На правах рукописи
 Кондратов Илья Геннадьевич
ОБНАРУЖЕНИЕ ПРИРОДНОГО РЕЗЕРВУАРА
ВИРУСА ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ В БРЮХОНОГИХ МОЛЛЮСКАХ
03.00.16 – экология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
ИРКУТСК 2007
Работа выполнена в лаборатории аналитической биоорганической химии Лимнологического институте Сибирского отделения Российской академии наук, г. Иркутск.
Научный руководитель:
кандидат биологических наук
Деникина Наталья Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Саловарова Валентина Петровна;
кандидат биологических наук, доцент
Таничев Андрей Игоревич
Ведущая организация:
ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (г. Владивосток)
Защита состоится «14» ноября 2007 г. в 13:30 часов
на заседании диссертационного совета Д.212.074.07
при Иркутском государственном университете
по адресу: 666003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5,
Байкальский музей им. Профессора М.М. Кожова (ауд. 219)
Факс(3952)241855, e-mail: dekanat@bio.isu.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Иркутского государственного университета
Автореферат разослан « 12 » октября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного
совета, кандидат биологических наук Е.С. Купчинская
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Вирус чумы плотоядных (Canine Distemper Virus,CDV), представитель рода Morbillivirus семейства Paramyxoviridae, явился причиной эпизоотии байкальских тюленей Phoca sibirica, приведшей к гибели 10-15 тысяч животных в течение осени 1987 - весны 1988 гг. (Grachev et al.,1989; Lichoshway et al.,1989). Практически одновременно, в 1988 г., в морях Северной Европы началась массовая гибель тюленей Phoca vitulina, но причиной этой эпизоотии послужил морбилливирус, близкородственный CDV, впоследствии описанный как самостоятельный вид Phocine distemper virus (PDV) (Osterhaus, Vedder , 1988; Mahy et al. 1988). Морбилливирусные инфекции у ластоногих были впервые зарегистрированы именно во время этих эпизоотий. До 1988 г. род Morbillivirus объединял четыре вида вирусов: measle virus (MV), ringerpest virus (RPV), peste-des-pestits-ruminants virus (PPRV) и canine distemper virus (CDV). Считалось, что морбилливирусы инфицируют строго ограниченный круг млекопитающих (видоспецифичны), в который представители ластоногих не входили.
После затухания морбилливирусных эпизоотий у ластоногих 1987-1988 г. ситуации на Байкале и в морях Северной Европы развивались совершенно по-разному. Так, процент серопозитивных к PDV взрослых шотландских тюленей снизился с 72% в 1988г. до 0% в 2000 г. (Thompson et al., 2002). Вирус не регистрировался до повторной эпизоотии в 2002 г, которая началась, как и первая, на о. Анхольт и оказалась не менее разрушительной (Jensen et al., 2002; Muller et al., 2004). Варианты PDV 2002 г. незначительно отличались от варианта 1988 г. и имели мутации в исследуемом фрагменте гена Р (370 н.п.), либо молчащие, либо приводящие к замене одной аминокислоты в штамме PDV-1/DK/2002 (Muller et al., 2004).
В Байкале зараженность тюленей в течение всего периода составляла около 40%, причем инфицированные животные были нормальной упитанности без видимых признаков каких-либо нарушений, кроме того, зараженность тюленей не зависела от пола, возраста и места отлова (Беликов и др., 1999). Антитела к CDV были обнаружены у 85% животных (Ohashi et al., 2001). Выявлена значительная гетерогенность анализируемого фрагмента гена Р в популяции байкальской нерпы как в различные года, так и среди образцов головного мозга тюленей, добытых в течение одного года (Бутина и др., 2003). Такие существенные отличия в этих эпизоотических процессах указывают на существование различных механизмов циркуляции вируса в двух экосистемах. Поскольку вероятность постоянного инфицирования байкальских тюленей от других животных чрезвычайно низка, появилось предположение о существовании природного резервуара морбилливирусов в экосистеме оз. Байкал.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось доказательство существования природного резервуара CDV в пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсках). Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. Показать методом ОТ-ПЦР возможность присутствия РНК вируса чумы плотоядных в организмах пойкилотермных животных.
2. Доказать, что вирус чумы плотоядных в организме брюхоногого моллюска сохраняет свою инфекционность для теплокровных животных. Провести заражение чувствительных животных (хорьков) и получить изоляты вирусов на культуре клеток.
3. Определить нуклеотидные последовательности фрагментов геномов вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы, брюхоногих моллюсков и полученных изолятов вируса чумы плотоядных. Определить степень родства вируса чумы плотоядных от байкальской нерпы и брюхоногих моллюсков.
4. Продемонстрировать возможность репликации вируса чумы плотоядных в организме пойкилотермного животного (брюхоногого моллюска).
5. Показать, что вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции брюхоногих моллюсков по поколениям.
Научная новизна работы. В представленной работе впервые показано, что вирус чумы плотоядных, представитель рода Morbillivirus, ранее считавшийся облигатным вирусом теплокровных, способен накапливаться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков Limnaea auricularia и Maakia herderiana) без потери инфекционности для теплокровных. Использованы как молекулярно-биологические (ПЦР с последующим определением нуклеотидной последовательности, масспектрометрия), так и вирусологические методы (заражение чувствительных животных, изоляция на культуре клеток MDCK - перевиваемой эпителиальной клеточной культуре почки собаки).
Впервые продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных реплицироваться в организмах пойкилотермных животных (брюхоногих моллюсков) методом раздельной гибридизации вирусоспецифических кДНК на биотинмеченых праймерах, комплементарных матричной и вирионной РНК, иммобилизованных на стрептавидиновых планшетах.
Впервые в результате длительного культивирования брюхоногих моллюсков L. auricularia в условиях, исключающих дополнительную контаминацию в искусственной водной экосистеме (аквариуме) продемонстрирована способность вируса чумы плотоядных передаваться в популяции моллюсков по поколениям.
Впервые получены изоляты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков L. auricularia и M. herderiana на культуре клеток MDCK, проведена их молекулярно-биологическая, иммунологическая и пептидная характеризация.
Определены нуклеотидные последовательности участка кодирующей области гена фосфопротеина длиной 380 нуклеотидов для вариантов CDV от байкальской нерпы, L. auricularia и M. herderiana. Показано, что варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства.
Практическая значимость работы. Разработанный в работе подход к изучению циркуляции морбилливирусов является абсолютно новым и может быть использован при исследовании экологии других одноцепочечных РНК-содержащих вирусов, в первую очередь – вируса гриппа. Полученные данные могут быть использованы в учебных курсах университетов.
Основные защищаемые положения:
Вирус чумы плотоядных способен накапливаться в организмах брюхоногих моллюсков без потери инфекционности для теплокровных.
Вирус чумы плотоядных способен реплицироваться в организмах брюхоногих моллюсков.
Вирус чумы плотоядных способен передаваться в популяции брюхоногих моллюсков L. auricularia по поколениям.
Варианты вируса чумы плотоядных от брюхоногих моллюсков и байкальской нерпы на исследуемом участке генома обнаруживают высокую степень родства.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на 6 конференциях: 3rd International Symposium "Ancient Lakes: Speciation, Development in Time and Space, Natural History" (Иркутск, Россия, 2002); 2nd International Conference “Marine Mammals of Holarctic” (Байкал, Россия, 2002); Всероссийская научно-практическая конференция "Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе” (Иркутск, Россия, 2003); Четвертая Верещагинская Байкальская конференция (Иркутск, Россия, 2005); 20th Annual Conference of the European Cetacean Society (Gdynia, Poland, 2006); IX съезд гидробиологического общества РАН (Тольятти, Россия, 2006). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи.
Личный вклад соискателя. Молекулярно-биологические данные получены лично автором. Заражение чувствительных к CDV животных проведено сотрудниками Института молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» под руководством к.б.н. Шестопалова А.М. Изоляты CDV на культуре MDCK получены на базе ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, Иркутск, под руководством к.б.н. Черногор Л.И. Пептидная характеризация изолятов проведена автором на базе Института аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург, под руководством к.б.н. Подольской Е.П.
Структура и объём диссертации. Рукопись диссертационной работы состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (128 наименования, из них 15 отечественных и 113 зарубежных). Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и 2 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы.
В первой главе содержится обзор литературных данных по систематике и молекулярной биологии морбилливирусов. Приведены характеристики морбилливирусных эпизоотий у водных млекопитающих 1987-2002гг. Продемонстрирована роль беспозвоночных животных в циркуляции вирусов теплокровных.
Глава 2. Материалы и методы.
В
Рис. 1. Карта сбора образцов пойкилотермных гидробионтов в оз. Байкал и р. Ангара.
работе были использованы: пойкилотермные гидробионты оз. Байкал из коллекций сотрудников Лимнологического института, хранившиеся под спиртом; живые брюхоногие моллюски семейств Lymnaeidae и Baicaliidae, собранные в прибрежной зоне оз. Байкал в районе м. Березовый, пос. Большие Коты и о. Ольхон; живые брюхоногие моллюски L. auricularia, собранные в Иркутском водохранилище и в р. Ангара в черте г. Иркутска; живые двустворчатые моллюски, амфиподы и черви; головной мозг рыб, выловленных в оз. Байкал в разные сезоны (рис. 1); образцы органов и тканей хорьков, заражённых гомогенатом L. auricularia (НИИМБ ГНЦ ВБ «Вектор»).
Оз. Байкал
Выделение из образцов суммарной РНК и реакцию обратной транскрипции проводили с использованием наборов «Рибосорб», «Рибозоль» и «Реверта» (Амплисенс, Москва). Гибридизовали кДНК на биотинилированных универсальных морбилливирусных праймерах (Barrett et al., 1993), иммобилизованных на стрептавидиновых планшетах Nunclon. ПЦР ампликонов проводили с использованием тех же праймеров, нуклеотидные последовательности определяли как после клонирования, так и прямым сиквенированием либо с использованием [-33P] dАТP, либо на автоматических секвенаторах ABI 373A (Applied Biosystems) и SEQ 8800 (Beckman Coulter). Сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили методом neighbor-joining.
Иммуноферментный анализ образцов органов и тканей хорьков, заражённых гомогенатом L. аuricularia проводили с использованием тест-системы иммуноферментной для диагностики чумы плотоядных (БиоКом ЛТД, г. Новосибирск).
Культивирование L. auricularia проводили в аквариумах с отстоянной водопроводной водой при 15-20оС, в качестве белковой подкормки использовали вареную рыбу. Взрослых особей после периода размножения и откладки икры отбирали для последующего выделения мРНК и определения присутствия вирусоспецифических РНК. Кладки икры после смены воды, а затем выклюнувшуюся из кладок молодь L. auricularia первого поколения продолжали культивировать в тех же условиях в течение года до наступления полового созревания. Начало полового размножения стимулировали белковыми подкормками и повышением температуры воды до 24оС. Полученные кладки и молодь второго поколения также анализировали на присутствие вируса CDV.
Изоляты CDV от гастропод L. auricularia и M. herderiana (пулы по 10 штук) получали на перевиваемой эпителиальной клеточной культуре Madin-Darby Canine Kidney (MDCK), 78 пассажа (ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово). В качестве контроля использовали вакцинный штамм Rockborn. Культуру просматривали раз в неделю с помощью светового микроскопа Leica DM 6000B (Leica, Germany). Наличие вируса определяли с помощью первичных флюоресцирующих антител к вирусу CDV (VMRD, Inc.) после получения цитопатического эффекта (на 21 день) на флюоресцентном микроскопе Olympus BX60 (Olympys America, Inc., NY). Пептидный анализ трипсинолизатов суммарного белка полученных изолятов, гастропод L. аuricularia и чистой культуры MDCK в качестве контроля проводили на масс-спектрометре МХ53-03
Глава 3. Результаты и обсуждение.
Анализ байкальских пойкилотермных гидробионтов на присутствие CDV.
Для обнаружения возможных природных резервуаров вируса чумы плотоядных в экосистеме оз. Байкал был проведен анализ зараженности пойкилотермных гидробионтов вирусом CDV, как объектов питания байкальской нерпы (рыбы), так и являющихся основанием пищевых цепей (моллюски, амфиподы, черви), собранных в разное время года в разных районах (рис. 1).
В качестве наиболее информативного и чувствительного метода был выбран ОТ-ПЦР анализ с последующей визуализацией результатов в ПААГ-электрофорезе (окраска серебром), позволяющем визуализировать 0.1 нг ДНК с шириной полосы 1 см.
На рис. 2 приведена в качестве примера одна из полученных электрофореграмм. В результате проведенного анализа вирусоспецифические РНК были обнаружены в организмах различных пойкилотермных гидробионтов оз. Байкал и р. Ангара: в головном мозге ряда рыб, принадлежащих различным экологическим нишам, отличающихся по спектрам питания; в амфиподах, брюхоногих моллюсках и червях. Зараженность гидробионтов, относящихся к разным таксонам, различалась в зависимости от места и времени сбора образцов, сезонной и территориальной корреляции зараженности организмов обнаружено не было.
  |
