксиданта... | | Исследование уровня эритроцитов в крови Стандарт медицинской помощи больным хроническиМ гепатитом в, ХроническиМ гепатитом с |
| Индивидуально-психологические особенности личности больных хроническим... Специальность: 19. 00. 01 – «Общая психология, психология личности, история психологии» (психологические науки) |  | Фармакогенетическое значение полиморфизмов гена β2-адренергического... Работа выполнена в гбоу впо первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России |
| Клинико-инструментальная и психологическая характеристика больных... Диссертация выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский Государственный... | | Изучение гена d-глюкуронил С5-эпимеразы как возможного гена-супрессора опухолевого роста Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) |
| Реферат по проекту рнп 2 4186 Отчет 55 с., 8 ч., 15 рис., 2 табл., 124 источников, 1 прил Ортологи гена sbr имеются у всех исследованных на этот предмет эукариот. Мутантные аллели гена | | Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных... Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии... |
| Продукция оксида азота мононуклеарами крови у больных лекарственно-чувствительным... У больных лекарственно-устойчивым тл до и после проведения курса интенсивного лечения секреция no• моноцитами крови снижалась и увеличивалась... | | Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений ... |
| Материалы xi-й международной конференции Результаты лечения больных рассеянным склерозом с нарушенными зрительными функциями методами биорезонансной терапии | | Дополнительная образовательная программа «Исследователи природы»... А наличие живого уголка, обеспечивает постоянное общение с животными, что играет огромную роль в их психо эмоциональном развитии,... |
