Научные руководители: заслуженный деятель науки рф, доктор ветеринарных наук, профессор Григорий Гаврилович Щербаков

На правах рукописи Винникова Светлана Викторовна Мембранное пищеварение у кроликов при стрессовых состояниях и его коррекция 06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных 03.03.01 – Физиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена на кафедре внутренних болезней животных им. А.В. Синёва ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» и в лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Научные руководители: заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Григорий Гаврилович Щербаков, доктор биологических наук Андрей Андреевич Груздков. Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Ковалёв Сергей Павлович, доктор ветеринарных наук, профессор Данилевская Наталья Владимировна. Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия». Защита диссертации состоится «21 декабря» 2010г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 220.059.01 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины». Автореферат разослан ______________ 2010г. Учёный секретарь диссертационного совета О.В. Крячко 1. Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Стресс оказывает отрицательное влияние на организм сельскохозяйственных животных, приводит к снижению их продуктивности (уменьшению привесов, надоев, ухудшению качества мяса, меха и пр.) и изменению резистентности к различным заболеваниям. Это диктует необходимость широких исследований влияния стресса на различные системы организма сельскохозяйственных животных и, в особенности, их пищеварительную систему. Органы пищеварения у человека и животных, являются важнейшим первичным звеном ассимиляции пищевых веществ, которое в значительной степени определяет общий метаболизм организма и его гомеостаз. В последние десятилетия изучение действия стресса на пищеварительную систему у млекопитающих явилось предметом многочисленных исследований. Известно, что под влиянием стресса образуются язвы в желудке и двенадцатиперстной кишке (Selye, 1972, 1977; Glavin, 1980; Filaretova, 2007), нарушается кишечная моторика (Bueno et al.,1989; МcKay et al., 1994, 2006; Kiliaan et al., 1998; Saunders et al, 2002; Овсянников, Березина, 2007; Березина, Овсянников, 2009) и снижается кровоток (Меерсон, 1986; Mitchell et al., 1995; Ladewig, 2000; Wielebnowski, 2003). Обнаружено также под влиянием стресса изменение всасывания жидкости, электролитов (Barclay, Turnberg, 1987, Empey, Fedorak, 1989; Saunders et al., 1994; Ladewig, 2000) и повышение пассивной проницаемости тонкой кишки, в том числе по отношению к макромолекулам (Kiliaan et al.,1998; Söderholm, Perdue, 2001). Несмотря на прогресс в изучении действия стресса на желудочно-кишечный тракт у млекопитающих, ряд аспектов этой проблемы, касающихся, в частности, его влияния на мембранное пищеварение и всасывание, остаются слабо изученными. Так, весьма неоднозначны данные научной литературы о реакции на стресс пищеварительных и транспортных систем тонкой кишки в отношении основных пищевых веществ, в частности углеводов. Практически не изучалась роль трофологического состояния организма (сытость и краткосрочное голодание) в отношении реакции указанных систем на стресс. Большим пробелом в современной физиологии и ветеринарии является отсутствие данных о реакции на стресс мембранных пищеварительных ферментов тонкой кишки у сельскохозяйственных животных. Наконец, до сих пор не оценивалась эффективность современных фармакологических препаратов в отношении коррекции отрицательных последствий стресса на примере стресс-реакции пищеварительных ферментов у сельскохозяйственных животных. В настоящей работе было исследовано влияния стресса на мембранное пищеварение и всасывание у сельскохозяйственных животных, а также эффекта фармакологического препарата «Стоп-стресс» в отношении коррекции этого влияния на мембранное пищеварение, впервые проводилось на кроликах. В предварительных опытах использовались также крысы в качестве удобной и хорошо изученной физиологической экспериментальной модели. Цель и задачи исследования Цель работы заключалась в том, чтобы на сельскохозяйственных животных (кролики) и экспериментальных моделях (крысы) исследовать реакцию на стресс со стороны мембранных ферментов, участвующих в расщеплении углеводов и эфиров фосфорной кислоты, и системы мембранного транспорта глюкозы в тонкой кишке в зависимости от времени после воздействия стресс-фактора и трофологического состояния организма, а также оценить эффективность применения фармакологического препарата «Стоп-стресс» на примере реакции на стресс ферментов, участвующих в мембранном пищеварении. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: 1. В предварительных опытах на экспериментальной модели (крысы) изучить влияние стресса (иммобилизация в течение 3 ч) на активность дисахаридазы (мальтаза) и щелочной фосфатазы в слизистой оболочке тонкой кишки в различные сроки после воздействия стресс-фактора и в зависимости от трофологического состояния организма (сытость и голодание в течение 18-20 ч); 2. Исследовать, на той же экспериментальной модели влияние стресса (антиортостатический наклон -60º) на всасывание глюкозы в тонкой кишке в условиях хронического опыта в различные сроки после воздействия стресс-фактора и в зависимости от трофологического состояния организма (сытость или голодание в течение 18-20 ч); 3. В опытах на кроликах исследовать влияние стресса (иммобилизация в течение 3 ч) на активность ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) в слизистой оболочке тонкой кишки у животных, предварительно голодавших в течение 24 ч. 4. Оценить эффект предварительного введения кроликам фармакологического препарата «Стоп-стресс» на изменение активности ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) в слизистой оболочке тонкой кишки после стресса (иммобилизация животных в течение 3 ч) на фоне голодания. 5. Определить содержание кортикостерона в крови животных в разные сроки после воздействия стресс-факторов. Научная новизна работы. В результате модельных исследований впервые изучено влияние стресса (иммобилизация в течение 3 ч) на мембранные гидролитические ферменты, участвующие в расщеплении углеводов (мальтаза) и эфиров фосфорной кислоты (щелочная фосфатаза), а также на систему мембранного транспорта глюкозы в слизистой оболочке тонкой кишки в динамике и при различном трофологическом состоянии организма. Впервые установлены изменения активности мальтазы и щелочной фосфатазы в различных отделах тонкой кишки кроликов под влиянием стресса (иммобилизация в течение 3 ч) и выявлены общие и специфические особенности реакции указанных ферментов на стресс у этих животных по сравнению с крысами. Разработаны дозы, кратность и способы применения фармакологического препарата «Стоп-стресс» для кроликов. Получены новые сведения эффективности применения препарата «Стоп-стресс» при коррекции стресс-реакции мембранных пищеварительных ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) у кроликов. Основные положения, выносимые на защиту У кроликов кратковременный стресс, вызванный иммобилизацией в течение 3 ч на фоне голодания, приводит через сутки после воздействия к снижению активности пищеварительных мембранных ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза) в тонкой кишке. Применение препарата «Стоп-стресс» ослабляет отрицательное действие стресса в отношении поведения животных и реакции на стресс со стороны пищеварительных мембранных ферментов (мальтаза, щелочная фосфатаза). Научно-практическая ценность работы. Проведённые нами исследования расширяют теоретические представления о влиянии стресса на пищеварительные и всасывательные системы тонкой кишки животных и о возможности коррекции стресс-реакции с помощью современных фармакологических препаратов. Полученные данные могут быть полезны для применения препарата «Стоп-стресс» в животноводческих хозяйствах, в частности, в кролиководстве, для снижения отрицательного воздействия технологических стресс-факторов и риска возникновения постстрессорных состояний. Данный препарат не вызывает морфологических изменений тонкой кишки. Материалы диссертации могут быть использованы в научно-исследовательской работе, при чтении лекций и на практических занятиях таких кафедр, как внутренние болезни животных, клинической диагностики, фармакологии и токсикологии, физиологии и патологической физиологии. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 80-летию академика А.М. Уголева (1926-1991) (Санкт-Петербург, 2006); Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007); Шестой Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения (Санкт-Петербург, 2008); Пятой Международной научной конференции «Донозология – 2009. Проблемы здорового образа жизни» (Санкт-Петербург, 2009); Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2010). Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 1 статья в журнале из списка рекомендованных ВАК Минобразования и науки России. Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, общего заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа содержит 8 таблиц, 21 рисунок и 9 таблиц в Приложении. Список литература включает 288 источника, в том числе 138 на иностранных языках. 2. Материал и методы исследования Исследования проводились на кафедре внутренних болезней животных им. А.В. Синёва ФГОУ ВПО « СПБ ГАВМ» и в лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Все эксперименты выполнялись в полном соответствии с требованиями по гуманному обращению с животными. Предварительные эксперименты по оценке влияния стресса на мембранное пищеварение были выполнены на крысах, как наиболее хорошо изученном физиологическом объекте. Использовано 104 лабораторных животных – белых крыс-самцов линии Вистар с массой 150-260 г, содержавшихся на стандартном пищевом рационе. В качестве умеренного стресса использовали иммобилизацию животного в течение 3 ч в клетке, ограничивающей подвижность животного. Для выявления роли трофологического состояния в реакции на стресс опыты проводили на сытых животных или голодавших в течение 18-20 ч. Хронические опыты проводились на 14 крысах-самцах в полном соответствии с требованиями по гуманному обращению с животными. Техника хирургической операции и условия проведения экспериментов были аналогичны тем, которые использовались в оригинальной методике А.М. Уголева и Б.З. Зарипова (Уголев, Зарипов, 1979; Уголев и др., 1981, 1986). Участок тощей кишки длиной 20 см изолировался на расстоянии 15 см дистальнее двенадцатиперстной кишки. В оба конца изолированного отрезка кишки вставлялись металлические фистулы, которые выводились наружу. Изолированную петлю тонкой кишки перфузировали раствором глюкозы 50 мМ. Концентрацию глюкозы в пробах оттекающего перфузата определяли глюкозооксидазным методом (Dahlqvist, 1964). В качестве экспериментальной модели умеренного стресса в хронических опытах использовался антиортостатический наклон животного под углом -60º в течение 1 ч. Основные исследования проводились на сельскохозяйственных животных – 20 кроликах-самцах породы Белый и Серый великан в возрасте 5-6 месяцев с массой тела 3,0-3,3кг. Животные были разделены на четыре группы по 5 животных в каждой: 1– интактные животные (контроль); 2– животные, подвергавшиеся кратковременному стрессу; 3– животные, получавшие в течение 5 дней антистрессовый препарат; 4 – животные, которые получали в течение 5 дней антистрессовый препарат и затем подвергались кратковременному стрессу. В качестве модели кратковременного стрессорного воздействия использовалась иммобилизация в течение трех часов в клетке, ограничивающей подвижность животного и обеспечивающей фиксацию его головы с наружной стороны клетки. Перед стрессорным воздействием кролики голодали в течение 24 часов, а после воздействия получали корм. Кроликам 3 и 4 группы для коррекции стресса давали – капли препарата «Стоп-стресс» однократно в течение 5 дней. Его предварительно растворяли в небольшом количестве воды и вводили в ротовую полость шприцём в дозе: 1 капля препарата (5 мг по действующему веществу) на 1 кг массы тела. Определение ферментативных активностей (мальтаза, щелочная фосфатаза) проводилось в различных отделах тонкой кишки через сутки после стрессорного воздействия. Активности мальтазы (НФ 3.2.1.20) и щелочной фосфатазы (НФ 3.1.3.1) определяли в гомогенатах слизистой оболочки тонкой кишки по описанным ранее методикам (Тимофеева и др., 1986; Егорова и др., 1986) и выражали в мкмолях продуктов гидролиза за 1 минуту на 1 г ткани. Для установления наличия стресса у животных во всех опытах определяли уровень кортикостерона в плазме крови. Для этого через 20 мин после начала стрессорного воздействия у животных отбирали пробы крови (у крыс из хвостовой вены, у кроликов из ушной вены). Концентрацию кортикостерона в плазме крови измеряли флюориметрическим микрометодом (Балашов, 1990). Экспериментальные данные обработаны статистически с использованием t-критерия Стъюдента при р<0,05. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние трофологического состояния организма на реакцию систем мембранного пищеварения и транспорта в тонкой кишке при стрессе Накопленные за последние десятилетия сведения о реакции ферментных и транспортных систем тонкой кишки на стресс весьма неоднозначны (Тарасенко и др., 1990; Никитина и др., 1994, 1998; Шептицкий, Гуска, 1995, 1996; Невмывак, Тимофеева, 1999; Shepherd et al., 2004; Garriga et al., 2006). Анализ имеющейся литературы свидетельствует о том, что существующие в ней противоречия в отношении изменения основных функциональных характеристик тонкой кишки при стрессе обусловлены целым рядом факторов: различием видов стрессирования по степени и длительности воздействия и по срокам исследования после действия стресса; проведением экспериментов на животных разного возраста или с различным трофологическим состоянием; применением разных подходов при анализе функциональных характеристик тонкой кишки. Принимая во внимание вышеизложенное, а также определенные ограничения в количестве подопытных сельскохозяйственных животных, перед исследованием действия стресса на мембранное пищеварение у кроликов в нашей работе для предварительной отработки методики и условий проведения экспериментов в качестве удобной физиологической модели использовались крысы линии Вистар. Были проанализированы реакции мембранных гидролитических ферментов (на примере мальтазы и щелочной фосфатазы) в различные сроки после воздействия и в зависимости от трофологического состояния организма (сытость или голодание в течение 18-20 ч). Мембранные пищеварительные ферменты. В ходе трехчасовой иммобилизации как сытых, так и голодавших животных мы наблюдали у них повышение уровня кортикостерона в плазме крови через 20 мин после начала воздействия по сравнению с аналогичным показателем в соответствующем состоянии в отсутствие воздействия, что подтверждало наличие стресса, вызванного экспериментально. Было обнаружено, что у сытых животных после иммобилизационного стресса масса слизистой оболочки в проксимальном отделе тонкой кишки (в расчёте на см длины) через сутки после воздействия увеличилась на 20% (р<0,05), но в течение первых суток отсутствовал прирост массы тела. Активность исследованных ферментов у сытых животных, непосредственно после трехчасовой иммобилизации, достоверно не отличалась от таковых у контрольных животных (без воздействия) (рис.1). Рис.1. Активность мальтазы в гомогенатах слизистой оболочки тонкой кишки сытых крыс в контроле и после стресса (иммобилизация в течение 3 ч). По вертикали - активность фермента (мкмоль/мин/г ткани). Обозначения: К – контроль; К1 и К3 – контроли через 1 и 3 суток, соответственно; С – через 3 ч после стресса; С1 и С3 – через 1 и 3 суток после стресса, соответственно. *1 – С1/С р<0,02; *2 – С3/С р <0,02; *3 - С1/С р<0,05. Однако через одни и трое суток после иммобилизации активность щелочной фосфатазы в проксимальном отделе тонкой кишки, а также мальтазы в её дистальном отделе, были выше соответственно на 26 и 50 %, (р<0,05) по сравнению с уровнем соответствующих активностей сразу после воздействия. Сходная реакция была отмечена ранее другими авторами в отношении изменения активности мальтазы в тонкой кишке после гипертермии (в течение 2 ч), но не гипотермии (Иезуитова, Тимофеева, 1981). Иные закономерности в отношении изменения всех исследованных показателей на разных сроках после воздействия были обнаружены нами в случае иммобилизационного стресса у предварительно голодавших (18-20 ч) животных (табл. 1 и 2). Таблица 1. Активность мальтазы (мкмоль/мин на г ткани) в слизистой оболочке тонкой кишки у предварительно голодавших (18-20 часов) крыс в различные сроки после стресса (иммобилизация в течение 3 ч) и в контроле (n=5 во всех случаях, кроме указанных в таблице). Физиологическое состояние орг-ма Отделы тонкой кишки 12-перст. кишка Проксималь-ный отдел Медиальный отдел Дистальный отдел Контроль (К) 13,19±2,39 30,43±5,46 31,53±2,72 18,43±1,94 После 3-часовой иммобилизации (С) 13,51±2,02 (n=4) 27,51±1,56 (n=4) 35,74±3,79 16,99±2,56 (n=4) Контроль через 1 сутки (К1) 27,26±3,66 (К1/К) р<0,02 46,31±4,67 62,35±3,96 (К1/К) р<0,0027 35,86±3,16 (К1/К) р<0,0027 Через 1 сутки после стресса (С1) 16,43±3,06 (n=4) 44,95±4,85 (С1/С) р<0,01 59,84±2,38 (n=4) (C1/C) р<0,0027 24,05±3,74 (С1/К1) р<0,05 Контроль через 3 суток (К3) 27,91±2,43 (К3/К) р<0,01 39,64±2,63 37,16±6,23 (К3/К1) р<0,01 24,63±3,78 Через 3 суток после стресса (С3) 22,20±2,84 38,15±3,50 36,67±2,69 (C3/C1) р< 0,0027 17,62±1,19 (n=4)

Похожие:

	«эпизоотология и инфекционные болезни животных» Заслуженный деятель науки рф, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры анатомии, физиологии и хирургии		Статья первая Субетто А. И., доктор экономических наук, доктор философских наук, Заслуженный деятель науки рф, профессор
	Программа история кубанского Ратушняк В. Н доктор исторических наук, профессор, заслуженный деятель науки Кубани и РФ		Учебно-методический комплекс Для специальности 080107 «Налоги и налогообложение» Заслуженный деятель науки Российской Федерации, Заслуженный юрист Российской Федерации, доктор юридических наук, профессор
	Учебное пособие Харьков Одиссей 2004 >>>2>>> ббк 67. 3 М26 Пахомов И. Н., доктор юридических наук, профессор, заслуженный деятель науки и техники		Учебно-методический комплекс Для специальности: 030501 Юриспруденция... Ведерников Н. Т., Заслуженный деятель науки Российской Федерации, Заслуженный юрист Российской Федерации, доктор юридических наук,...
	«утверждено» Проректор по высшему профессиональному образованию,... Ректор Московской Академии рынка труда и информационных технологий, доктор технических наук профессор, Заслуженный деятель науки...		Особенная часть Боброва И. Н. — доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный консультант Государственного...
	Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор Трофимова... Цель урока: обучение созданию собственных речевых произведений, соответствующих нормам речевого этикета		Программа школы дополнительного правового образования «Правовая школа» Доктор юридических наук, профессор, почетный работник высшего профессионального образования рф, заслуженный деятель науки РФ шафиров...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Мглу — Н. Е. Веракса; доктор педагогических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ заведующая кафедрой эстетического воспитания...		Алексей Валентинович Покудов Как управлять дебиторской задолженностью Боброва И. Н. — доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный консультант Государственного...
	Учебник для вузов Под общей редакцией академика Российской академии медицинских наук Боброва И. Н. — доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный консультант Государственного...		Административное право. Практикум. Учебно-практическое пособие Об авторе: Конин Н. М., доктор юридических наук, профессор, заслуженный деятель науки рф, почетный работник высшего профессионального...
	Исследование влияния «трансфер-фактора» А. Я. Чижов – заслуженный деятель науки рф, доктор медицинских наук, профессор (Национальный геронтологический центр, Российский...		Особенности морфопатогенеза осложнений после повторной хирургии на травмированном глазу Работа выполнена в фгбу «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России (директор...