Методические указания для обучающихся по дисциплине «Микробиология, вирусология»

Собеседование по контрольным вопросам

1. 
   Классификация и морфо-биологические свойства сальмонелл.
   
2. 
   Факторы вирулентности сальмонелл.
   
3. 
   Особенности экологии, эпидемиологии и патогенеза брюшного тифа, паратифов А и В, пищевых токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии.
   
4. 
   Материалы и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых сальмонеллами.
   
5. 
   Специфическая профилактика и терапия заболеваний, вызываемых сальмонеллами.
   

5.2. Основные понятия и положения темы.

Сем. Enterobacteriaceae, род Salmonella, виды S. typhi – возбудитель брюшного тифа, S. paratyphi A - возбудитель паратифа А, S. schottmuelleri - возбудитель паратифа В. Остальные сальмонеллы – возбудители сальмонеллезов; наиболее часто – S. enteritidis, S. typhimurium, S. choleraesuis и др.

Сальмонеллы – грамотрицательные палочки с закругленными концами, размером 2-4х0,5 мкм, подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков, спор и капсул не образуют.

Факультативные анаэробы, хорошо растут на простых питательных средах. Образуют полупрозрачные мелкие колонии, бесцветные с ровным краем, слизистые; у S. schottmuelleri. – с характерным валообразованием. На бульоне рост в виде помутнения и осадка. Оптимум Т-37°С; рН-7,2.

Сальмонеллы имеют сложное антигенное строение и подразделяются по классификации Кауфмана-Уайта на 65 серогрупп и более 2000 сероваров. У сальмонелл имеются: О-антиген - соматический, термостабильный, ЛПС; Н-антиген - жгутиковый, термолабильный, белковый. Н-антиген подразделяют на 2 фракции: специфическую фазу 1 и неспецифическую 2. О-антиген специфичен. У S. typhi еще имеется поверхностный Vi-антиген, его содержание не постоянно у разных штаммов.

По новой классификации сальмонеллы относятся к двум видам: S. bongori и S. enterica. Последний разделяется на 5 подвидов, обзначаемых собственными именами и цифрами: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), houtenae (IV), indica (V). Для человека патогенны первые два подвида, причем подвид enterica (I) включает в себя большую часть известных в настоящее время сероваров сальмонелл (1400 из 2500). Соответственно классификации сальмонеллы следует называть, включая вид и серовар. Например, S. enterica серовар Enteritidis; S. enterica серовар Typhi. Однако в практике допустимо сокращенное название, включающее только серовар - S. Enteritidis или S. Typhi.

Возбудители брюшного тифа ферментируют глюкозу, манит, мальтозу до кислоты, а паратифов – до кислоты и газа. Не образуют индол, не ферментируют лактозу, мочевину, сахарозу. Сероводород образуют S. Тyphi и S. Schottmuelleri. «Желчелюбивы». Возбудители сальмонеллезов по биохимической активности соответствуют возбудителю паратифа В.

Факторы вирулентности сальмонелл.

К числу факторов относятся относятся пили (адгезия), Vi-антиген (защита от фагоцитоза, комплемента), белки наружной мембраны, эндотоксин.

Особенности экологии, эпидемиологии и патогенеза брюшного тифа, паратифов А и В, пищевых токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии.

Брюшной тиф, паратифы А и В. Источником является больной человек и бактерионоситель; в случае паратифов Аи В – молодняк крупного рогатого скота и птиц. Механизм передачи - фекально-оральный; передается контактным и алиментарным путями.

Через ротовую полость возбудитель попадает в тонкий кишечник и здесь размножается в пейеровых бляшках и солитарных фолликулах. В конце инкубационного периода возбудитель поступает в кровь (бактериемия) и вызывает лихорадку; помрачение сознания; характерна розеолёзная сыпь. С кровью возбудитель разносится по организму и локализуется в лимфоидной ткани внутренних органов и в желчном пузыре (стадия паренхиматозной диффузии). Из желчи вторично поступают в тонкую кишку и инфицируют сенсибилизированную лимфоидную ткань, что сопровождается образованием специфических язв (аллергическо-выделительная стадия). В результате фагоцитоза и лизиса сальмонелл освобождается эндотоксин, который вызывает интоксикацию организма. С конца 2-й недели заболевания сальмонеллы выделяются с фекалиями и мочой больного. Бактерионосительство может сохраняться длительно после выздоровления (месяцы или годы). Это объясняется развитием хронического процесса в желчном пузыре. После выздоровления образуется прочный иммунитет, обусловленный специфическими антителами.

Пищевые токсикоинфекции. Заражение происходит при употреблении в пищу мяса кур, крупного рогатого скота, свиней, а также яиц. Инфицирование может быть прижизненным или происходить при убое, разделки туш, при хранении, транспортировке и приготовлении. Условием развития заболевания является размножение и накопление сальмонелл в готовом блюде. При попадании в кишечник сальмонеллы разрушаются с освобождением эндотоксина, оказывающего неспецифическое полифункциональное действие (нарушение функций нервной, СС и пищеварительной систем). Кроме того, сальмонеллы продуцируют энтеротоксин, приводящий к нарушению водно-солевого обмена с развитием диареи и обезвоживания организма. Заболевание обычно протекает в течение 3-5 дней. Иммунитет малонапряженный.

Материалы и методы микробиологической диагностики заболеваний, вызываемых сальмонеллами.

Для диагностики используют бактериологический и серологический методы.

Диагностика брюшного тифа и паратифов А и В.

Выбор материала для бактериологического исследования зависит от периода развития инфекционного процесса. В ранние сроки заболевания и в течение всего периода лихорадочного состояния, сопровождающегося бактериемией, используют для посева кровь из вены. В более поздние сроки заболевания берут для анализа желчь, испражнения, мочу, в некоторых случаях - рвотные массы, соскоб из розеол, пунктат костного мозга. При летальных исходах используют кусочки паренхиматозных органов, кровь из сердца, желчь, мезентериальные лимфоузлы, содержимое и отрезок тонкой кишки. Наиболее ранним и достоверным методом бактериологической диагностики является выделение гемокультуры.

Среды и правила посева крови. Кровь засевают в элективные жидкие среды в соотношении 1:10, чтобы подавить бактерицидное действие крови, в количестве не менее 5-10 мл. Для посева используют 10% желчный бульон, среду Раппопорта или желчь чистую. Желчь в питательных средах способствует росту тифозных бактерий, подавляет действие антител и предотвращает свертывание крови. Посевы культивируют при 37°С в течение 5-7 дней. Ежедневно проверяют рост на средах. При появлении роста делают посев на среду Эндо для контроля чистой культуры и выделяют чистую гемокультуру путем посева на среду Клиглера.

Этапы работы с чистой культурой. Обязательным этапом диагностики является идентификация гемокультуры по антигенным свойствам. Для этого ставят последовательно:

• 
  РА с поливалентной сальмонеллезной сывороткой АВСДЕ, определяют родовую принадлежность;
  
• 
  РА отдельно с монорецепторными О-сыворотками (определяют групповую принадлежность);
  
• 
  РА с монорецепторными Н-сыворотками (определяют видовую принадлежность).
  
• 
  Изучают биохимические свойства.
  
• 
  С целью эпидемиологических исследований проводят фаготипирование гемокультуры с брюшнотифозными бактериофагами.
  

Учитывая результаты всех тестов идентифицируют возбудителя.

С целью диагностики бактерионосительства возбудителя брюшного тифа, а также для проверки результатов лечения проводят используют серологический метод путем постановки РНГА с сывороткой обследуемого и эритроцитарный Vi-диагностикумом. Эритроцитарный Vi-диагностикум представляет собой взвесь эритроцитов человека 1(0) группы, обработанных формалином и сенсибилизированных Vi-антигеном брюшнотифозных микробов в фосфатно-буферном изотоническом р-ре хлорида натрия. Для постановки Vi-агглютинации испытуемую сыворотку разводят от 1:10 до 1:320-1:640. При положительной реакции проводят бактериологическое исследование желчи.

Серологические исследования широко применяют для диагностики тифо-паратифозных заболеваний. В конце 1-ой, начале 2-ой недели заболевания в крови накапливается достаточное количество антител, наличие которых выявляют реакцией Видаля. Ее ставят с брюшно-тифозными и паратифозными А и В диагностикумами. Диагностический титр в р. Видаля для взрослых 1:200,для детей 1:100 (у непривитых). Более важное значение для диагностики имеет нарастание титра в течении болезни.

РА Видаля может быть положительной при любом лихорадочном заболевании, если больной прежде перенес брюшной тиф (анамнестический Видаль).0на может быть положительной также в течении некоторого времени после прививок (прививочный Видаль).

Специфичность РА Видаля может быть выявлена при постановке ее в динамике. Ни анамнестические, ни прививочные агглютинины не обнаруживают нарастания титра при повторной постановке реакции. Наоборот, в этих случаях может наблюдаться падение титра агглютининов. Увеличение титра антител отмечается только при остром заболевании.

При брюшном тифе и паратифах р. Видаля может носить групповой характер, т.к. в сыворотке больного имеются агглютинины не только против специфических, но и групповых антигенов, встречающихся и у других микробов. Для получения достоверных результатов у больных повторно берут кровь через 5-6 дней, ставят р. Видаля и выявляют нарастание титра антител. Накопление антител в динамике отмечается только при остром заболевании.

При учете р. Видаля необходимо помнить, что содержание О- и Н-антител в разные периоды болезни неодинаковы.0-антитела накапливаются в разгар заболевания и исчезают к моменту выздоровления. Н-антитела появляются к концу заболевания и сохраняются в течении длительного времени, как свидетели перенесенного заболевания.

Vi-антителам в инфекционном процессе не придают диагностического значения, т.к. Vi-антитела после полного выздоровления быстро исчезают. Но при наличии брюшно-тифозного носительства они присутствуют постоянно. Поэтому РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом применяются для выявления бак.носительства.

Чувствительна и специфична реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитарными О- и Vi-диагностикумами. Диагностическое значение имеет реакция с О-диагностикумом, т.к. антитела к Vi-антигену невысокие.

При паратифах и прочих сальмонеллезах динамика реакции Видаля сохраняет основные закономерности, описанные при брюшном тифе, но характеризуется несколько меньшей вероятностью. Однако в связи с отсутствием прививочных реакций к сальмонеллам титр 1:100 может быть оценен как положительный результат реакции.

Лабораторная диагностика пищевых токсикоинфекций осуществляется с использованием бактериологического метода.

Специфическая профилактика и терапия заболеваний, вызываемых сальмонеллами.

Для специфической профилактики брюшного тифа используют убитую и вакцину с Vi-антигеном.

Брюшнотифозный поливалентный бактериофаг назначают контактактным или больным для профилактики формирования бактерионосительства. Таблетированный бактериофаг имеет кислотоупорную оболочку. При сальмонеллезах используют поливалентный бактериофаг.

5.3. Самостоятельная работа по теме:

1. 
   Провести бактериологическое исследование крови с целью установления этиологии заболевания:
   
   1. 
      Учесть и оценить результаты посева крови обследуемого с подозрением на брюшной тиф.
      
   2. 
      Учесть и оценить результаты посева накопительной культуры на висмут-сульфит агар (ВСА).
      
   3. 
      Изучить выделенную от обследуемого культуру на среде Клиглера (демонстрация) и МПА:
      

• 
  учесть биохимическую активность культуры на среде Клиглера;
  
• 
  приготовить фиксированный препарат из культуры на МПА, окрасить по Граму, промикроскопировать;
  
• 
  поставить и учесть результаты РА на стекле с исследуемой культурой на МПА и поливалентной сальмонеллезной сывороткой групп А, В, С, Д, Е;
  
• 
  оценить полученные результаты.
  

1. 
   Учесть и оценить результаты изучения биохимических («пестрый ряд»), антигенных (РА с адсорбированными монорецепторными сальмонеллезными О- и Н-сыворотками) свойств.
   
2. 
   На основании полученных результатов сделать вывод, заполнить бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.
   
1. 
   Учесть и оценить результаты РА Видаля с сывороткой обследуемого с подозрением на брюшной тиф и брюшнотифозными, паратифозными А и В диагностикумами.
   
2. 
   Учесть и оценить результаты РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом и сыворотками обследуемых из декретированной группы (работники пищевой промышленности).
   
3. 
   Изучить и описать в протоколе биопрепараты: адсорбированные агглютинирующие поливалентные групп А, В, С, Д, Е, монорецепторные О- и Н-сыворотки; брюшнотифозный бактериофаг; сальмонеллезный бактериофаг; сальмонеллезные диагностикумы, брюшнотифозная вакцина.
   

Методические указания к выполнению исследовательского задания:

I. Проведите бактериологическое исследование крови обследуемого с подозрением на брюшной тиф:

1 этап. Выделение гемокультуры является наиболее ранним и достоверным методом диагностики брюшного тифа, паратифов А и В. В начале болезни для исследования забирают, соблюдая правила асептики, 5-10 мл крови из локтевой вены; в более поздние сроки – 15-20 мл. Кровь сразу засевают на желчный бульон или среду Раппопорт, соблюдая соотношение крови и питательной среды 1:10, для подавления бактерицидных свойств крови. Флаконы маркируют и до транспортировки в лабораторию содержат при комнатной температуре, но не в холодильнике! Посевы инкубируют при 37 в течение 7 дней, каждый день просматривая посевы для выявления наличия роста.

Правила забора крови: медперсоналу при заборе крови необходимо соблюдать меры индивидуальной защиты (например, использование резиновых перчаток), предусмотренные при работе с кровью. Кожу над пунктируемой веной тщательно обрабатывают 70% этиловым спиртом, затем 1-2% настойкой йода 30 с (от центра будущего прокола по направлению к периферии). Обработанному участку кожи дают высохнуть, затем производят венопункцию, после чего вновь обрабатывают участок 70% этиловым спиртом для удаления избытка йода, во избежание раздражения кожи.

2 этап. Учтите и оцените результаты посева крови обследуемого на среде Раппопорта (желчном бульоне).

Среда Раппопорта содержит желчный бульон, глюкозу или маннит, индикатор Андреде и поплавок. Она является для сальмонелл средой накопления, а также дифференциально-диагностической средой. При размножении брюшнотифозных бактерий в среде Раппопорта в результате расщепления глюкозы (маннита) до кислоты меняется цвет среды с желтого на красный, а в случае образования не только кислоты, но и газа, что характерно для паратифозных бактерий, последний накапливается в поплавке, вытесняя часть питательной среды. Из среды накопления при наличии признаков роста делают высевы на среду Эндо (Левина) и параллельно на среду Клиглера (МПА), так как в положительных случаях растет, как правило, чистая культура. В случае загрязнения среды накопления при нарушении правил взятия крови, среда Эндо позволяет выделить чистую культуру. Посевы инкубируют при 37 18-24 ч.

3 этап. Оцените результаты посева накопительной культуры на среду Эндо (Левина), проведите первичную идентификацию выделенной гемокультуры с учетом морфо-тинкториальных, биохимических (на среде Клиглера) и антигенных свойств. Для изучения морфо-тинкториальных и антигенных свойств используйте гемокультру на скошенном МПА.

На среде Клиглера S. typhi ферментирует глюкозу (маннит) с образованием кислоты (пожелтение столбика агара), не расщепляет лактозу (окраска скошенной части агара не изменяется) и образует H₂S (почернение среды). Паратифозные сальмонеллы ферментируют глюкозу (маннит) с образованием кислоты и газа, поэтому меняется не только цвет столбика, но и происходит его разрыв.

Сальмонеллы – это грамотрицательные полиморфные палочки, размером, расположенные, в основном, одиночно.

С чистой культурой грамотрицательных палочек, выросшей на обычном агаре, соответствующих по биохимии сальмонеллам, поставьте РА на стекле с адсорбированной поливалентной сальмонеллезной сывороткой групп А, В, С, Д, Е (см. занятие № 10). Положительный результат свидетельствует, что культура принадлежит к р. Salmonella. Для окончательной идентификации культуру сеют в среды “пестрого ряда” и ставят РА на стекле с соответствующими адсорбированными монорецепторными О- и Н-сыворотками (демонстрация).

4 этап. Учтите результаты «пестрого ряда». На основании всех полученных результатов определите видовую принадлежность выделенной гемокультуры; результаты занесите в протокол, заполните бланк-направление и бланк-ответ из бак. лаборатории.

II. Учтите и оцените результаты РА Видаля с сывороткой обследуемого с подозрением на брюшной тиф и брюшнотифозными, паратифозными А и В диагностикумами.

Критерием оценки результатов РА Видаля при однократно взятой сыворотке является диагностический титр, равный у невакцинированных взрослых 1:200, а у невакцинированных детей – 1:100 (см. занятие № 10).

III. Учтите и оцените результаты РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом и сыворотками обследуемых из декретированной группы (работники пищевой промышленности).

РНГА с эритроцитарным Vi-диагностикумом используется чаще всего для выявления бактерионосительства S. typhi. Диагностический титр при оценке результатов равен 1:40(см. занятие № 10).

IV. Изучите и опишите в протоколе биопрепараты: адсорбированные агглютинирующие поливалентные групп А, В, С, Д, Е, монорецепторные О- и Н-сыворотки; брюшнотифозный бактериофаг; сальмонеллезный бактериофаг; сальмонеллезные диагностикумы, брюшнотифозная вакцина.
5.4. Итоговый контроль знаний:

• 
  ответы на вопросы по теме занятия
  

1. 
   Обоснуйте выбор материала и методов микробиологической диагностики в зависимости от периода развития брюшного тифа, паратифов А и В и особенностей патогенеза их развития.
   
2. 
   Назовите правила забора крови при выделении гемокультуры с целью диагностики брюшного тифа, паратифов А и В.
   
3. 
   Обоснуйте выбор материалов для выявления бактерионосительства возбудителя брюшного тифа.
   
4. 
   Назовите тесты дифференциации возбудителей брюшного тифа, паратифов А и В.
   
5. 
   Назовите основных возбудителей пищевых токсикоинфекций сальмонеллезной этиологии.
   
6. 
   Особенности эпидемиологии сальмонеллезной пищевой токсикоинфекции.
   

• 
  решение ситуационных задач.
  

ЗАДАЧА №1. При постановке РА Видаля с сыворотками обследуемых в 4-х рядах получены следующие результаты:

а) титр РА с брюшнотифозным 0-диагностикумом 1:1600, с брюшнотифозным Н-диагностикумом – 1:400, с паратифозным А ОН-диагностикумом – 1:100, с паратифозным В ОН-диагностикумом – 1:50;

б) титр РА с брюшнотифозным 0-монодиагностикумом 1:100, с брюшнотифозным Н-монодиагностикумом – 1:800, с паратифозным А и В ОН-диагностикумами – 1:50;

в) титр РА с брюшнотифозным 0-монодиагностикумом 1:100, с брюшнотифозным Н, паратифозными А и В ОН-диагностикумами – 1:200.

Как интерпретировать полученные результаты?

ЗАДАЧА №2. В инфекционное отделение ГКБ №6 госпитализированы 7 человек с клиническим диагнозом: Острый гастроэнтерит? Сальмонеллёз? Из анамнеза: пострадавшие отмечали день рождения в кафе. Через 7-10 часов у них появилась рвота, частый жидкий стул, повышение температуры до 38^о. Употребляли в пищу рыбное ассорти, салат из помидор, куриное заливное, шашлык, фрукты.

1. 
   Какой материал и какой метод нужно использовать для подтверждения сальмонеллезной этиологии заболевания?
   
2. 
   Что могло послужить фактором передачи инфекции, как это могло произойти?
   
3. 
   Какие сальмонеллы наиболее часто вызывают пищевые микробные отравления?
   

6. Домашнее задание для уяснения темы занятия

(См. контрольные вопросы по теме занятия, тестовые задания, ситуационные задачи).
7. Рекомендации по выполнению НИРС, в том числе список тем, предлагаемых кафедрой.

Темы рефератов:

1. 
   Роль сальмонелл в развитии внутрибольничных инфекций.
   
2. 
   Внекишечные проявления сальмонеллёзной инфекции.
   
3. 
   Заболеваемость пищевыми токсикоинфекциями сальмонеллёзной этиологии в РФ и Красноярском крае на современном этапе.
   

8. Рекомендованная литература по теме занятия:

Обязательная:

1. 
   Поздеев, О. К. Медицинская микробиология: учеб. пособие / О.К. Поздеев – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 768 с.
   

Дополнительная:

1. 
   Ярилин, А.А. Имунология: учебник / А.А. Ярилин – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 752 с.
   
2. 
   Гиллеспи, С.Х. Наглядные инфекционные болезни и микробиология / С.Х. Гиллеспи, К.Б. Бамфорд – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 136 с.
   
3. 
   Хаитов, Р.М. Иммунология: учебник / Р.М. Хаитов – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – 528 с.
   
4. 
   Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: 1 т.: учебник / ред. В.В. Зверев [и др.] – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.- 448 с.
   
5. 
   Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: 2 т.: учебник / ред. В.В. Зверев [и др.] – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.- 477 с.