Министерство образования и науки Российской Федерации
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского
Национальный исследовательский университет
Гришин И.Д.
ВРЕМЯПРОЛЕТНАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С МАТРИЧНО-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИЕЙ/ ИОНИЗАЦИЕЙ ДЛЯ АНАЛИЗА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ И МЕТАЛЛООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ
Электронное учебно-методическое пособие
Нижний Новгород
2014
УДК 543.51 + 541.6 + 547.1
ББК 24.7
ВРЕМЯПРОЛЕТНАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С МАТРИЧНО-АКТИВИРОВАННОЙ ЛАЗЕРНОЙ ДЕСОРБЦИЕЙ/ ИОНИЗАЦИЕЙ ДЛЯ АНАЛИЗА ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ И МЕТАЛЛООРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ Гришин И.Д. Электронное учебно-методическое пособие. - Нижний Новгород: Нижегородский госуниверитет, 2014 - 49 с.
Рецензент: к.х.н., доцент Н.И.Машин
В настоящем учебно-методическом пособии изложены физические основы метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ). Рассмотрены возможности метода для изучения важнейших классов химических соединений: биоорганических полимеров, синтетических высокомолекулярных соединений, металлоорганических соединений и неорганических кластеров. Описаны методики работы на приборе Bruker Microflex LT, функционирующем в Нижегородском государственном университете им.Н.И.Лобачевского.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов очного и очно-заочного отделений химических факультетов высших учебных заведений, обучающихся по направлению подготовки 020100 «Химия» и специальности 020101 «Химия», а также для всех интересующихся вопросами масс-спектрометрии, биоорганической химии, химии высокомолекулярных соединений и металлоорганической химии.
УДК 543.51 + 541.6 + 547.1
ББК 24.7
Содержание
Содержание 2
Введение 3
Времяпролетная масс-спектрометрия с источником МАЛДИ 8
Влияние природы матрицы и способа приготовления образца на эффективность ионизации 13
Анализ природных макромолекул с помощью времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии 19
Применение времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии для анализа синтетических высокомолекулярных соединений 23
Определение состава и идентификация металлоорганических соединений 35
Лазерная десорбция/ионизация с поверхности металла и наноразмерных неорганических подложек 40
Практическая часть.
Масс-спектрометрический анализ соединений различного типа с использованием прибора Bruker Microflex LT 42
Мишени, используемые для проведения анализа 42
Выбор метода анализа и калибровка масс-спектрометра 43
Калибровка прибора в диапазоне до 2 кДа 45
Калибровка прибора по стандартам полиметилметакрилата 45
Исследование низкомолекулярных соединений 46
Анализ узкодисперсных образцов полимеров с молекулярной массой до 15 кДа 47
Применение метода гель-проникающей хроматографии для фракционирования и очистки полимерных образцов 47
Очистка мишени после проведения анализа 48
Литература 49
Введение
Идентификация впервые полученных соединений и точное определение их молекулярной массы является фундаментальной задачей химической науки. Развитие масс-спектрометрических методов анализа привело к существенному прогрессу как в области идентификации известных веществ, так и изучении характеристик впервые синтезированных соединений. Сегодня масс-спектрометрия в сочетании с хроматографическим разделением является важным инструментом для анализа сложных органических молекул, в том числе полимеров, лекарственных препаратов и физиологически-активных веществ, без которых невозможно представить развитие современной биохимии и медицинской химии. Масс-спектрометрический анализ долгое время было невозможно применять для исследования высокомолекулярных соединений природного и синтетического происхождения, прежде всего из-за их большой массы и, как следствие, низкой летучести, а также склонности к фрагментации при электронном ударе. Решить данную проблему позволила разработка метода матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ). Ключевой особенностью данного метода является перевод вещества в газовую фазу из конденсированного состояния под воздействием лазерного излучения, что позволяет «поднять» высокомолекулярные соединения, а также провести их «мягкую» ионизацию.
В предлагаемой учебно-методической разработке изложены основы метода масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ МС), а также особенности его применения для анализа высокомолекулярных и металлоорганических соединений. Особое внимание уделено основам проведения эксперимента на приборе “Bruker Microflex LT” (рис.1), широко используемом во многих научных и исследовательских центрах по всему миру. Данный прибор был приобретен Нижегородским государственным университетом им.Н.И.Лобачевского в рамках выполнения программы развития как Национального исследовательского университета и в настоящее время является единственным прибором такого класса в Нижегородском регионе.
Метод МАЛДИ является относительно молодым инструментальным методом исследования и получил широкое распространение лишь в последние несколько лет, благодаря появлению на рынке относительно недорогих коммерческих приборов. В то же время сегодня практически отсутствуют книги на русском языке, посвященные описанию данного метода. Данное пособие основано на материале, полученном при глубокой переработке обзорных и оригинальных статей по времяпролетной масс-спектрометрии и оригинальных результатах исследований, полученных в нашем коллективе и опубликованных в ведущих научных изданиях, в том числе за рубежом.
Целью данной разработки является ознакомить читателей с основами метода и возможностями, представляемыми МАЛДИ МС для исследования широкого круга объектов, прежде всего высокомолекулярных и металлоорганических соединений. Отдельная глава пособия посвящена применению рассматриваемого метода для анализа биополимеров и физиологически активных веществ и препаратов.
Предлагаемое пособие будет полезно как при изучении общего курса «Физические методы исследования», преподаваемом на химическом факультете, так и спецкурсов по химии нефти, химии полимеров и металлорганических соединений, преподаваемых в рамках подготовки бакалавров и магистров в соответствии с государственными образовательными стандартами 3 поколения. Материалы, приведенные в разработке, окажутся полезными для специалистов, занимающихся исследованием биологически активных веществ и препаратов.
Рис. 1. Времяпролетный МАЛДИ масс-спектрометр Bruker Microflex LT, функционирующий в Нижегородском государственном университете им. Н.И.Лобачевского
Основы метода ионизации МАЛДИ
Метод матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) был разработан и опробован для анализа природных высокомолекулярных соединений в середине 1980 годов. Независимый вклад в его развитие внесли немецкие исследователи Франц Хилленкамп и Майкл Караш, с одной стороны, и японский инженер Коити Танака, с другой.
В 1984 году Хилленкамп и Караш впервые с помощью метода МАЛДИ провели анализ мелитина - нелетучего пептида, основного компонента пчелиного яда, о чем было опубликовано в журнале Analytical Chemistry [1]. С этого момента следует отсчитывать историю термина МАЛДИ.
О важности и исключительной перспективности указанного метода идентификации соединений однозначно свидетельствует тот факт, что в 2002 году Коити Танака [2] за разработку методов анализа природных макромолекул был удостоен Нобелевской премии по химии. Наряду с Танакой лауреатами этой престижной награды стали Джон Фенн и Курт Вутрих, разработавшие методики анализа природных высокомолекулярных соединений методами масс-спектрометрии с ионизацией распылением в электрическом поле и методом ЯМР, соответственно.
В основе метода МАЛДИ лежит способность ряда органических соединений возгоняться при пониженном давлении при поглощении электромагнитного излучения видимого или ультрафиолетового диапазона высокой интенсивности. Такие вещества выполняют функцию матрицы. Источником же электромагнитного излучения является лазер, что отражено в названии метода.
Классический способ приготовления образца для масс-спектрометрического анализа заключается в растворении анализируемого вещества и матрицы в подходящем растворителе и последующей сокристаллизации указанных компонентов на металлической подложке. Для успешного проведения анализа необходимо правильно выбрать растворитель, матрицу и подобрать соотношение между матрицей и анализируемым веществом. В зависимости от природы анализируемого компонента это соотношение изменяется в пределах от 102 до 106. При этом, чем выше молекулярная масса анализируемого вещества, тем больше матрицы нужно использовать. Выбор растворителя также имеет большое влияние на результат масс-спектрометрического анализа. Очень важно, чтобы кристаллизация матрицы и анализируемого вещества проходила одновременно, сопровождаясь встраиванием молекул анализируемого вещества в кристаллы матрицы, что является необходимым условием получения хорошо разрешимого спектра.
|
Рис. 2. Схема образования ионов с помощью МАЛДИ
|
Образовавшиеся кристаллы матрицы с включенными молекулами анализируемого вещества помещаются в камеру прибора, в которой создается глубокий вакуум (порядка 10-6 бар). Как следует из названия метода, образование ионов происходит за счет воздействия на образец лазерного импульса. В процессе анализа мощный лазерный импульс, направляется в выбранную точку образца (рис.2). Молекулы матрицы поглощают излучение лазера; поглощенная энергия идет на локальный нагрев образца, что приводит к быстрому испарению матрицы. Вместе с молекулами матрицы в газовую фазу переходят и молекулы анализируемого вещества, распределенные по кристаллу. Лазерный импульс вызывает не только переход вещества в газовую фазу, но и приводит к образованию ионов из нейтральных молекул матрицы и анализируемого вещества за счет первичной ионизации. Образование заряженных частиц является необходим условием для успешного проведения любого масс-спектрометрического анализа. Для анализа высокомолекулярных соединений как природного, так и синтетического происхождения в состав образца дополнительно вводят электролиты, как правило, соли или кислоты. Образующиеся при их диссоциации ионы координируются с полимерными молекулами, образуя макромолекулярные катионы, которые регистрируются прибором. Помимо этого в газовой фазе могут протекать окислительно-восстановительные реакции между образовавшимися при испарении частицами, что ведет к образованию новых ионов. В совокупности эти протекающие в газовой фазе процессы обуславливают вторичную ионизацию.
Ионы, образовавшиеся при лазерном ударе, впоследствии разгоняются за счет приложенного электрического поля и анализируются детектором. Как правило, в МАЛДИ масс-спектрометрах применяется времяпролетный масс-анализатор, принцип работы которого изложен ниже.
При лазерном ударе и последующей ионизации происходит одновременное образование ионов обоих знаков. При этом современные приборы для МАЛДИ МС способны регистрировать как катионы, так и анионы. Выбор режима работы прибора осуществляется в зависимости от природы анализируемого объекта. Переключение между режимами достигается за счет простой смены полярности разгоняющего электрического поля.
Необходимо отметить, что МАЛДИ разрабатывался как метод мягкой ионизации для лабильных высокомолекулярных биоорганических молекул, склонных к фрагментации. При десорбции под действием лазера молекулы матрицы поглощают излучение; за счет поглощенной энергии происходит локальный разогрев и испарение вещества с частичной фрагментацией и ионизацией молекул матрицы. При этом включенные в кристалл матрицы молекулы анализируемого вещества переходят в газовую фазу без фрагментации, что позволяет фиксировать молекулярные ионы для биоорганических молекул и полимеров. Отмеченная мягкость ионизации является основным достоинством метода, определяющим область его применения.
Времяпролетная масс-спектрометрия с источником МАЛДИ
Как было отмечено выше, ионы образуются в масс-спектрометре при лазерном ударе в источнике МАЛДИ. Важной отличительной чертой рассматриваемого метода от других масс-спектрометрических методов является одновременное образование катионов и анионов и возможность их независимого анализа.
Для анализа ионов и определения значений m/z в масс-спектрометрии применяются различные типы масс-анализаторов, среди которых наиболее распространенными являются времяпролетные, квадрупольные, ионные ловушки.
В масс-спектрометрии с источником МАЛДИ чаще всего применяются времяпролетные детекторы, которые, с одной стороны, имеют достаточно простую конструкцию, а с другой стороны, хорошо совместимы с источником ионов, работающем в импульсном режиме.
|
Рис. 3. Принципиальная схема работы МАЛДИ масс-спектрометра с времяпролетным масс-анализатором.
|
На рисунке 3 приведена схема, отображающая принцип работы прибора с времяпролетным детектором. Ионы, образовавшиеся в источнике ионов, разгоняются электрическим полем и попадают в масс-анализатор. Времяпролетный масс-анализатор представляет собой трубу, в которой частицы движутся по инерции с постоянной скоростью. На одном ее конце установлен источник ионов, а на другом – детектор, фиксирующий время пролета частицы через трубу.
В основе принципа работы времяпролетного масс-анализатора лежат простые физические законы, рассматриваемые в курсе общей физики. При разгоне заряженных частиц в источнике ионов потенциальная энергия Epot электрического поля U переходит в их кинетическую энергию Ekin. При этом скорость частицы V будет обратно пропорциональна квадратному корню из ее массы m:
Epot = zeU
|
(1)
|
Ekin = 1/2mV2
|
(2)
|
zeU = 1/2mV2
|
(3)
|
V = 2zeU/m
|
(4)
|
С учетом того, что все ионы пролетают в трубе одинаковый путь L от источника до детектора, время достижения детектора t будет прямо пропорционально квадратному корню из массы:
Откуда получается, что
Таким образом, исходя из времени достижения ионом детектора, можно определить величину m/z. Данные простые физические закономерности на практике осложняются отклонениями от идеальности, различными начальными скоростями ионов, вызванными больцмановским распределением, а также задержками между моментом вылета молекулы из матрицы и началом времени разгона (так называемая задержанная экстракция ионов), необходимым для достижения лучшего разрешения. Поэтому на практике при калибровке прибора пользуются эмпирическими зависимости между временем пролета и массой, описываемыми полиномами 2-3 степени.
В качестве детектора в приборах для времяпролетной масс-спектрометрии чаще всего применяют вторичные электронные умножители либо микроканальные пластины. Принцип работы детекторов обоих типов основан на взаимодействии заряженных частиц с поверхностью электрода, сопровождающийся выбиванием из него электронов. Вылетающие с поверхности вторичные электроды разгоняются в электрическом поле, вновь соударяются с поверхностью электрода, выбивая электроны и вызывая электронную лавину, фиксируемую регистрирующим устройством. В дальнейшем зарегистрированный сигнал обрабатывается компьютером. Следует отметить существенный прогресс в области времяпролетной масс-спектрометрии с появлением высокопроизводительных компьютерных систем. Современные масс-спектрометры работают в сочетании с мощным компьютером, который успевает обрабатывать большое количество сигналов от отдельных частиц, достигающих детектора за малые промежутки времени. Это обуславливает возможность регистрации масс-спектров высокого разрешения в широком диапазоне масс молекулярных ионов.
Одним из недостатков времяпролетного детектора является низкая разрешающая способность, особенно в области высоких масс. Из уравнения 5 следует, что время пролета прямо пропорционально квадратному корню соотношения m/z. При этом с увеличением массы разница между временами достижения детектора ионами с близкими массами уменьшается, что отражается в снижении разрешающей способности. Преодолеть эту трудность и существенно улучшить разрешение спектра помогает проведение анализа в отраженном режиме.
|
Рис. 4. Принципиальная схема работы МАЛДИ масс-спектрометра с рефлектроном
|
Многие современные приборы для МАЛДИ МС оборудованы дополнительными электродами, разгоняющими частицы в противоположном направлении для их анализа в отраженном режиме. Устройство, обращающее направление движения ионов называют ионным зеркалом или рефлектроном (рис 4.) . Проведение анализа в отраженном режиме позволяет достигнуть более высокой разрешающей способности. Основным отличием прибора, способного работать в отраженном режиме, является наличие дополнительных электродов перед линейным детектором, выполняющих роль ионного зеркала. Подаваемый на них потенциал Uреф несколько превышает потенциал, разгоняющий ионы в источнике. При включенном рефлектроне ионы, достигающие конца времяпролетного детектора замедляются электростатическим полем в рефлектроне и ускоряются в противоположную сторону, после чего фиксируются детектором вторичных ионов. При выключенном рефлектроне масс-спектрометр работает в линейном режиме. При этом анализ ионов проводится при помощи детектора, установленного в конце пролетной трубы.
Применение рефлектрона позволяет преодолеть уширение сигнала, вызванное различными начальными скоростями ионов, образующихся при лазерном ударе. При воздействии лазера на кристалл матрицы со включенными в него частицами анализируемого вещества происходит их выброс с поверхности в газовую фазу. Очевидно, что в соответствии с принципом Больцмана вылетающие из массы частицы будут иметь разные кинетические энергии и начальные скорости (рис. 5). При этом два одинаковых иона достигнут детектора за разное время, что приведет к уширению сигнала в масс-спектре. Рефлектрон помогает устранить это уширение.
|
Рис.5. Распределение ионов по скоростям при лазерном ударе
|
Когда два иона, имеющие одинаковую массу, но разную начальную скорость (и как следствие кинетическую энергию) достигают рефлектрона, ионы с большей энергией проникают глубже в рефлектрон, соответственно проходят в нем больший путь и проводят там больше времени, чем ионы с меньшей энергией. В результате время достижения ионами детектора отраженных ионов с разными начальными скоростями выравнивается и в спектре наблюдается один более узкий сигнал.
Регистрация масс-спектров в отраженном режиме позволяет получать масс-спектры, характеризующиеся лучшим соотношением сигнал/шум и не содержащие сигналов, вызванных образованием нестабильных частиц. В процессе ионизации в приборе могут формироваться нестабильные ионы, которые распадаются во время разгона в источнике ионов или во время свободного полета. Эти незаряженные частицы движутся в направлении детектора, достигают его в определенный момент времени, регистрируются и интерпретируются как ионы с величиной m/z, соответствующей времени достижения сетки детектора. При этом в масс-спектре появляются соответствующие сигналы. Использование рефлектрона позволяет очистить спектр от таких сигналов. Незаряженные частицы не разгоняются рефлектроном в противоположную сторону, что обуславливает отсутствие лишних сигналов в масс-спектре. Следует отметить, что проведение анализа соединений в прямом и отраженном режимах и последующее сравнение зарегистрированных спектров, позволяет получать дополнительную информацию о строении и реакционной способности изучаемых объектов.
|
