Методические указания для обучающихся по дисциплине «Микробиология, вирусология»

5.2. Основные понятия и положения темы.

Микробиология – это наука о мельчайших живых организмах невидимых невооружённым глазом. Мир микробов открыл голландский коммерсант Антони ван Левенгук (1675). Это стало возможным, благодаря созданным им микроскопам.

Микроскопический метод исследования – это метод предусматривающий наблюдение за микроорганизмами с помощью микроскопа (от греч. micros – малый, scopeo – рассматривать, наблюдать). Микроскоп характеризуется увеличением и разрешающей способностью. Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. Пределом разрешения называется наименьшее расстояние между двумя точками, при котором их можно видеть раздельно. Именно этим расстоянием и определяется максимальное полезное увеличение светового микроскопа.

Величину предельного разрешения определяют по формуле d=0,5 /N sin, где  - длина волны используемого источника света,  - половина угла линзы объектива, т.е. угла между лучами, идущими от объекта к краям объектива, N – показатель преломления среды между объектом (препаратом)и объективом. Знаменатель (N sin) называют числовой апертурой. При использовании иммерсионного масла и иммерсионных линз апертура составляет 1,25. При использовании видимого света с длиной волны около 426 нм, разрешающая способность микроскопа составляет около 200 нм или 0,2 мкм. Разрешающая способность глаза составляет около 200 мкм или 0,2 мм.

Для увеличения контрастности микроорганизмов применяют окрашивание. Большинство методов окрашивания вызывает гибель клеток и поэтому перед окрашиваем микробные клетки фиксируют. Это позволяет уменьшить структурные изменения в клетках после их гибели.

Метод окраски, при котором применяется лишь один краситель, называется простым.

Метод окраски, при котором применяется два и более реактива, называется сложным. В микробиологической практике этот метод имеет дифференциально-диагностическое значение.

Важным таксономическим признаком бактерий является их отношение к окраске по Граму. Оно связано с особенностями строения и состава клеточной стенки.

Для идентификации и дифференциации бактерий изучают не только морфологию, но и отдельные структурные элементы: капсула, спора, зёрна волютина, жгутики.

Споры – это специфическая форма существования спорообразующих бактерий. В основном это грамположительные бактерии палочковидной формы – бациллы или клостридии. В такой форме они длительно сохраняются в окружающей среде. При использовании окраски по методу Грама споры не окрашиваются и остаются бесцветными. Для их окраски используют агрессивные методы воздействия, приводящие к повышению проницаемости оболочки спор. С трудом воспринимая краску, споры противостоят и обратному процессу – обесцвечиванию. На этом основаны методы их окраски (по Ожешки, Тружильо).

Капсула – слизистое образование различного химического состава на поверхности клеточной стенки. Капсулы состоят в основном из водной фазы и полимеров полисахаридной (пневмококки) или полипептидной (бациллы сибирской язвы) природы. Капсула бактерий определяет их антифагоцитарную активность и является фактором вирулентности.

При окраске по методу Грама капсулы не видны ввиду низкого сродства к красителям. В связи с этим наличие капсул у бактерий определяют специальными, негативными методами. Капсулы становятся видимыми благодаря пространству, которое они занимают (по Гинсу, Зырянову).

Таксономическое значение для коринебактерий дифтерии имеет наличие внутриклеточных включений, например зёрен волютина. Зёрна волютина обладают метахромазией, т.е. свойством приобретать окраску не соответствующую цвету красителя. Например, метиленовой синькой они окрашиваются в красноватый или фиолетовый цвет. Специальным методом их окраски является метод Нейссера.

Некоторые виды бактерий имеют органеллы движения – жгутики. Жгутики состоят из белка – флагеллина, который по своей структуре относится к сократительным белкам типа миозина. В зависимости от количества и местоположения жгутиков бактерии подразделяются на монотрихи, лофотрихи, амфитрихи, перитрихи.

Не смотря на большую длину жгутиков до 5-10(20) мкм, они не могут быть обнаружены при помощи светового микроскопа в связи с ничтожно малым поперечным размером – 12-18 нм. Поэтому для их обнаружения необходимо использовать специальные методы окраски, позволяющие увеличить их размеры до величины разрешающей способности светового микроскопа (например, метод Лейфсона). О наличии жгутиков можно судить по наличию и характеру движения в нативных препаратах – «раздавленная» или «висячая» капля. Для микроскопии таких препаратов используют специальные методы микроскопии – тёмнопольную и фазово-констрастную микроскопии. Косвенным методом определения подвижности факультативно-анаэробных микроорганизмов является характер роста при посеве культуры в столбик полужидного агара. Если рост строго по уколу – культура не подвижна, если рост диффузный – культура подвижна.

5.3 Самостоятельная работа по теме:

• 
  Выполнение практических заданий – 104 мин.
  

1. 
   Приготовить фиксированный препарат из смеси культур № 1 и №2, окрасить по методу Грама.
   
2. 
   Промикроскопировать полученные препараты и провести идентификацию микроорганизмов по морфологическим и тинкториальным свойствам.
   

4 Промикроскопировать демонстрационные препараты (окраска по методу Грама) из культур стрептококков, бацилл сибирской язвы; провести идентификацию микроорганизмов по морфологическим и тинкториальным свойствам.

1. 
   Приготовить фиксированный препарат из культуры №3, окрасить по методу Зырянова, промикроскопировать. Полученный результат внести в протокол и сделать вывод.
   
2. 
   Промикроскопировать демонстрационные препараты, окрашенные по методу Тружильо, по методу Нейссера, по методу Лейфсона. Полученный результат внести в протокол и сделать вывод.
   

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

1. 
   Приготовление фиксированных препаратов из культур микроорганизмов, растущих на плотных питательных средах.
   

Приготовление окрашенного препарата из культуры микроорганизмов включает: 1) приготовление мазка, 2) высушивание мазка, 3) фиксацию, 4) окраску.

1. 
   Приготовьте предметное стекло, спиртовку, пробирку с физиологическим раствором, бактериологическую петлю и пробирки с исследуемыми культурами, растущими на плотных и (или) жидких питательных средах. Зажгите спиртовку, предварительно ее проветрив, приподняв фитиль и канюлю. Спиртовка должна находиться прямо перед Вами, на удобном для работы расстоянии. Для стерилизации бактериологическую петлю прокалите в пламени спиртовки, остудите сначала в воздухе в течение 2-3 с., затем о внутреннюю поверхность пробирки (ниже верхней трети длины). Заберите бактериологической петлей физиологический раствор (0,9% р-р NaCl) и нанесите каплю на чистое обезжиренное предметное стекло. Стекло должно находится в чашке Петри; категорически запрещается готовить мазки на предметном стекле, лежащем на столе! Вновь прокаленной и остуженной петлей возьмите немного биомассы, прикоснувшись к ней петлей. Культуру суспензируют в капле физиологического раствора до появления легкой мути, после чего остатки биомассы на петле необходимо высушить и сжечь в пламени спиртовки. Микробную взвесь на стекле распределите остуженной петлей тонким равномерным слоем на площади диаметром 1-1,5 см. После приготовления мазка петлю сразу обязательно прокалите и поставьте в штатив.
   

Препарат из культур №1 и №2 готовится с последовательным внесением исследуемых культур.

2. 
   Полученный препарат высушите на воздухе в чашке Петри. Запрещается покидать рабочее место и оставлять мазок без присмотра!
   
3. 
   Высушенный препарат зафиксируйте путем 3-х кратного проведения через пламя спиртовки мазком вверх так, чтобы общее время пребывания его в пламени было около 6 с. Контролем правильности фиксации препарата служит прикосновение стекла к тыльной стороне ладони; стекло должно быть горячим, а не теплым. В противном случае фиксацию необходимо повторить. После того, как стекло остынет, границы мазка обведите стеклографом с нижней стороны. Цели фиксации: инактивация микроорганизмов; прикрепление микроорганизмов к стеклу; улучшение проникновения красителя внутрь микробной клетки.
   

4. Препарат из смеси культур №3 и №4 окрасьте по методу Грама: поместите на препарат бумажку, пропитанную раствором генцианвиолета (модификация Синева), смочите ее водой, через 1-2 мин бумажку снимите, а краску слейте; налейте раствор Люголя на 1 мин, слейте; обесцветьте 96спиртом в течение 10-30 сек. до прекращения отхождения струек краски; промойте водой; докрасьте водным фуксином (1:10) в течение 1-2 мин, промойте водой; высушите фильтровальной бумагой.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый, а грамотрицательные – в розово-красный цвет, что связано с особенностями строения и состава клеточной стенки.

Для получения достоверного результата при окраске по методу Грама необходимо точно соблюдать правила приготовления мазков, продолжительность окраски и обесцвечивания спиртом. Толстые, густые мазки будут окрашиваться неравномерно и заведомо грам (-) бактерии могут окраситься грамположительно. При окраске тонких мазков основная ошибка заключается в «переобесцвечивании» мазка спиртом и поэтому грам (+) бактерии окрашиваются грамотрицательно. Имеет значение и возраст культуры. В старых культурах грам (+) бактерии могут окраситься грамотрицательно.

5. Приготовление препарата из культуры №3 с плотной питательной среды. Окраска по Зырянову для выявления капсул.

Приготовьте 2 стекла: обычное предметное и стекло со шлифованным краем. На обезжиренное стекло (ближе к его правому краю) нанесите каплю сыворотки, внесите в нее исследуемую культуру №1 и тщательно суспензируйте. После чего сделайте тонкий мазок. Для этого прикоснитесь к капле сыворотки с культурой краем шлифованного стекла, установленного под углом 45 и легким, быстрым движением, прижимая шлифованное стекло, продвиньте его влево по предметному стеклу, не доходя 1-1,5 см до края. Мазок высушите на воздухе, зафиксируйте в смеси Никифорова (1 часть спирта + 1 часть эфира) в течение 15 мин, после чего окрасьте карболовым фуксином Циля, погрузив его в стакан с краской на 5-10 с. Затем препарат осторожно промойте водой, промикроскопируйте с иммерсионной системой. Полученный результат занесите в протокол и сделайте вывод.

Ожидаемый результат: в препарате на розовом фоне видны бактерии (описать их морфологию), окруженные неокрашенным ободком - капсулой. Метод Зырянова относится к негативным методам выявления капсул; которые в виду высокого содержания воды обладают низким сродством к красителям.

6. Микроскопия демострационных препаратов:

Окраска по Тружильо для выявления спор.

Споры бактерий окрашиваются в зеленый цвет, а вегетативные формы – в розовый. Споры бактерий имеют многослойную непроницаемую оболочку, поэтому для их окраски используют «агрессивные» методы, предусматривающие прогревание (метод Тружильо), прогревание и протравливание кислотой (метод Ожешко, метод Циля-Нильсена).

Окраска по Нейссеру для выявления зерен волютина.

Зерна волютина окрашиваются в темно-синий или черный цвет, а клетка – в желтый. Это связано с тем, что зерна волютина, содержащие полифосфаты, имеют в отличие от цитоплазмы щелочную реакцию и избирательно воспринимают уксусно-кислую синьку.

Окраска по Лейфсону для выявления жгутиков.

У большинства бактерий толщина жгутиков не превышает 10-30 нм, т. е. жгутики находятся за пределами разрешающей способности обычного микроскопа. Поэтому в основе всех методов их выявления, в том числе и метода Лейфсона, лежит искусственное увеличение размеров жгутиков за счет нанесения протравы, что позволяет увидеть их при иммерсионной микроскопии.

2. 
   Освоение техники микроскопии с иммерсионной системой.
   

Микроскопию окрашенных препаратов в микробиологической практике производят с иммерсионным объективом, который обладает более высокой разрешающей способностью, чем сухой. При этом обязательным условием является погружение объектива в масло, показатель которого совпадает с показателем преломления стекла (1,52). Для этих целей применяют так называемое иммерсионное масло – кедровое или терпеновое масло. В этом случае пучок света, вышедший за пределы предметного стекла, не рассеивается и лучи, не меняя своего направления, попадают в объектив. Иммерсионный объектив дает увеличение х90 (х100), а в сочетании с окуляром х10 получается увеличение в 900 (1000) раз.

Порядок работы с иммерсионным микроскопом:

1. 
   Поднять конденсор вверх до уровня предметного столика, поставить зеркало плоской стороной.
   
2. 
   Поставить объектив х8 и, глядя в окуляр, движением зеркала добиться наилучшего освещения поля зрения.
   
3. 
   На предметное стекло с микропрепаратом нанести каплю иммерсионного масла, положить его на предметный столик и установить объектив х90 (х100). Под контролем глаза, глядя сбоку, осторожно опустить, пользуясь макровинтом, тубус до погружения объектива в иммерсионное масло. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может привести к повреждению фронтальной линзы. Затем, наблюдая в окуляр, при осторожных поворотах макровинта находят контуры микробных клеток и фокусируют изображение микровинтом, вращая его в пределах только одного оборота!.
   

По окончании микроскопии поднимите тубус, снимите препарат и поместите его в дезинфицирующий раствор; осторожно сотрите масло с иммерсионного объектива, опустите конденсор и переведите револьвер на объектив х8.

Изучите приготовленный препарат под микроскопом. Обратите внимание на форму микроорганизмов (кокки, палочки, извитые), на их размеры, взаимное расположение и окраску. При увеличении микроскопа около 900, бактерии, имеющие размер 1 мкм, будут выглядеть равными, примерно 1 мм. Таким образом, можно приблизительно определить размеры бактериальной клетки. Зарисуйте увиденные в поле зрения микроорганизмы в протоколе, соблюдая пропорции клеток. Опишите их, сделайте вывод.

После окончания работы необходимо привести рабочее место в порядок, сдать его дежурному и вымыть руки; в случае необходимости обработать руки дез.раствором.

3. 
   Промикроскопировать демонстрационные препараты стрептококков, бацилл сибирской язвы, окрашенные по методу Грама и полученные результаты занести в протокол.
   

Ожидаемые результаты: Streptococcus spp. Препарат из бульонной культуры. Грам (+) полиморфные кокки диаметром 0,5-1,5 мкм, расположенные, в основном, цепочками.

Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы, препарат из бульонной культуры. Грам (+) крупные палочки (5-10 х 1-2 мкм) с обрубленными концами, расположенные длинными цепочками в виде “бамбуковой трости”.
ОБРАЗЕЦ ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ

Протокол-отчет№ ____от________Ф. И. О.____________№ группы________

ТЕМА:

Цель

Метод и его содержание

Полученные результаты

Выводы

5.4 Итоговый контроль знаний:

1. 
   Классификация царства прокариот.
   
2. 
   Морфология бактерий: форма, величина, взаимное расположение.
   
3. 
   Простые и сложные методы окраски; их информативность
   
4. 
   Метод Грама: методика и значение.
   
5. 
   Типы микроскопов (биологический, люминесцентный, электронный и др.) и специальные методы микроскопии (темнопольная, фазово-контрастная).
   
6. 
   Устройство биологического микроскопа. Разрешающая способность микроскопа.
   
7. 
   Правила работы с иммерсионной системой.
   

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия:

Вопросы для самоконтроля:

1. 
   Назовите отличительные признаки микроорганизмов, как представителей царства прокариот.
   
2. 
   Какие свойства микроорганизмов лежат в основе микроскопического метода исследования?
   
3. 
   Назовите и обоснуйте какие методы окраски микроорганизмов (простые или сложные) являются более информативными.
   
4. 
   Обоснуйте дифференциально-диагностическое значение метода Грама в микробиологической практике.
   
5. 
   Обоснуйте необходимость использования иммерсионной системы для изучения микроорганизмов.
   

7. Рекомендации по выполнению НИРС:

Темы рефератов

1. 
   История открытия микроорганизмов.
   
2. 
   Особенности мира микробов
   
3. 
   Обязательные структурные элементы бактериальной клетки, выполняемые ими функции.
   
4. 
   Значение L-трансформации в патогенезе инфекционных заболеваний.
   

8. Рекомендованная литература по теме занятия:

Обязательная:

1. 
   Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: учеб. пособие / О.К. Поздеев – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 768 с.
   

Дополнительная:

1. 
   Ярилин, А.А. Имунология: учебник / А.А. Ярилин – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с.
   
2. 
   Гиллеспи, С.Х. Наглядные инфекционные болезни и микробиология / С.Х. Гиллеспи, К.Б. Бамфорд – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 136 с.
   
3. 
   Хаитов, Р.М. Иммунология: учебник / Р.М. Хаитов – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 528 с.
   
4. 
   Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: 1 т.: учебник / ред. В.В. Зверев [и др.] – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.- 448 с.
   
5. 
   Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: 2 т.: учебник / ред. В.В. Зверев [и др.] – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.- 477 с.