Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium -опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки
Скачать 340.05 Kb.
|
| На правах рукописи Вячеславова Алиса Олеговна Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки Специальность 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Голденкова-Павлова Ирина Васильевна Официальные оппоненты: Дейнеко Елена Викторовна доктор биологических наук, профессор, Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, лаборатория биоинженерии растений, заведующая лабораторией Демин Илья Николаевич кандидат биологических наук, Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева Российской академии наук, лаборатория зимостойкости, научный сотрудник Ведущая организация: Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Защита состоится « 14 » ноября 2012 года в 16-30 на заседании диссертационного совета Д220.043.10 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К.А. Тимирязева по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, тел./факс: (499) 976-24-92, e-mail: genetics@timacad.ru Автореферат разослан « 12 » октября 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета Л.С. Большакова
Актуальность проблемы. В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения фундаментальных исследований по изучению физиологической роли растительных генов и для решения прикладных задач по созданию устойчивых форм сельскохозяйственных культур, а также для продукции рекомбинантных белков в растениях. Успех в этих направлениях, прежде всего, связан с эффективностью экспрессии перенесенного гена (трансгена) в растениях. Эффективность экспрессии трансгена обуславливается рядом факторов: кодоновым составом трансгена; регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию; интеграцией трансгена в определенные участки генома растений и рядом других. Сейчас, помимо стабильной экспрессии целевых генов исследователями широко используется транзиентная экспрессия этих генов как эффективный подход для изучения регуляторных элементов и физиологической роли генов растений, а также для использования растений как продуцентов целевых белков. При транзиентной экспрессии с использованием агробактерий, в основном, используют обычные экспрессионные векторы, полученные на основе бинарных Ti-плазмид, которые, помимо целевого гена содержат и селективные гены. Для преодоления эффекта «замолкания» трансгена исследователи используют подход, основанный на ко-трансформации растений вектором, несущий ген белка р19 вируса томатов, супрессор посттранскрипционного замолкания генов. Несмотря на значительные успехи в области создания и изучения трансгенных растений, наши познания в отношении генетических факторов, которые оказывают влияние на эффективность экспрессии генов в растениях, еще весьма ограничены. Следует подчеркнуть, что решение важных научных и прикладных задач с использованием экспрессии гетерологичных генов в растениях затруднено, прежде всего, за счет значительных пробелов в понимании генетических детерминант, которые обуславливают эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях. Следует также отметить, что важную роль в исследованиях по созданию и изучению трансгенных растений играют экспрессионные вектора, используемые для трансформации растений. Сейчас предложены и используются целый спектр экспрессионных векторов для трансформации растений, однако, наряду с преимущества эти вектора имеют и недостатки, которые могут сказаться на эффективности экспрессии трансгена. Цель исследования: провести сравнительное изучение экспрессии гетерологичных генов в растениях различных родов и выяснить, какие генетические детерминанты являются ключевыми в обеспечении эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
Научная новизна работы. Проведен сравнительный анализ генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях. Впервые экспериментально показано, что GC-богатые последовательности в 5’-концевой области генов вносят значительный вклад в уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях. Показана возможность достоверного увеличения экспрессии гетерологичных генов за счет использования лидерных сигналов транспорта и локализации их белковых продуктов в эндоплазматическом ретикулуме. Показана взаимосвязь между кодоновым составом гетерологичных генов и уровнем их экспрессии в растительных клетках. Апробация результатов работы. Результаты проведенных исследований были представлены на международных и российских конференциях: Международная научная конференция «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Минск, 2010), III Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2010), 2-я Международная школа-конференция молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2011), International conference «Plant Transformation Technologies II» (Vienna, 2011); конференция «Современные аспекты генетической инженерии растений» (Киев, 2011); 12-я научная конференция молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012); Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012). Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 60 рисунков. Список цитируемых литературных источников включает 269 наименований.
Глава 1. Обзор литературы. В обзоре литературы приведены современные данные о подходах к экспрессии гетерологичных генов в растениях, а также проведен анализ особенностей растительных экспрессионных векторов. Особое внимание уделено исследованию генетических детерминант, обуславливающих высокую экспрессию перенесенного гена (трансгена) на разных уровнях: транскрипция, трансляция, стабильность белка. Глава 2. Материалы и методы. В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые выполнялись согласно методическому руководству Sambrook et al. (2001). В работе использовали растения табака Nicotiana benthamiana и Nicotiana excelsior, выращенные до 6 недельного возраста. В работе использованы штамм E. coli XL1-Blue (“Stratagene”, США) и штамм агробактерий GV3101. Клетки E. coli выращивали при 370C, а клетки агробактерий - при 280C на среде LB. Процедура агроинфильтрации проводилась по методу инъекции агробактериальной смеси с помощью шприца в листовую пластину. Анализ полученных растений после агроинфильтрации проводили на четвертые сутки путем выделения суммарного растворимого белка из листьев путем растирания свежей или замороженной растительной ткани в жидком азоте в 50 мМ Tris-HСl (pН=8.0) буфере. Активность лихеназы определяли, используя лихенан (Megazyme, Ирландия) в качестве субстрата. Определение восстанавливающих сахаров, освобождающихся из субстрата, проводили по методу Вуда и Бхат [Wood T.M. et al., 1988]. Концентрацию восстанавливающих сахаров определяли по калибровочному графику, построенному по глюкозе. За единицу активности принимали количество фермента, образующее 1 мкмоль восстанавливающих сахаров (как эквивалент глюкозы) за 1 мин (в пересчете на 1 мг белка). Количество белка в препаратах определяли по методу Bradford [Bradford, M. A., 1976], используя Bio-Rad dye reagent (BioRad, США) и БСА (Sigma, США) для построения калибровочной кривой. Энзимограммы получали окрашиванием геля после разделения белков, содержащего лихенан согласно методу Тизер и Вуд [Teather R. et al., 1982], с некоторыми модификациями. Определение активности лихеназы на чашках проводили по методу Бегуин [Begiun P., 1983]. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы «Statistica for Windows 9.0» (применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок, Р=0,05) и графопостроителя «Microsoft Office Excel 2007». Глава 3. Результаты и обсуждения. 3.1 Поиск генетических детерминант, позитивно влияющих на уровень транскрипции, трансляции и стабильности целевых белков в растениях Ключевым регуляторным элементом, от которого зависит уровень транскрипции, является промотор, который, как правило, расположен в 5’-концевой области генов. Для поиска промоторов растений, которые могут позитивно сказаться на экспрессии гетерологичного гена, был проведен поиск с использованием базы данных FlowerPlantGene и сопровождающего программного обеспечения. Для этого проведен сравнительный анализ данных по уровню экспрессии генов Arabidopsis и данные о генах этого растения. Проведенный анализ позволил установить, что наивысший уровень экспрессии выявлен для гена AT1G67090, кодирующего малую субъединицу рибулозо-бисфосфат карбоксилазы. Следует отметить, что ген AT1G67090 относится к генам «домашнего хозяйства», которые обычно характеризуются высоким уровнем экспрессии. На основании этого, промотор гена AT1G67090, имеющий наивысший уровень экспрессии в растении в целом, и в листьях, в частности, может быть использован как регуляторный элемент, позитивно влияющий на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях. В качестве потенциальных промоторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии, могут быть использованы и промоторы вирусов. Один из таких промоторов – 35S РНК CaMV (промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты) - широко используется как промотор для высокоэффективной экспрессии гетерологичных генов в растениях. Другими регуляторными последовательностями, которые могут позитивно повлиять на уровень транскрипции генов в растениях, являются GC-богатые последовательности. Известно, что в геномах млекопитающих имеются протяженные последовательности, обогащенные GC-парами, которые обозначают как CpG-островки. CpG-островки представляют собой GC-богатые последовательности (60-70% содержания GC), длиной не менее 200 п.о. с большим числом динуклеотидов CpG. CpG-богатые области, которые ассоциированы с 5’-концевой областью генов, в частности, генов «домашнего хозяйства», описаны и у растений [Meza et al., 2002]. Для выяснения частоты встречаемости CpG-богатых областей в геноме растений был проведен биоинформационный поиск с использованием данных и программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene. База данных FlowerPlantGene содержит информацию о полноразмерных геномах растений (Arabidopsis и кукуруза) и программное обеспечение для поиска и отображения локализации произвольных последовательностей на хромосоме и в блоках произвольной длины. Как было показано по результатам анализа, в геноме Arabidopsis thaliana GC-богатые последовательности не представлены, по сравнению с геномом кукурузы. Среднее содержание GC-пар в геноме арабидопсиса составляет в среднем 24,3%, а в геноме кукурузы – в среднем 39%. Ключевую роль в эффективности трансляции оказывает окружение AUG кодона – инициирующего кодона трансляции. Предполагается, что оптимальный контекст для инициации трансляции у животных и растений – AACAATUGC. Такая консенсусная последовательность (последовательность Козак [Kozak, 1986]), играющая важную роль в инициации трансляции у эукариот, включает 4-6 нуклеотидов, предшествующих старт-кодону, и 1-2 нуклеотида непосредственно после старт-кодона. Особую роль в данной последовательности играют нуклеотиды в положениях -3 и +4. Следует подчеркнуть, что для выяснения роли нуклеотидов в – 3 и +4 положениях из окружения инициирующего кодона в обеспечении высокого уровня экспрессии необходим сравнительный анализ данных частоты встречаемости нуклеотидов в этих положениях и уровня экспрессии генов растений. С использованием программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene для совокупности генов с различным уровнем экспрессии рассчитана частота каждого нуклеотида (A, T, G или C) в положении – 3 и +4 из окружения инициирующего кодона. Для анализа взаимосвязи между нуклеотидами в –3 и +4 положениях из окружения инициирующего кодона и уровнем экспрессии, были сформированы три группы генов с уровнем относительной экспрессии. Согласно такому разделению 88,7%, 8,2 и 3,1% генов арабидопсиса имеют уровни экспрессии от 0 до 50, от 51 до 100 и от 101 и выше, соответственно. Проведенный анализ позволил выявить следующие закономерности: у 68,4% и 67,6% генов с уровнем относительной экспрессии от 51 до 100 и от 101 и выше, соответственно, в положении – 3 встречается нуклеотид А, а в положении +4 – нуклеотид G (с частотой от 0,6 и до 0,9); у 1,4% генов с уровнем относительной экспрессии от 0 до 51 в положении –3 встречается нуклеотид А, а в положении +4 – нуклеотид G (с частотой от 0,6 и до 0,9). Последующий анализ генов растений с использованием программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene позволил выяснить, что нуклеотид G в положении +4 встречается у более 50% генов разных видов растений. Одним из основных правил жизни белкового продукта является правило «N-конца» (N-end rule), которое гласит: время полу-жизни белка определяется конкретным N-концевым аминокислотным остатком его полипептидной цепи [Bachmair et al., 1986; Varshavsky, 1996; Hu et al., 2005; Tasaki and Kwon, 2007]. Таким образом, были выделены дестабилизирующие а.о., определяющие время жизни белка. Интересно, что у дестабилизирующих аминокислотных остатков (а.о.) есть своя иерархия: некоторые а.о., названные первичными дестабилизирующими а.о., непосредственно узнаются убиквитин-лигазами, другие (вторичные и третичные) - требуют дополнительной модификаций перед узнаванием системой убиквитинирования [Worley et al., 1998]. К третичным дестабилизирующим а.о. относятся глутамин (Gln), аспарагин (Asn) и цистеин (Cys), к вторичным - глутаминовая (Glu) и аспарагиновая (Asp) кислоты; а к первичным – аргинин (Arg), лизин (Lys), гистидин (His), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), фенилаланин (Phe), триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и пролин (Pro). К стабилизирующим аминокислотным остаткам относятся метионин (Met), глицин (Gly), валин (Val), треонин (Thr), серин (Ser) и аналин (Ala) [Worley et al., 1998]. Анализ генов растений с использованием программного обеспечения базы данных FlowerPlantGene позволил выяснить некоторые закономерности распределения вторых кодонов в кодирующих областях генов растений разных видов. Для анализа были выбраны только кодоны, первый нуклеотид которых начинается с нуклеотида G. Среди вторых кодонов, первый нуклеотид которых начинается G, для генов арабидобсиса, кукурузы и риса к стабилизирующим аминокислотным остаткам принадлежат 35,2%, 39,8% и 44,9%, соответственно. При этом, отмечена высокая частота встречаемости второго кодона аланина у генов разных видов растений. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птиц | | Особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у allium... Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета –... |
| Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) | | Сергей Кириакович завриев Рнк-полимераза может выполнять механическую функцию транспорта фаговой ДНК в бактериальную клетку при инфекции, выявлен принципиально... |
| Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Каскадная регуляция экспрессии генов вируса осповакцины модулируется многоступенчатыми промоторами. Yang Z, Maruri-Avidal L, Sisler... | | Рнп 2 16050 “Изучение экспрессии гена sup35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae” реферат Рнп 2 16050 “Изучение экспрессии гена sup35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae” |
 | Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,... | | Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,... |
| Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,... | | Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,... |
| Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,... | | Реферат Понимание младшими подростками невербального проявления эмоциональной экспрессии Практическое значение. Данная работа может быть практическим пособием для психологов, учителей, родителей при изучении проявления... |
| Сравнительное изучение роста, развития и декоративных качеств сортов... Сравнительное изучение роста, развития и декоративных качеств сортов розы (rosa L.) Различных садовых групп в условиях московской... | | Изучение особенностей селекции аутореактивных т-клеток Охватывает и широчайший спектр т-клеток, специфичных к стадио- и органоспецифическим антигенам, включая «забарьерные» антигены тестиса,... |
| Progesterone, Thyroid Hormone and Relaxin in the Regulation of the... Апоптоз – важный определяющий элемент, регулирующий рост плаценты. Процесс апоптоза более активен в инвазивных evts, чем в их пролиферативных... | | «сравнительное правоведение» Сравнительное правоведение как учебная дисциплина относится к базовой части профессионального цикла магистерской программы 521401... |
