Мишени, используемые для проведения анализа
Как отмечалось выше, пробоподготовка заключается в нанесении растворов матрицы и анализируемого вещества на подложку из нержавеющей стали с последующим помещением в прибор. На рисунке 15 изображены мишени, используемые в приборе. Для удобства нанесения пробы и последующего анализа каждая мишень условно разделена на 96 областей (8*12). Размер мишени и расстояние между точками нанесения пробы рассчитаны на использование многоканальных пипеток для проведения рутинных анализов в клинической практике.
|
|
Рис. 15. Мишени, используемые в приборе Bruker Microflex LT. Слева подложка из нержавеющей стали. Справа – подложка из полированной нержавеющей стали
|
Производителем выпускаются два типа подложек из нержавеющей стали: ground steel и polished steel. Первые представляют собой пластины с мелкими канавками, расположенными вдоль основной оси мишени. Наличие такой структуры благоприятно сказывается на росте гомогенных кристаллов матрицы и анализируемого вещества. Подложки второго типа отполированы и не имеют царапин. Подложка имеет очень ровную и гладкую поверхность за счет чего достигается образование тонких пленок образцов. Помимо этого выпускаются специальные подложки якорного типа. Их отличием является наличие гидрофильных точек, окруженных гидрофобным кольцом. Применение таких мишеней предотвращает растекание образца по всей поверхности мишени при нанесении образцов, растворенных в смесях растворителей.
Выбор метода анализа и калибровка масс-спектрометра
Времяпролетный масс-спектрометр Bruker Microflex LT может быть использован для анализа соединений с массами от 20 до 106 Да. В зависимости от природы объекта исследования, его молекулярной массы и задачи, решаемой в эксперименте, анализ производится в определенном диапазоне молекулярных масс.
Можно условно выделить четыре диапазона анализа, отличающиеся разрешением и задачами, решаемыми в экспериментах.
В области от 100 до 2000 Да удается регистрировать спектры высокого разрешения. В регистрируемых масс-спектрах отчетливо видно изотопное распределение, о котором говорилось выше. Данный диапазон полезно использовать при анализе металлоорганических и координационных соединений, полипептидов, сложных органических молекул, синтетических олигомеров. Изучение масс-спектров металлоорганических соединений позволяет зафиксировать молекулярные ионы и дать информацию о строении металлокомплексов. В случае олигомеров высокое разрешение позволяет, например, зафиксировать концевые группы, содержащие в своем составе атомы галогена.
В области от 2 до 15 кДа проводится анализ синтетических высокомолекулярных соединений с целью определения природы концевых групп. В данном диапазоне не удается различить сигналы от макрокатионов, содержащих в своем составе разные изотопы, однако разрешающей способности достаточно для отделения сигналов от макромолекул, имеющих различное число мономерных звеньев. В этом же диапазоне проводится анализ протеинов и нуклеиновых кислот.
Для регистрации масс-спектров высокомолекулярных полимерных образцов диапазоне от 10 до 100 кДа как правило требуется предварительная очистка полимера или его фракционирование методом ГПХ. Присутствие в образце низкомолекулярных примесей приводит к маскированию сигнала от целевого продукта. В зарегистрированных в этом диапазоне масс-спектрах невозможно разделить сигналы от отдельных макромолекул. Спектр проявляется в виде широкого горба.
Прибор позволяет проводить анализ масс вплоть до 106Да. Однако при расширении области анализа выше 100 кДа редко получается зарегистрировать хорошие спектры. Чаще всего в этой области проявляются сигналы от димерных макромолекул типа [2M+Na]+. Сигналы также представляют собой широкие горбы, часто с малым соотношением сигнал/шум.
Для каждого из рассматриваемых диапазонов экспериментально подобраны условия проведения анализа: напряжение ускоряющего напряжения, число выстрелов в цикле, частота импульсов лазера. В рассматриваемом приборе, как и в других современных аппаратах такого класса, реализован принцип задержки включения ускоряющего напряжения. Он заключается в наличии задержки между временем выстрела и вылетом ионов из мишени и включением разгоняющего напряжения. Это позволяет улучшить разрешающую способность прибора. При этом для каждого диапазона молекулярных масс необходимо подобрать свои значения напряжения на электродах. Данные настройки также сохраняются в настройках метода.
Для получения точных и достоверных результатов любое аналитическое оборудование требует настройки и калибровки. Для калибровки масс-спектрометров применяются определенные стандарты. Выбор стандарта зависит от диапазона работы прибора и знака анализируемых ионов. В качестве стандартов для анализа в низкомолекулярной области можно выбрать сигналы от устойчивых ионов, таких как ионы четвертичных аммонийных или фосфониевых солей. Стандартами могут выступать наборы полипептидов заданного строения. Удобным калибрантом является иодид цезия. При ионизации он образует ионы типа Cs(CsI)n+ и (CsI)nI-, по которым можно построить калибровочную зависимость в диапазоне до 2 кДа. Достоинством данного калибранта является то, что и цезий и йод имеют по одному природному изотопу, а данные кластеры дают сигналы в виде узких пиков.
Для калибровки в области от 2 до 15 к Да удобно использовать стандарты полимеров с заранее известными концевыми группами. Основной задачей при калибровке является правильное соотнесение сигналов на начальной стадии . Для этого могут помочь стандарты на основе протеинов.
Калибровку в высокомолекулярной области проводят по белковым стандартам. Белки, выбранные в качестве стандарта для калибровки, должны быть устойчивы и давать четкие сигналы.
При оптимизации условий проведения эксперимента осуществляют калибровку прибора. После этого необходимо провести оптимизацию условий анализа. Изменяя времена задержки, а также напряжения на электродах, можно добиться более высокого разрешения в требуемом диапазоне. После установки значений напряжения проводят калибровку и приступают к непосредствннному анализу образцов.
|
