Роль эндотелия в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию
Скачать 321.05 Kb.
|
На правах рукописи МАКАРЕНКО ВЛАДИСЛАВ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ РОЛЬ ЭНДОТЕЛИЯ В МЕХАНИЗМАХ ОТВЕТА НА ПРЕРЫВИСТУЮ НОРМОБАРИЧЕСКУЮ ГИПОКСИЮ 03.00.04 – биохимия 03.00.13 - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Барнаул - 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Алтайском государственном медицинском университете Росздрава (г. Барнаул) Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ельчанинова Светлана Александровна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович доктор медицинских наук, профессор Кривощеков Сергей Георгиевич Ведущая организация: Государственное учреждение Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Новосибирск) Защита состоится « » 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3833-33-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. Автореферат разослан «___» ___________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Русских Г. С. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Общепризнано, что продуцируемые эндотелием биологически активные вещества играют ведущую роль в регуляции функциональной активности, пролиферации и апоптоза клеток сосудистой стенки, ее взаимодействия с форменными элементами и компонентами плазмы крови (Pohlman T.H., Harlan J.M., 2000; Galley H.F., Webster N.R., 2004; Marti H.H., 2005). Скорость синтеза и секреции эндотелиальных факторов, в свою очередь, регулируются множеством вазоактивных сигнальных молекул - ацетилхолином, брадикинином, ангиотензином II и другими, а также локальными изменениями скорости кровотока (Karimova A., Pinsky D.J., 2001; Michiels C., 2003). Одним из мощных факторов модулирующих метаболизм эндотелиоцитов является гипоксия (Faller D.V., 1999; Michiels C. et al., 2000; Li J.M., Shah A.M., 2004; Jernigan N.L. et al., 2004; Fike C.D. et al., 2005). Воздействие разными вариантами гипоксии и, в частности, прерывистой нормобарической гипоксией (ПНГ) уже долгие годы используется для профилактики и лечения многих хронических заболеваний, повышения неспецифической резистентности организма (Меерсон Ф.З., 1973; Караш Ю.М. и др., 1986; Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001). Установлено, что под влиянием курса ПНГ у здоровых людей развивается комплекс адаптивных изменений в различных системах организма, включающий возрастание потребления и эффективности использования кислорода, увеличение кислородной емкости крови, уменьшение реактивности симпатоадреналовой системы (Горанчук В.В. и др., 2003; Кривощеков С.Г. и др., 2004; Serebrovskaya T.V. et al., 2005). Показано изменение артериального давления, частоты сердечных сокращений, тонуса резистивных сосудов при ПНГ у здоровых людей, а также нарушений гемодинамики у больных с артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца (Стрелков Р.Б., Чижов А.Я., 2001; Ельчанинова С.А. и др., 2002, 2008; Потиевская В.И., 2005). Анализ данных литературы позволил нам предположить что, механизмы адаптивных преобразований сердечно-сосудистой системы под воздействием ПНГ включают изменения функционирования эндотелия, его активацию с развитием устойчивости к действию повреждающих факторов. Цель работы: Изучить роль эндотелия кровеносных сосудов в механизмах ответа на прерывистую нормобарическую гипоксию. Задачи исследования:
Научная новизна. Впервые показано, что механизм воздействия ПНГ (20 ежедневных одночасовых сеансов чередования вдыхания воздуха с вдыханием гипоксической газовой смеси, содержащей 10-12 об.% кислорода) у здоровых людей включает снижение концентрации в крови маркеров повреждения эндотелия на фоне повышения концентрации васкулярного эндотелиального фактора роста, активности внутриклеточных антиоксидантных ферментов и снижения концентрации продуктов перекисного окисления липидов. На культуре эндотелиоцитов человека впервые показано, что ПНГ оказывает прямое влияние на эндотелиоциты: приводит к опосредованному активными формами кислорода кратковременному ослаблению межклеточных контактов эндотелиоцитов с их укреплением к третьему сеансу гипоксии, возрастанию продукции васкулярного эндотелиального фактора роста накоплению в эндотелиоцитах индуцируемых гипоксией факторов транскрипции HIF-1α и HIF-2α. Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы свидетельствуют об участии эндотелия в механизмах адаптации к прерывистой нормобарической гипоксии, о возможности формирования не опосредованного системными регуляторными факторами ответа эндотелиоцитов на это воздействие. Установленные закономерности указывают на перспективность исследования применения ПНГ для первичной профилактики артериальной гипертензии и атеросклероза - заболеваний сердечно-сосудистой системы, центральным звеном патогенеза которых является дисфункция эндотелия. Положения, выносимые на защиту.
Апробация работы. Результаты исследования доложены и обсуждены на III научной конференции «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2003), VI научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2004), VII научно-практической конференции «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2005), XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), VIII Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), совместном заседании кафедр биохимии и физиологии (Барнаул, 2009), проблемной комиссии по физиологии и патофизиологии сердечно-сосудистой системы ГОУВПО «Алтайский государственный медицинский университет Росздрава» (Барнаул, 2009). Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, четырех глав с результатами собственного исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 137 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 204 литературных источников, из них 55 - на русском языке и 139 - на иностранных. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В исследовании приняли участие 30 здоровых добровольцев (10 мужчин и 20 женщин) в возрасте от 31 до 35 лет (средний возраст 33±2 год). Курс ПНГ, который проводили с использованием установки БиоНова-204 (Россия), включал 20 ежедневных сеансов продолжительностью 60 минут. Сеанс состоял из 6 циклов длительностью 10 минут, в которых вдыхание через маску гипоксической газовой смеси с содержанием кислорода 10-12 об.% чередовалось с вдыханием атмосферного воздуха в циклическом режиме. Длительность вдыхания гипоксической смеси в цикле увеличивалась от 1 до 5 мин в первые четыре дня курса, а затем составляла 5 мин. Согласно рекомендациям Минздрава СССР (Стрелков Р.Б. и др., 1985), длительность дыхания гипоксической газовой смесью в первые сеансы ПНГ назначали в зависимости от результатов пробы Штанге - продолжительности задержки дыхания на вдохе. Для исследования эффектов ПНГ в эксперименте in vitro была использована первичная культура клеток эндотелия микрососудов легких человека (ЭМСЛЧ, HMVE-L), полученная от Lonza Walkersville, Inc. (США). Культура ЭМСЛЧ выращивалась в пластиковых чашках Петри (диаметр 100 мм) с использованием стандартной жидкой среды для эндотелиоцитов Clonetics EGM-2-MV BulletKit (Lonza Walkersville, Inc., США) на основе базисной среды 2 для эндотелиальных клеток с добавлением гентамицина, амфотерицина-В, гидрокортизона, эмбриональной телячьей сыворотки и необходимых факторов роста. Клетки выращивались в атмосфере, содержащей 21 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа и 74 об.% азота. Для оценки эффектов ПНГ были использованы ЭМСЛЧ седьмого-девятого пассажа, достигшие 80-100% конфлюентности. Воздействие ПНГ проводили с использованием инкубатора "Steri-Cult 200 Incubator" (Thermo Scientific, США), в который помещали герметичную пластиковую камеру размером 20х25х15 см. Чашки с культурой ЭМСЛЧ располагали в центре камеры. Во время сеанса нагретая до 37°С газовая смесь постоянно поступала в камеру, отработанная смесь через выводящий клапан выводилась наружу. Объем и скорость поступления газовой смеси в камеру осуществлялась соленоидными клапанами автоматического дозатора газов «Flowmeter». Попеременно использовали готовые газовые смеси: нормоксическую (20 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа, 75 об.% азота) и гипоксическую (1 об.% кислорода, 5 об.% углекислого газа, 94 об.% азота). Воздействие включало три одночасовых сеанса ПНГ, каждый из которых состоял из 6 циклов чередования 5-минутной нормоксии и 5-минутной гипоксии. Повтор сеанса проводили после одночасового периода нормоксии. При разработке схемы воздействия ПНГ in vitro ставилась задача максимально приблизить ее параметры к схеме гипоксической тренировки in vivo. В конце периода вдыхания гипоксической газовой смеси в капиллярной крови здоровых участников исследования парциальное давление кислорода снижалось от 83-108 до 35-45 мм рт. ст. В культуральной среде в процессе ПНГ парциальное давление кислорода в течение 5 минут пропускания гипоксической смеси через камеру снижалась от 80 до 35-45 мм рт ст. Длительность нормоксии между сеансами была подобрана в предварительных экспериментах с учетом длительности сохранения жизнеспособности культуры, оцениваемой по восприятия красителя трепанового синего. Уровень артериального давления (АД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли с использованием автоматического измеряющего устройства A&D M400 (Япония). Коньюктивальную биомикроскопию проводили с помощью щелевой лампы ЩЛ-2 (Россия), установленной горизонтально на подвижном штативе (увеличение в 16 раз). Оценку микроциркуляции проводили по методу В.С. Волкова и соавторов (1976) с вычислением конъюктивального индекса – суммы баллов признаков нарушения микроциркуляции. Выраженность окислительного стресса оценивали по общей прооксидантной активности (ОПА), которую оценивалась по накоплению в модельной системе продуктов перекисного окисления ТВИН-80, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (Галактионова Л.П. и др., 1998) и концентрации в плазме крови тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБРП) (Владимиров Ю.М., Арчаков А.И., 1972). Активность антиоксидантных ферментов исследовали в гемолизате эритроцитов и рассчитывали на единицу массы гемоглобина, определенного гемоглобинцианидным методом (Меньшиков В.В. и др., 1987). Активность супероксиддисмутазы определяли по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия супероксидом (Чевари С.И. и др., 1991); активность каталазы – по подавлению окисления молибдата перекисью водорода (Чевари С.И. и др., 1991); глутатионпероксидазы – по убыли восстановленного глутатиона при его окислении гидроперекисью третбутила (Моин В.М., 1986). Концентрацию в сыворотке крови васкулярного эндотелиального фактора роста (vascular endothelial groth factor, VEGF) и большого эндотелина-1 1-38 определяли методом иммуноферментного анализа с реагентами и по протоколам процедур Сytimmune Sciences Inc. (США) и Biomedica Gruppe (Австрия) соответственно. Концентрацию эндотелиальных микрочастиц (ЭМ) определяли в бедной тромбоцитами плазме крови подсчетом СD31+ частиц размером 1,5-4,0 мкм методом проточной цитофлуорометрии с использованием мышиных моноклональных ФИТЦ-меченых антител фирмы Coltag (США) на цитофлуориметре «Epix XL» фирмы Coulter (Франция). Для оценки проницаемости монослоя, образованного ЭМСЛЧ, применяли методику динамического измерения импеданса клеток (ECIS) (Giaever I., Keese C.R.,1988). Монослой клеток формировали на микроэлектродах (Applied Biophysics, США), через которые пропускали переменный ток силой менее одного микроампера. Электролитом служила стандартная среда для эндотелиальных клеток. Регистрировали суммарный импеданс в системе электродов, изменения которого отражали изменения в межклеточных и адгезионных (с поверхностью микроэлектродов) контактах. Выраженность окислительного стресса в культуре ЭМСЛЧ оценивали по концентрации ТБРП в лизате эндотелиоцитов и усилению флуоресценции клеток, предварительно обработанных дихлорфлюоресцином, с использованием микроскопа Nikon Eclipse TE 300. Количественный анализ изображений проводили с использованием программы Scion Image. Измерение концентрации VEGF в клеточной среде проводили методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы и по протоколам процедур фирмы Santa Cruse Ltd. (США). Содержание HIF-1α и HIF-2α в лизате ЭМСЛЧ проводили методом иммуноблота в 7,5% полиакриламидном геле с использованием первичных мышиных моноклональных антител (Novus, США) к HIF-1α и HIF-2α и вторичных меченых пероксидазой хрена моноклональных антител (Chemicon Inc., США). Статистический анализ полученных данных выполнен с использованием программы Sigma Stat 3.1. (Systat Software Inc., 2004). Соответствие нормальному распределению оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова. При проверке нормальности распределения не было выявлено различий между мужчинами и женщинами по использованным в работе показателям, поэтому анализ проводили без разделения участников исследования по полу. Для анализа выборок с нормальным распределением были избраны параметрические методы статистики. Межгрупповую вариабельность оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа; множественные парные сравнения по критерию Стьюдента-Ньюмена-Кейлса с использованием пакета ANOVA. Анализ данных, не соответствующих нормальному распределению, проводили с использованием критерия Уилкоксона. Сравнение долей проводили с использованием критерия χ2. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Роль дисфункции эндотелия в развитии поражения почек у больных с... Работа выполнена на кафедре терапии медицинского факультета Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального... | | В урок г погост Эта часть работы содержит задания а 1- а 30 с выбором ответа. Из предложенных вариантов ответа только один верный. Внимательно прочитайте... |
| «профессиональный лицей №91» программа государственной итоговой аттестации выпускников С выбором ответа. К каждому заданию дается 4 ответа, только один из которых правильный. При выполнении задания части 1 обведите кружком... | | Положение об аттестационной комиссии по проведению промежуточной... С выбором ответа. К каждому заданию дается 4 ответа, только один из которых правильный. При выполнении задания части 1 обведите кружком... |
| Литература и источники Школы не только должны распространять основные знания о нормах в области прав человека и механизмах для их защиты, но и играть основополагающую... | | Инструкция по выполнению работы На выполнение экзаменационной работы... С выбором ответа. К каждому заданию дается 4 ответа, только один из которых правильный. При выполнении задания части 1 обведите кружком... |
| Кому принадлежит ведущая роль в воспитании детей? Указания: все задания имеют пять вариантов ответа. Обведите кружком тот, который Вы считаете правильным | | Клинико-эпидемиологические методы диагностики и профилактикиболезней... Н. К. Баширов,Т. Ю. Ни,Д. К. Берикбол,А. С. Калибаева,А. И. Колмаков,А. А. Молданьярова,А. Н. Торпаков |
| Министерство образования оренбургской области прика з Заданий обязательного уровня. К первым четырем заданиям приведены 4 варианта ответа, из которых только один верный. При выполнении... | | Порядок работы муниципальной предметной комиссии Заданий обязательного уровня. К первым четырем заданиям приведены 4 варианта ответа, из которых только один верный. При выполнении... |
| Положение о предметных комиссиях Рязанской области Заданий обязательного уровня. К первым четырем заданиям приведены 4 варианта ответа, из которых только один верный. При выполнении... | | Положение об экзаменационной комиссии Заданий обязательного уровня. К первым четырем заданиям приведены 4 варианта ответа, из которых только один верный. При выполнении... |
 | Памятка о порядке проведения гиа-9 в 2013 году А26. К каждому заданию приводится 4 варианта ответа, из которых только один верный. При выполнении заданий части 1 обведите кружком... | | Памятка родителям участников гиа-9 2013 года А26. К каждому заданию приводится 4 варианта ответа, из которых только один верный. При выполнении заданий части 1 обведите кружком... |
| Министерство образования и науки российской федерации Включает 20 заданий с выбором ответа. К каждому заданию дается 4 ответа, только один из которых правильный | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Школы не только должны распространять основные знания о нормах в области прав человека и механизмах для их защиты, но и играть основополагающую... |
