Влияние природы матрицы и способа приготовления образца на эффективность ионизации
Залогом успешного проведения любого анализа является правильно проведенная пробоподготовка. В этом плане метод МАЛДИ МС не является исключением. Именно от правильного выбора матрицы, ионизирующего агента, растворителя и условий для образования кристаллов зависит разрешение спектра, полезное соотношение сигнал/шум, относительные интенсивности сигналов матрицы и анализируемого вещества.
Как было отмечено выше, основными требованиями, предъявляемыми к веществу, потенциально применимому в качестве матрицы, являются растворимость и способность поглощать излучение в диапазоне испускания лазера. Само собой, это должно быть кристаллическое вещество, способное возгоняться в вакууме. В таблице 1 приведены структуры наиболее часто используемых матриц с указанием областей их возможного применения.
К сожалению, на настоящий момент отсутствует какая-либо строгая теория, позволяющая однозначно подобрать матрицу для анализа того или иного компонента. В то же время, на основании анализа литературы можно сформулировать ряд правил и рекомендаций, позволяющих подобрать «правильную» матрицу для того или иного вещества.
Так, α-циано-4-гидроксикоричная кислота (CHCA) успешно применяется для анализа пептидов и их смесей. В то же время, для анализа протеинов обычно используется 2,5-дигидроксибензойная кислота (DHB) или ее смесь (5-10%) с 5-метокси-2-гидроксибензойной кислотой. Выбор данной системы обусловлен способностью указанного соединения образовывать большие по размеру кристаллы (порядка 10 мкм), способные включать в себя молекулы протеинов. При этом низкомолекулярные примеси практически не входят в кристаллы.
Таблица 1. Вещества, применяемые в качестве матриц в МАЛДИ МС.
Матрица
|
Английское название, сокращение
|
Структура
|
Объекты
Анализа
|
2,5-дигидрокси-бензойная кислота
|
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)
|
|
Протеины, пептиды, углеводороды, липиды, полярные синтетические полимеры
|
Синапиновая кислота
|
Sinapinic acid
|
|
Протеины, пептиды
|
α-циано-4-гидроксикоричная кислота
|
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, CHCA
|
|
Пептиды
|
3-гидрокси пиколиновая кислота
|
3-Hydroxypicolinic acid, 3-HPA
|
|
Нуклеиновые кислоты
|
п-нитроанилин
|
p-Nitroaniline (PNA)
|
|
Липиды, металлоорганические соединения
|
Дитранол
|
Dithranol, antranil, 1,8,9-Anthracenetriol
|
|
Синтетические полимеры (полистирол, полиакрилаты, полиметакрилаты)
|
3-ниндолакриловая кислота
|
3-Indoleacrylic acid, IAA
|
|
Синтетические полимеры
|
4-гидроксибензилиден малонирил
|
(4-Hydroxybenzylidene)malonitrile
|
|
Полиакрилонитрил
|
Транс-2-[3-(4-трет.бутилфенил)-2-метил-2-пропенилиден]малонитрил
|
trans-2-[3-(4-tert-Butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malononitrile, DCTB
|
|
Синтетические полимеры (полиметакрилаты, полиакрилаты,
полистирол)
|
2-(4-гидроксифенилазо)бензойная кислота
|
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid, HABA
|
|
Олигосахариды, полиэтиленгликоль
|
Графит
|
Graphite
|
C
|
Низкомолекулярные соединения, неполярные липиды, жирные кислоты
|
Другим важным критерием при выборе матрицы для эффективного проведения анализа является соотношение между ее полярностью и полярностью анализируемого компонента. Для анализа протеинов, пептидов и нуклеиновых кислот применяют матрицы, содержащие в своей структуре полярные группы, например гидроксильную или карбоксильную. Полярные матрицы предпочтительны и при анализе полярных полимеров, таких как полиэтиленгликоль, полидиметилсилоксан. Напротив, слабополярные полимеры типа полистирола или полиизопрена анализируют, используя в качестве матриц производные антрацена (дитранол) или DCTB, обладающие слабой полярностью. Близкая полярность матрицы и анализируемого полимера обуславливает сродство компонентов друг к другу и возможность включения молекул полимера в кристалл матрицы.
Стандартный метод подготовки образца для МАЛДИ МС анализа (так называемый метод высушивания капли) на первый взгляд является достаточно простым. Образец и матрица растворяются в растворителе (или смеси растворителей определенного состава) и смешиваются в пробирке или непосредственно на мишени. Объем капли, наносимой на мишень, составляет порядка 1 мкл, а ее высушивание происходит на воздухе или под действием потока холодного воздуха. В то же время при использовании в качестве растворителей высококипящих растворителей, таких как диметилформамид (ДМФА), диметилсульфоксид (ДМСО) или воды необходимо проводить дополнительную осушку образца в вакууме перед помещением в прибор.
Растворитель также играет исключительно важную роль в процессе подготовки образца для анализа. Он должен одинаково хорошо растворять как матрицу, так и анализируемое вещество. Разная растворимость компонентов приводит к их дробной кристаллизации, что является абсолютно неприемлемым для проведения анализа. При приготовлении образцов в качестве растворителей используют тетрагидрофуран, ацетон, хлористый метилен, бензол, спирт, воду и т.д.
Для успешного анализа необходимо, чтобы молекулы анализируемого вещества практически не оказывали влияния на способность молекул матрицы к кристаллизации. Это может быть достигнуто лишь при малых концентрациях анализируемого вещества относительно матрицы. Чем выше молекулярная масса анализируемого компонента, тем меньшую мольную концентрацию следует применять. Следует отметить, что высококипящие растворители, такие как ДМФА, ДМСО в ряде случаев сильно затрудняют проведение анализа, поскольку затрудняют кристаллизацию некоторых матриц, встраиваясь в их кристаллическую решетку.
Следует отметить, что, несмотря на кажущуюся простоту рассматриваемого метода пробоподготовки, регистрация хорошо разрешимого спектра в ряде случае является трудоемкой задачей, решение которой зависит от многих факторов, в том числе таких как концентрация растворов, температура помещения, влажность, наличие примесей в растворителе и образце, качество поверхности используемой подложки. Иногда даже микроскопические примеси, присутствующие в образце, могут оказывать существенное влияние на процесс кристаллизации матрицы и, как следствие, на конечный вид спектра.
При анализе могут возникнуть проблемы, связанные с невозможностью подбора растворителя, одинаково хорошо растворяющего матрицу и анализируемое вещество. Выйти из подобной ситуации позволяет использование разных растворителей для матрицы и анализируемого вещества в сочетании с послойным нанесением компонентов.
Растворы матрицы и анализируемого вещества могут наноситься на подложку последовательно. При этом сначала на пластину наносят раствор матрицы и дожидаются испарения растворителя. После этого наносят раствор анализируемого вещества, после чего пластинку вновь сушат. При таком подходе растворитель частично растворяет верхний слой кристаллов матрицы, а на пластинке образуются кристаллы разных размеров с разным содержанием исследуемого компонента. Сложность анализа при таком подходе заключается в необходимости поиска на мишени точки, при анализе которой достигается получение спектров с лучшим разрешением и более высокой интенсивностью полезного сигнала.
Нерастворимые соединения также могут быть проанализированы методом МАЛДИ МС. В настоящее время разработаны методы твердофазного приготовления образцов. На этапе пробоподготовки матрица механически смешивается с твердым образцом в ступке или шаровой мельнице. Полученная смесь растирается по подложке и анализируется обычным образом. Таким образом были зарегистрированы масс-спектры для полимеров с массой порядка 30кДа. Интересно, что спектры с хорошим разрешением получаются даже, несмотря на то, что молекулы анализируемого вещества не включены внутрь кристаллов матрицы, а физически адсорбированы на их границе. Недостатком данного метода является более слабое разрешение и высокий уровень шума по сравнению с растворным способом. Кроме того для приготовления образца требуется большее количество матрицы, что приводит к удорожанию анализа.
Нами в рамках совместных исследований с коллегами из Института металлоорганической химии им.Г.А.Разувеаева Российской Академии наук разработан новый оригинальный метод приготовления образцов для МАЛДИ. В частности, впервые применен метод напыления матрицы и анализируемого вещества на подложку в вакууме. Применение данного метода позволило провести масс-спектрометрический анализ нерастворимых комплексов редкоземельных элементов, являющихся перспективными материалами для фотоизлучающих устройств.
Анализ природных макромолекул с помощью времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии
Основным применением, для которого был изначально разработан метод МАЛДИ МС, является анализ высокомолекулярных соединений природного происхождения, в том числе белковых молекул. Мягкая ионизация позволяет анализировать высокомолекулярные продукты без фрагментации и напрямую определять точные значения молекулярной массы биополимеров и проводить их идентификацию. Такие анализы стали рутинными в ведущих медицинских и научных центрах и широко используются при разработке новых лекарственных препаратов, исследовании микроорганизмов и вирусов, лечении различных заболеваний. Важность и актуальность данного направления не вызывает вопросов. Достаточно лишь сказать, что за вклад в разработку методов анализа природных макромолекул методом МАЛДИ Коити Танака получил Нобелевскую премию по химии в 2002 году. В настоящее время метод МАЛДИ успешно используется для анализа всех основных классов биополимеров: пептидов, белков, нуклеиновых кислот, липидов и полисахаридов.
Белковые молекулы являются важнейшими компонентами всех живых организмов, начиная от бактерий и заканчивая млекопитающими. Неслучайно Ф.Энгельс определил жизнь как «способ существования белковых тел». Сегодня уникальные свойства белковых молекул используются человеком во многих сферах его деятельности. Это, прежде всего лекарственные препараты, катализаторы процессов в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, производстве волокон и биотоплив. Уникальным свойством белковых макромолекул является четкая структура, определяющая функционирование молекулы. Сложные макромолекулярные структуры белков создаются в организме и характеризуются строгой последовательностью аминокислот и их взаимным расположением в пространстве. При этом для полной потери функциональности молекулы достаточно удаления или замены одного из сотен атомов, образующих молекулу. Изучение структуры белковых молекул очень важно и для понимания процессов, протекающих в живых организмах.
Масс-спектрометрия является важным и ценным инструментом для анализа белковых молекул, поскольку дает возможность определять молекулярные массы природных макромолекул – одну из их фундаментальных величин, определяющих их свойства. Для анализа методом масс-спектрометри биомакромолекулы должны быть переведены в газовую фазу и ионизированы. При этом ионизация должна проходить в мягких условиях и исключать фрагментацию. В настоящее время для этих целей используют два метода генерации ионов: МАЛДИ и ионизацию электроспреем, отличающиеся малой фрагментацией и возможностью обозревать молекулярные ионы.
Перед анализом важно очистить анализируемый белок от примесных компонентов, что достигается методами хроматографии. Необходимо отметить, что в настоящее время разработаны устройства, позволяющие совместить МАЛДИ масс-спектрометр с жидкостным хроматографом, что позволяет проводить определение белков в их смесях в режиме рутинных анализов.
В качестве матриц для анализа белковых молекул чаще всего используют DHB, SA, HCCA, растворяя их в ацетонитриле. Для формирования положительно заряженных ионов к анализируемому веществу обычно добавляют разбавленный раствор трифторуксусной кислоты, выступающей источником протонов. Приготовление образцов чаще всего проводят методом высушивания капли на воздухе.
Важной задачей биохимии, решаемой с помощью метода масс-спектрометрии с источником МАЛДИ, является установление первичной структуры белков. Для этого на первой стадии проводится анализ исходного белка с определением его молекулярной массы. Затем проводится частичный гидролиз пептидных связей, приводящий к образованию смеси пептидов. Полученная смесь подвергается хроматографическому анализу и разделению, а также масс-спектрометрическому анализу. Применение различных реагентов для гидролиза позволяет получать разные смеси пептидов, получающиеся при разрыве различных связей. Анализ полученных масс-спектрометрических и хроматографических данных позволяет получать важную информацию о строении белковых молекул. При анализе строения белковых молекул активно используются базы данных, содержащие информацию о строении различных полипептидов и их значениях m/z. Зарегистрированные масс-спектры высокого разрешения с определенным изотопным распределением позволяют проводить однозначную идентификацию полипептидов. Анализ белковых молекул методом МАЛДИ активно применяется в клинической практике для диагностики различных заболеваний или анализа эффективности выбранного курса лечения.
Другим важным классом биомакромолекул, активно исследуемым с помощью метода МАЛДИ являются нуклеиновые кислоты (НК). Основной сложностью при анализе НК методом МАЛДИ является то, что они заряжены и являются полианионами в растворе. При встраивании в кристалл матрицы соответствующие анионы нейтрализуются протонами, четвертичными аммониевыми катионами, катионами натрия и калия. Это приводит к появлению серии различных сигналов в зависимости от природы связанных катионов (рис. 6.). Другой проблемой является фрагментация макромолекул, протекающая за счет потери основания, входящего в состав НК (как правило, аденина, цитозина или гуанина).
|
Рис. 6. Масс-спектр полинуклеотида ДНК из 12 звеньев, зарегистрированный в режиме фиксации анионов. В спектре видны сигналы от макромолекул с различным числом катионов калия, натрия и водорода, связанных с фосфатным скелетом.
|
Практика показывает, что только две матрицы из десятков, применяемых в МАЛДИ МС могут эффективно использоваться для анализа нуклеиновых кислот. Так, 3-гидроксипиколиновая кислота является наиболее удобной матрицей для анализа ДНК, тогда как для РНК эффективными являются смесь 2,3,4- и 2,4,6-тригидроксиацетофенонов, либо та же 3-гидоксипиколиновая кислота.
Следует отметить, что из-за наличия отмеченных ограничений в случае НК предельные величины определяемых масс соответствуют 25 кДа, тогда как для белков это показатель достигает 500 кДа. Тем не менее, МАЛДИ МС является важным инструментом для исследователей, работающих в области генетики и геномики.
Масс-спектроскопия МАЛДИ успешно применяется и в химии гликопротеинов – природных макромолекул, представляющих собой аддукты полисахаридов к белкам и пептидам. Данные соединения играют важную роль в биохимических процессах, протекающих в организме. К классу гликопротеинов относятся многие гормоны, антитела, белки плазмы крови и так далее. Введение фрагментов полисахаридов в белковую молекулу сильно изменяет ее свойства в зависимости от природы полисахарида. Исходные гликопротеины редко анализируются в исходном виде из-за их гетерогенности, вызванной различным составом углеводной части. Как правило, анализу подвергаются не сами гликопротеины, а полисахариды, полученные при их гидролизе. Идентификация полисахаридов позволяет сделать вывод о биохимических процессах, протекающих в организме и, как следствие, диагностировать заболевания.
Еще одним важным классом высокомолекулярных органических соединений природного происхождения являются липиды. Простейшими липидами являются жиры – сложные эфиры, образованные высшими карбоновыми (или жирнми) кислотами и глицерином. Масс-спетрометриия МАЛДИ успешно применяется для определения молекулярных масс различных липидов. Основной трудностью при этом является то, что природные липиды присутствуют в организме в виде смесей и их анализу должно предшествовать разделение. Эффективным методом является сочетание масс-спектрометрии МАЛДИ с методом тонкослойной хроматографии.
Важной областью применения масс-спектрометрии МАЛДИ является фармакология. Современные лекарственные препараты являются большими молекулами, являющимися синтетическими аналогами или производными природных соединений: порфиринов, алкалоидов, стероидов, терпенов и т.д. Масс-спектрометрия является одним из наиболее эффективных и надежных методов их идентификации.
Метод масс-спектрометрии с источником МАЛДИ является мощным инструментом для медиков и биохимиков, позволяющим определять молекулярные массы природных соединений и физиологически активных веществ, проводить их исследование и идентификацию. Современные приборы для проведения анализов являются коммерчески доступными, удобными и простыми в использовании и обслуживании, что сделало возможным их применение для рутинных анализов во многих биохимических лабораториях мира.
Применение времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрии для анализа синтетических высокомолекулярных соединений
Появление в 20-м веке синтетических полимерных материалов сильно изменило жизнь человечества. Созданные человеком полимеры обладают свойствами, превосходящими свойства известных с древних времен природных материалов, а большая доступность и низкая стоимость делает их применимыми в различных сферах человеческой деятельности. Развитие современной синтетической химии высокомолекулярных соединений тесно связано с изучением зависимостей между строением макромолекул и свойствами образуемых ими материалов, в связи с чем разработка методов детального их изучения является чрезвычайно актуальной задачей. Современный арсенал методов исследования полимеров включает разнообразные хроматографические, спектроскопические и масс-спектрометрические методы. При этом совместное применение ряда методов позволяет получать гораздо больше ценной информации, чем их отдельное использование. Метод МАЛДИ МС преимущественно используется для анализа гомополимеров, хотя в некоторых случаях полученная с его помощью информация может дать важную информации при исследовании блок-сополимеров или привитых сополимеров.
В отличие от низкомолекулярных веществ и многих природных соединений (например, белков) синтетические полимеры не являются индивидуальными соединениями. Макромолекулы, образующие полимерный образец, могут отличаться друг от друга как числом мономерных звеньев, так и иметь различные концевые группы. При проведении радикальной полимеризации обрыв цепи может происходить несколькими способами: за счет реакций димеризации и рекомбинации, при реакции с ингибитором, а также при передаче цепи на растворитель, мономер или дополнительно вводимый агент передачи цепи. Макромолекулы, образовавшиеся при протекании данных реакций будут иметь разные группы в голове и хвосте, а следовательно, и давать сигнал в масс-спектре при разных значениях m/z. Масс-спектр любого гомополимера представляет собой набор из одной или нескольких серий линий, отстоящих друг от друга на величину, соответствующую массе мономерного звена (рис. 7).
Анализ масс-спектра позволяет получить ценную информацию о полимере. Расстояние между соседними линиями равно молекулярной массе мономерного звена и позволяет определить природу полимера, однозначно провести его идентификацию. В свою очередь число независимых серий определяет количество возможных наборов концевых групп. При рассмотрении приведенного на рисунке 7 масс-спектра полиметилметакрилата отчетливо видны две серии пиков. Расстояние между соседними сигналами одной серии составляет 100 Да, что соответствует молярной массе метилметакрилата. Сигналы, составляющие каждую из двух серий, соответствуют макромолекулам, имеющим одинаковые концевые группы, но отличающимся количеством звеньев мономера. Наличие двух серий обусловлено различным механизмом обрыва цепей при полимеризации, вызванным особенностями используемой системы.
Информация, получаемая из масс-спектра, полезна при анализе механизма полимеризации, изучении стадий инициирования, переноса и обрыва цепи. Знание абсолютных значений молекулярных масс макрокатионов позволяет сделать вывод о природе концевых групп. В совокупности со сведениями об условиях проведения полимеризации эти значения позволяют установить строение концевых групп, что важно как при выяснении механизма полимеризации, так и для оценки протекания полимераналогичных превращений.
|
Рис. 7. Масс-спектр полиметилметкарилата, показывающий наличие разных концевых групп в образце.
|
Современное оборудование позволяет регистрировать масс-спектры полимеров с молекулярной массой от 100 до 106 Да. Однако необходимо учитывать, что спектры высокого разрешения, позволяющие увидеть сигналы от отдельных макромолекул, наблюдаются в области до 20 кДа.
Анализ блок-сополимеров осложняется наличием в макромолекулах звеньев двух различных мономеров, имеющих разное значение молекулярной массы. Это приводит к большому числу линий в спектре, их перекрыванию и наложению. В то же время хорошо разрешенные масс-спектры могут быть зарегистрированы для блок-сополимеров с массой до 5 кДа. Анализ спектров такого типа позволят сделать вывод о составе сополимеров.
Возможность исследования полимера методом времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ зависит от его природы, в частности от полярности и растворимости. Как отмечалось выше, масс-спектрометрический анализ основан на регистрации заряженных частиц. В МАЛДИ образование ионов чаще всего происходит при присоединении катиона к макромолекуле. Если для рассмотренных выше макромолекул природного происхождения характерно присоединение протона, то синтетические полимеры более склонны к присоединению катионов металла. Полимеры различной природы имеют различное сродство к катионам. Сильно полярные полимеры типа полиакриловой кислоты или полиэтиленгликоля легко присоединяют ионы K+ и Na+. Иногда катионизация происходит настолько легко, что для ее протекания достаточно ионов, содержащихся в качестве примесей в растворителях или присутствующих на поверхности стекла. В случае анализа менее полярных полимеров типа полиэфиров, полиамидов, полиакрилатов при подготовке образца специально добавляют соли соответствующих щелочных металлов, например, в виде иодидов или трифторацетатов. Для полимеров, содержащих в своей структуре ароматические кольца или двойные связи, характерно образование комплексов с более объемными и мягкими катионами серебра и меди. Анализ образов полистирола или полиизопрена успешно проводится при дбавлении растворов трифторацетата или ацетилацетоната серебра.
Роль катионов металла заключается в их координации с молекулой полимера, приводящей к образованию заряженных макрокатионов, подвергающихся анализу в приборе, поэтому важно, чтобы катион имел хорошее сродство к функциональным группам, присутствующим в макромолекуле. Отличием полиолефинов (полиэтилен, полипропилен) от других типов полимеров является отсутствие в их структуре полярных групп, способных к координации с катионами. По этой причине указанные полимеры фактически не могут быть проанализированы методом МАЛДИ МС. Вариантом решения указанной проблемы является предварительная химическая модификация полимеров с введением с их структуру полярных групп типа P(C6H5)3+ или N(Alk)3+ с последующим анализом.
Вопрос о выборе правильного ионизирующего агента тесно связан с выбором соответствующей матрицы для анализа. Выбор правильной матрицы для анализа образца сильно влияет на вид спектра и его интенсивность. В таблице 2 приведен список наиболее часто применяемых матриц для анализа широко распространенных полимеров [3].
Выбор подходящего растворителя также является важной задачей. Растворитель должен обеспечить сокристаллизацию полимера и матрицы. Необходимо, чтобы большие по размеру молекулы полимера органично встраивались в кристаллы матрицы. Только в этом случае получается хорошо разрешимый спектр, несущий ценную информацию.
Для успешного проведения анализа и получения масс-спектра с высоким разрешением полимер должен иметь узкое молекулярно-массовое распределение. Коэффициент полидисперсности не должен превышать величины 1.3. При более высоких значениях коэффициента регистрируемый масс-спектр имеет завышенную интенсивность сигнала в области низких молекулярных масс. На основании таких масс-спектров можно сделать вывод о природе полимера, строении его концевых групп. В то же время информация о молекулярно-массовом распределении может быть искажена.
Молекулярно-массовое распределение полимеров, определенное методом МАЛДИ масс-спектрометрии, как правило, отличается от результатов, полученных методом ГПХ. Чем выше коэффициент полидисперсности образца, тем выше это отличие. Одной из причин наблюдаемой дискриминации по массам является неудачно выбранные условия подготовки образца (неправильно подобранные матрица, растворитель или ионизирующий агент). Другая часто встречающаяся причина обусловлена различным поведением молекул разного размера в условиях МАДЛИ. Увеличение молекулярной массы молекулы ведет к увеличению ее геометрического размера. Следует понимать, что чем больше размер молекулы, тем сложнее ей внедриться в кристалл матрицы, и тем меньше макромолекул приходится на единицу объема образца. При лазерном ударе более легкие молекулы десорбируются с поверхности легче, чем их более тяжелые гомологи, что и отражается в дискриминации высоких масс. Еще одним фактором, искажающим молекулярно-массовое распределение, является возможность частичной фрагментации макромолекул, приводящей к образованию низкомолекулярных продуктов.
Таблица 2. Применимость наиболее популярных матриц для анализа синтетических полимеров методом МАЛДИ МС
Матрица
|
ПЭГ
|
ПС
|
ПММА
|
ПАН
|
a-циано-4-гидроксикоричная кислота
|
+
|
+
|
+
|
-
|
2,4,6-Тригидроксиацетофенон
|
+
|
-
|
+
|
-
|
2,5-дигидроксибензойная кислота
|
+
|
-
|
+
|
-
|
3-гидроксипиколиновая кислота
|
-
|
+
|
+
|
-
|
4-гидроксибензилиденмаононитрил
|
+
|
+
|
+
|
+
|
5-хлорсалициловая кислота
|
+
|
+
|
+
|
-
|
5-хлоро-2-меркаптобезотиазол
|
+
|
+
|
+
|
-
|
9-антраценкарбоновая кислота
|
+
|
-
|
+
|
-
|
Антраниловая кислота
|
-
|
+
|
+
|
-
|
1,8,9-тригидроксианрацен (дитранол)
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Транс-4-гидрокси-3-метоксикоричная кислота (феруловая кислота)
|
+
|
-
|
+
|
-
|
2-(4-гидроксифенилазо)бензойная кислота
|
+
|
+
|
+
|
-
|
Транс-3,5-диметокси-4-гидроксикоричная кислота (синапиновая кислота)
|
-
|
-
|
+
|
-
|
Транс-3-(3-индолил)акриловая кислота
|
+
|
+
|
+
|
-
|
ПЭГ - полиэтиленгликоль, ПС - полистирол, ПММА - полиметилметакрилат, ПАН - полиакрилонитрил
Дискриминация по массам может быть наглядно проиллюстрирована при анализе эквимольной смеси монодисперсных стандартов полиметилметакрилата со значениями среднечисленной молекулярной массы равными 1,9, 8.2 и 14 кДа. Представленный на рисунке 8 масс-спектр имеет наиболее высокую интенсивность сигнала в области низких масс. Следует также обратить внимание на то, что максимальная интенсивность сигнала для низкомолекулярного стандарта соответствует значению m/z, совпадающему с молекулярной массой образца, тогда как для более высокомолекулярных образцов максимум несколько смещен в низкомолекулярную область.
|
Рис 8. Масс-спектр эквимольной смеси стандартов полиММА с массами 1,9; 8,2 и 14 кДа, зарегистрированный в отраженном режиме с применением DCTB в качестве матрицы
|
В случае высокомолекулярных образцов дискриминация по массам существенно усиливается. Анализ полимеров с массами выше 10 кДа сопряжен с дополнительными трудностями, связанными с более тщательной подготовкой образца для анализа. В ряде случаев необходимо провести тщательную очистку образца от низкомолекулярных примесей, затрудняющих получение хорошо разрешимого спектра. Иногда даже небольшого количества низкомолекулярного полимера достаточно для маскирования сигнала от основной, высокомолекулярной фракции.
Совместное применение методов времяпролетной масс-спектрометрии МАЛДИ с гель-проникающей хроматографией (ГПХ) позволяет существенно расширить возможности каждого метода. Существует несколько вариантов комплексного использования обозначенных методов. Первый заключается в сборе фракций, выходящих из ГПХ колонки, их упаривания и последующего анализа методом МАЛДИ. Во втором методе с использованием специального автоматического устройства происходит непосредственное нанесение раствора, выходящего из хроматографа, на мишень для МАЛДИ. При использовании данного подхода матрица может быть предварительно нанесена на поверхность мишени, либо смешиваться раствором полимера непосредственно в момент нанесения.
Совместное применение методов ГПХ и МАЛДИ позволяет получать информацию о природе концевых групп макромолекул, содержащихся в разных фракциях образца, что важно при изучении процессов контролируемой радикальной полимеризации. При проходе образца через колонку для гель-проникающей хроматографии происходит не только его разделение на отдельные фракции, но и отделение низкомолекулярных продуктов и олигомеров, мешающих регистрации хорошо разделимого спектра [4-5].
Совместное применение методов МАЛДИ и ГПХ успешно применяется в Нижегородском государственном университете им.Н.И.Лобачевского при исследовании процессов контролируемой радикальной полимеризации и изучении строения и молекулярно-массовых характеристик получаемых полимеров. Методом гель-проникающей хроматографии из образца полиметилметакрилата были выделены три фракции. В соответствии со временами удерживания они соответствовали полимерам с молекулярным массами (43,6-24) кДа для первой, (24-13) кДа для второй и 13-2,8 кДа для третьей. Из каждой из собранных фракций был удален растворитель, после чего они были проанализированы методом МАЛДИ с использованием DCTB в качестве матрицы. На рисунке 9 приведены зарегистрированные масс-спектры выделенных фракций. Как видно из приведенных на рисунке данных, молекулярно-массовое распределение каждой из собранных фракций соответствует значению молекулярной массы, определенному методом ГПХ исходя из времени удерживания полимера. Таким образом, сбор узкодисперсных фракций и их последующий анализ методом МАЛДИ может быть использован при построении калибровочных зависимостей в гель-проникающей хроматографии.
|
Рис. 9 Масс-спектры фракций ПММА-макроинициатора, зарегистрированные методом времяпролетной МАЛДИ МС с использованием DCTB как матрицы. Номера на рисунке соответствуют порядку выхода фракций из прибора
|
Выделение полимера методом гель-проникающей хроматографии позволяет проводить удаление низкомолекулярных примесей и регистрировать сигналы от макромолекул с высокими молекулярными массами. Это особенно важно для образцов с полидисперсностью, превышающей 1.3, а также образцов, загрязненных примесями низкомолекулярных продуктов. Это наглядно отображается на рисунке 9, где приведен масс-спектр высокого разрешения в области 30 кДа, который не удалось зарегистрировать без предварительного фракционирования.
|
Рис.10. Фрагмент масс-спектра полиММА, зарегистрированный с использованием DCTB в качестве матрицы
|
Методы ГПХ и МАЛДИ МС предоставляют важную информацию о молекулярно-массовых характеристиках полимеров. В отличие от ГПХ, дающей исследователю лишь картину молекулярно-массового распределения образца, МАЛДИ МС позволяет зафиксировать сигнал от отдельных макромолекул и в ряде случаев определить их состав и строение. На рисунке 10 представлен увеличенный фрагмент масс-спектра, приведенного на нижней части рисунка 9.
На рисунке отчетливо видны три серии линий, отстоящих друг от друга на 100 единиц, что соответствует мономерному звену метилметакрилата и подтверждает, что зарегистрированные сигналы принадлежат именно исследуемому полимеру, а не примесям. Зафиксированные значения m/z для отдельных макрокатионов позволяют сделать вывод об их строении, в частности определить природу концевых групп. Очевидно, что для этого необходимо знать условия получения полимера: природу используемого инициатора, растворителя и т.д.
В качестве примера рассмотри сигнал с m/z=6385. Строение макрокатиона, которому он соответствует можно представить следующим образом:
|
