На правах рукописи
ЗВЕЗДОВА ЕКАТЕРИНА СЕЙРУЛЛОВНА
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СЕЛЕКЦИИ АУТОРЕАКТИВНЫХ Т-КЛЕТОК
14.00.14 - Онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
МОСКВА, 2008
Работа выполнена в НИИ Канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина Российской Академии Медицинских Наук.
Научный руководитель:
доктор биологических наук Д.Б. Казанский
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Н.Н. Тупицин
доктор медицинских наук, профессор А.А. Ярилин
Ведущая организация:
Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.
Защита состоится " " 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета (К.001.017.01) РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (115478 Москва, Каширское шоссе, 24).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
Автореферат разослан "____"___________ 2008 г.
Учёный секретарь
специального диссертационного совета
доктор медицинских наук Ю.А. Барсуков
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
Как сказал Ганс Стаусс, “Antitumor immunity is beneficial autoimmunity.” – «Противоопухолевый иммунитет это полезный аутоиммунитет.» Действительно, работы последних лет привели к пониманию того факта, что большинство антигенов опухолевых клеток представляют собой нормальные белки организма, экспрессируемые аберрантно, т.е. не в то время и не в том месте. В процессе своего нормального развития иммунная система теряет способность к распознаванию таких антигенов, как и прочих собственных антигенов организма. Центральная роль в этом разграничении распознавания «своего» и «чужого» принадлежит внутритимусной негативной селекции, устраняющей клоны Т-клеток с высокой авидностью к «своему». Этот процесс охватывает и широчайший спектр Т-клеток, специфичных к стадио- и органоспецифическим антигенам, включая «забарьерные» антигены тестиса, что обусловлено способностью тимусного эпителия к их стохастической экспрессии.
Вместе с тем дефекты тимусной селекции могут приводить к опасным заболеваниям, которые связаны с выживанием и активацией аутоиммунных клеток на периферии. То, каким образом аутореактивные Т-клетки избегают негативной селекции в тимусе, остается неясным. Понимание закономерностей этого процесса позволит найти способы управления специфичностью развивающихся Т-клеток, – а значит, с одной стороны, научиться лечить аутоиммунные заболевания, а с другой стороны, сделать аутоиммунитет действительно полезным для лечения опухолей.
1.2 Цель и задачи исследования.
Целью данной работы является исследование природы аутореактивных Т клеток и механизмов избегания ими негативной селекции. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить α и β цепи Т- клеточных рецепторов аутореактивных гибридом и проанализировать их СDR районы.
Определить специфичность TCR аутореактивных гибридом путем создания трансфектантов на основе линии тимомы 4G4, эскпресирующих α и β цепи ТCR полученных аутоиммунных гибридом в паре с корецепторами CD4 и CD8.
Выяснить роль корецептора CD4 в распознавании молекул МНС класса I.
Создать трансгенных животных, экспрессирующих TCR аутореактивной гибридомы 7.
Провести иммунофенотипирование и функциональный анализ Т клеток мышей, трансгенных по TCR ауторективной гибридомы 7.
1.3 Научная новизна.
Впервые в России нами были созданы трансгенные животные, экспрессирующие -цепь аутореактивного TCR, проанализирован репертуар Т-клеток трансгенных животных, селектированных в присутствии и отсутствие делетирующего лиганда- молекул МНС класса II, были выяснены возможные принципы внутритимусной селекции аутоиммунных Т-клеток и их миграции на периферию и детально исследована роль -цепи TCR в формировании специфичности TCR к антигенам. Нами было выяснено, что основным механизмом избегания аутореактивными Т-клетками негативной селекции является реаранжировка двух -цепей и последующая экспрессия двух Т-клеточных рецепторов на поверхности одной Т-клетки. Показана доминирующая роль корецептора CD4 над CD8 за проведение сигнала через TCR, что проясняет многие эффекты, наблюдаемые при селекции и дифференцировки Т-клеток в тимусе. Было выяснено, что -цепь TCR существенно влияет на его специфичность к аллельным вариантам молекул МНС. Причем наблюдаемый эффект обусловлен врожденным предпочтением вариабельных регионов TCR к взаимодействию с аллельными формами молекул MHC. Все это может иметь важное значение для выяснения способов управления специфичностью развивающихся Т-клеток и способов лечения, как аутоиммунных заболеваний, так и онкологических заболеваний.
1.4 Научно-практическая значимость исследования.
Результаты, полученные в ходе даной работы, могут быть использованы в фундаментальных исследованиях. Полученные данные способствуют пониманию особенностей селекции аутореактивных клеток и вносят новый вклад в представления о механизмах развития иммунопатологических состояний.
1.5 Апробация работы.
Диссертационная работа апробирована 25 июня 2008 года на совместной конференции лабораторий механизмов гибели опухолевых клеток, иммунологии онкогенных вирусов и механизмов регуляции иммунитета НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина.
Результаты опубликованы в 6 научных статьях в рецензируемых журналах и представлены 13 сообщениями на международных конференциях.
1.6 Структура и объём работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, собственных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 150 странице машинописного текста и включают 30 рисунков, 3 таблицы и список литературы из 177 источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.
Обзор литературы.
Обзор литературы посвящён описанию этапов созревания предшественников Т-лимфоцитов в тимусе и механизмов формирования разнообразия Т-клеточных рецепторов в процессе взаимодействия с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). Описаны механизмы детерминации Т-клеточных предшественников и их негативной и позитивной селекции..
Материалы и методы.
Лабораторные животные. В работе использованы мыши инбредных линий, полученные из разведения вивария Российского Онкологического Научного Центра РАМН: C57BL/6 (KbI-AbDb), C57BL/10 (KbI-AbDb), B10.D2(R101) (KdI-AdI-EdDb), C57BL/6J-H2bm1/ER(H-2bm1),C57BL/6J-H2bm12/ER(H-2bm12), C57BL/6J-H-2bm3 (Kbm3I-AbDb). Мыши, нокаутные по молекулам 2-микроглобулина - C57BL/6J-B2mtm1Unc (H-2b), транспортеров, ассоциированных с процессингом (TAP) - C57BL/6J-Tap1tm1Arp были получены из Jackson Laboratory (Bar Harbor, Main, USA) и поддерживались в лаборатории механизмов регуляции иммунитета НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН.
Выделение ДНК проводили по стандартной методике с использованием протеиназы К (Maniatis, 1989). Выделение РНК проводили с помощью реагента TRIZOL LS в соответствии с рекомендациями производителя (GibcoBRL, USA). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в следующем режиме: денатурация 94 оС – 2 мин; далее следовало 35 циклов: 94 оС – 1мин, 55 оС – 1мин, 72 оС – 1мин; последний синтез 72 оС – 10мин. Для ОТ-ПЦР (ПЦР после обратной транскрипции) использовали обратную транскриптазу SuperScript II и oligo (dT)15.
Клонирование с использованием ТА (pTZ57RT) вектора. Для клонирования TCR использовали TA Cloning Kit (Invitrogen, USA). Фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР, без предварительной очистки клонировали в вектор pCR 2.1 по протоколу, предложенному фирмой производителем.
Реакция MLR. Для постановки MLR 3х106 отвечающих спленоцитов (респондеров) инкубировали в присутствии аллогенных или сингенных стимуляторов, обработанных митомицином С ( 25 мкг/мл, 37oC, 30 мин ), в количестве 5х106 клеток на лунку 24-луночного плоскодонного планшета или 5х105 клеток в лунку 96-луночного круглодонного планшета. Для избирательной активации клеток памяти стимуляторы подвергали острому тепловому шоку инкубацией спленоцитов при 45оС в течение 60 минут, затем их добавляли в культуру в количестве 4х106 в лунку на лунку 24-луночного плоскодонного планшета или 4х105 клеток в лунку 96-луночного круглодонного планшета. Клетки инкубировали в полной ростовой среде: RPMI-1640 (ПанЭко, Россия), cодержащей 5% сыворотки человека, 0.016% гентамицина сульфата, 4 ммоль L-глутамина (Serva), 20 ммоль HEPES (Sigma) и 5 х 10-5 М 2-меркаптоэтанола (Merck) при 37оС в атмосфере с 5% CO2 и абсолютной влажностью в течение 72 часов. Пролиферацию клеток оценивали по включению 3Н-тимидина за последние 8 ч. Аллогенный ответ подсчитывали как разность между включением [3H]-тимидина в культуры с аллогенными и сингенными стимуляторами.
Цитотоксический тест (CTL). Цитотоксический тест. Активированные клетки из регионарных лифатических узлов после инкубации в течение 72 часов в полной среде и активированные клетки памяти из MLR очищали от погибших клеток центрифугированием (200g) на ступенчатом градиенте плотности фикол-верографина с плотностью 1,09 в течение 15 мин 200g. В качестве мишеней использовали трансфицированные белком GFP мастоцитому Р815 и тимому EL-4 в количестве 5х104 клеток на лунку. Клетки переносили в 96-луночный круглодонный планшет, осаждали центрифугированием (200g, 5 мин) и инкубировали в термостате при 37оС, 5% СО2 и 100% влажности 4 часа, затем анализировали количество оставшихся клеток-мишеней, экспрессирующих GFP, на проточном цитофлуориметре.
Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре. Для анализа клеток на проточном цитофлуориметре (FACScan, FACStar, FACSCalibur, Becton Dickinson, USA) использовали следующие моноклональные антитела фирмы PharMingen, USA: анти-TCR (Clone H57-597), анти-CD4 (Clone RPA-T4), анти-CD3 (Clone 145-2C11), анти-CD8(Clone 53-6.7), анти-CD8 (Clone H35-17.2), анти-TCR (Clone V65), анти-CD5 (Clone 53-7.3), анти-CD25 (Clone 2A3), анти-CD44 (Clone G44-26), анти-CD62L (Clone Dreg56), анти-CD69 (Clone FN50), анти-PD-1 (Clone J43), анти-V11 (Clone RR8-1), анти-V3 (Clone KJ25), анти-V5.1/5.2 (Clone MR9-4), анти-V8.3 (Clone 1B3.3), анти-V11 (Clone RR3-15). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson, Mountain View, CA) с использованием программного обеспечения CellQuest.
Клонирование полноразмерных цепей TCR и корецепторов CD4/CD8 в экспрессионные векторы. Продукты амплификации кДНК из гибридом, поднятые праймерами к полноразмерным цепям TCR обрабатывали рестриктазами, очищали с помощью набора фирмы QIAGEN (USA) выделяя их из агарозного геля и клонировали в ретровирусные экспрессирующие векторы рMigRI (-цепь) (Invitrogen, USA) и рMINV (-цепь) (Invitrogen, USA) Последовательности α и β цепей корецептора CD8, были любезно предоставлены Деном Литтманом в векторе pBS. Из вектора pBS последовательность CD8а и CD8b переклонировали в векторы pMSCVpuro(Сlontech, USA) и pMSCVhygro(Clontech, USA), соответсвенно. Последовательность корецептора СD4 была любезно предоставлена Червонским А.В. в векторе pcDNA3.1(+/-). Кодирующую последовательность СD4 переклонировали в лентивирусный вектор pLenti6/V5-D-TOPO(Invitrogen, USA).
Клонирование реаранжированной геномной ДНК и цепей TCR гибридомы 7 в кассетные векторы pT и pT. Продукты амплификации геномной ДНК из гибридомы 7, поднятые праймерами, специфичными к V и J сегменту α и β-цепи, обрабатывали рестриктазами клонировали в кассетные векторы pT и pT и секвенировали[Kouskoff V., et al., 1995].
Трансфекция линий пакующих фибробластов векторами и сбор вируса. Трансфекцию для векторов pМINV(Invitrogen) и pМigR1(Invitrogen) проводили на специальной линии пакующих фибробластов 293.1(Invitrogen), для вектора pLenti Topo-V6-D5 проводили на линии пакующих фибробластов 293FT, для векторов pMSCVpuro и pMSCVhygro проводили на линии пакующих фибробластов GP293.
Для трансфекции использовали Escort 4 transfection reagent (Sigma, USA), трансфекцию проводили в соответствие с рекомендациями фирмы производителя.
CTLL тест. 100 мкл супернатанта переносили в лунки 96 луночного круглодонного плэйта к 7-10 тыс. клеткам линии CTLL-2 в объеме 50 мкл. Предварительно клетки CTLL-2-3 раза отмывали от IL-2 в 1х ФСБ. Через 18 часов в лунки капали 10% по объему ALAMAR BLUE(Gibco), аналог НАДН-дегиброгеназы. Через 24 часа данные снимают на приборе MULTI SCAN при 540 и 620 длинах волн. Данные анализировали в программе Excel.
Получение транкированной формы CD4. С этой целью во фрагмент последовательности гена CD4 вместо триплета, кодирующего цистеин в позиции 420, ответственный за связывание с тирозиновой киназой Lck, вводили stop-кодон. Небольшой фрагмент кДНК гена CD4 около 300 пн поднимали праймерами, содержащими нативный сайт рестрикции к ферменту BamHI и искуственно введеный сайт рестрикции к ферменту XhoI, а также стоп-кодон. ПЦР продукт клонировали в вектор pTZ57RT и секвенировали во избежание мутаций. Последовательность кДНК оставшегося гена вырезали из вектора pcDNA при помощи ферментов Xho I и BamH I, сайты рестрикции которых находятся в векторе и гене CD4, соответственно. В последующем оба фрагмента клонировали в вектор pLenti6/V5-D-TOPO (Invitrogen, USA).
Результаты работы.
Клонирование и анализ TCR аутореактивных гибридом.
В нашей лаборатории был разработан метод получения Т-гибридом, экспрессирующих аутореактивные TCR, из Т-лимфоцитов мышей дикого типа, у которых все этапы дифференцировки тимоцитов проходили в отсутствие генетических изменений, что имеет большое преимущество перед моделями генномодифицированных животных, используемых как источник аутореактивных Т-клеток.
Нами был использован следующий метод получения Т-клеточных гибридом: клетки лимфатических узлов мышей линии С57BL/6 в смешанной культуре лимфоцитов(MLR) in vitro стимулировали аллогенными спленоцитами мышей линии С57BL/6J-H2 bm3/ER(H-2 bm3) предварительно обработанными митомицином С. Линия мышей С57BL/6J-H2 bm3/ER(H-2 bm3) отличается от линии С57BL/6 двумя точечными мутациями в молекуле Kb МНС класса I. С целью получения гибридом, бластные Т- клетки CD8+ сливали с клетками тимомы BW5147, экспрессирующей корецептор CD4 и CD8. Корецептор CD4 позволял Т- клеткам CD8+ распознавать молекулы МНС класса II. Полученные гибридомы тестировали по продукции IL-2 в ответе на сингенные молекулы Ab МНС класса II и отбирали аутореактивные гибридомы. Таким образом, нам удалось получить Т гибридомы из Т-клеток CD8, распознающих аллогенные молекулы Kbm3 МНС класса I и в тоже время способных распознавать сингенные молекулы Ab МНС класса II в присутствии корецептора CD4.
Чтобы более детально изучить особенности аутореактивных Т-клеточных рецепторов полученных аутореактивных гибридом, их специфичность и зависимость проведения активационного сигнала от корецепторов, из клеток гибридом выделяли мРНК. Методом RT-PCR с использованием праймеров для определения вариабельных сегментов α и β-цепей TCR анализировали, какие α и β-цепи экспрессируют гибридомы. Чтобы определить последовательности V(D)J сегментов TCR продукты амплификации клонировали в вектор pTZ57RT с последующим секвенированием реаранжированной области. Нами был произведен анализ T- клеточных рецепторов 18 аутореактивных гибридом.
У двух гибридом 7 и С11 обнаружилась экспрессия двух альфа цепей, ассоциированных с одной и той же цепью, причем у гибридомы 7 обе цепи принадлежат к одному семейству V11 и отличаются лишь точечными мутациями в вариабельном районе и J сегментом.
Чтобы исследовать специфичность аутореактивных TCR и зависимость проведения ими сигнала от наличия определенного корецептора, мы использовали систему in vitro, в которой в клетках тимомы 4G4 при помощи ретровирусной трансдукции индуцировали экспрессию аутореактивных TCR и корецепторов CD4/CD8. Ответ полученных трансфектантов оценивали по продукцию IL-2 в ответе на сингенные молекулы Ab МНС класса II спленоцитов мышей С57/BL6, аллогенные молекулы Kbm3 МНС класса I мышей С57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3). Для того, чтобы доказать специфичность TCR именно к молекуле Ab, клетки трансфектантов стимулировали в присутствие аллогенных молекул Abm12 МНС класса II мышей мышей C57BL/6J-H2bm12/ER(H-2bm12), отличающихся от молекулы Аb МНС класса II тремя точечными мутациями. Выяснилось, что трансфектант 4G47А1, экспрессирующий одну из -цепей гибридомы 7 в совокупности с -цепью, отвечает на сингенные спленоциты мышей C57BL/6, экспрессирующие молекулы Ab МНС класса II, в то время как вторая -цепь гибридомы 7 придает специфичность TCR к аллогенным молекулам Kbm3 МНС класса I (рис.1).
Анализ специфичности TCR гибридомы 1.1, полученной путем слияния BW5147 с CD8+ Т-клетками из мышей с искусственным аллельным исключением цепи (TCR+/-), показал, что клетки трансфектантов, экспрессирующих данный TCR, активируются в ответе как на сингенные спленоциты мышей С57BL/6, так и на аллогенные спленоциты мышей С57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3) (рис.2).
Из полученных результатов можно высказать предположение, что аутореактивные Т-клетки, выявляемые на периферии у мышей С57BL/6, дифференцируются по пути Т-клеток CD8+ и делятся на две популяции: Т-клетки, экспрессирующие два TCR, обладающие разной специфичностью в распознавании молекул МНС класса I и II, и Т-клетки, экспрессирующие один TCR, обладающий двойной специфичностью в распознавании как молекул МНС класса I, так и молекул МНС класса II.
Роль корецептора CD4 в распознавании молекул MHC класса I.
Одним из гипотетических механизмов избегания негативной селекции аутореактивными Т-клетками, рассмотренных ранее, является смена экспрессии корецептора СD4 на CD8 и изменение связываемого TCR лиганда в зависимости от экспрессии соответствующего корецептора. Такой механизм возможен в случае экспрессии двойного рестриктированного TCR, где экспрессия корецептора позволяет Т-клетке сделать выбор, будет ли она активированна за счет взаимодействия с молекулами МНС класса I, в случае экспрессии корецептора CD8, или за счет взаимодействия с молекулами МНС класса II, в случае экспрессии корецептора CD4. Мы решили выяснить, способен ли корецептор CD4 активировать Т-клетки, TCR которых специфически распознает молекулу МНС класса I или же корецептор CD4 способен выполнять роль корецептора CD8 в активации Т-клеток, распознающих молекулы МНС класса I. С этой целью была создана экспериментальная система, в которой на клетках трансфектантов 4G4, экспрессирующих TCR, специфичный к молекулам МНС класса I, помимо корецептора CD8 или вместо него экспрессируется корецептор CD4, создав такую ситуацию, когда TCR и корецептор специфичны к разным молекулам МНС. В качестве источника TCR, распознающего молекулы МНС класса I, был взят TCR гибридомы 1D1, которая была получена в результате слияния СD8+ Т-клеток. Активация клеток гибридомы 1D1 зависит от присутствия молекул Kb МНC класса I и наличия корецептора CD8. Анализ трансфектантов 4G4, экспрессирующих TCR гибридомы 1D1, показал, что вне зависимости от наличия или отсутствия корецепторов, трансфектанты 4G4 специфично распознают молекулы МНС класса I, так как активация не наблюдается при инкубации клеток с АРС мышей TAP-/- и 2m-/-. Причем, в случае экспрессии корецептора CD8, распознавание зависит от него, в случае экспрессии корецептора CD4, распознавание зависит от корецептора CD4, что определялось в тесте блокированием активации антителами к соответствующим молекулам (рис.3). Эти результаты показывают, что Т-лимфоцит, специфичный к молекуле MHC класса I может успешно активироваться в присутствии корецептора, не совпадающего по специфичности с TCR. Удивительным оказалось то, что ответ трансфектанта 4G41D1DP, экспрессирующего оба корецептора, на молекулы МНС класса I блокируется антителами к молекуле Ab МНС класса II или антителами к молекуле CD4, но не антителами к молекуле CD8 (рис.3). Таким образом, в системе, где на клетках тимомы экспрессируется TCR и оба корецептора, корецептор CD4 функционально доминирует над корецептором CD8 за проведение активационного сигнала и активация клеток трансфектантов требует одновременного связывание TCR с молекулами МНС класса I и корецептора CD4 с молекулами МНС класса II.
Трансфектанты, экспрессирующие мутантный корецептор CD4, сохраняют способность к активации в ответе на молекулу MHC класса I, что свидетельствует о независимости активации трансфектантов 4G4 от сигнальной функции корецептора CD4. По всей видимости, реализация эффекта доминирования обусловлена конкурентными взаимоотношениями корецепторов CD4 и CD8 в ходе формирования иммунологического синапса.
Анализ периферического пула Т-лимфоцитов мышей 7A1tg -цепи аутореактивного TCR.
Создание мышей трансгенных по -цепи TCR. Реаранжированная геномная ДНК и цепей TCR гибридомы 7 клонировали в специальные кассетные векторы для создания TCR трансгенных мышей pTa и pTb.
Полученные конструкции аутореактивной - цепи TCR гибридомы 7 инъецировали в ооциты мышей C57BL/6, оплодотворенные самцами той же линии. Было получено пять независимых трансгенных линий мышей-7A13048, 7A13000, 7A12997, 7A12993, 7A13069 одна из которых линию 7A12997 использовали в экспериментах. Экспрессию трансгенной альфа-цепи определяли методом PCR и окрашиванием лимфоцитов моноклональными антителами к семейству Va11 и последующим анализом на FACScan (см. рис. 4).
Фенотипирование Т-клеток трансгенных мышей. 70-87% клеток СD3+ лимфоидных органов трансгенных по -цепи TCR экспрессируют трансгенную V11 цепь, ассоциированную с разнообразными -цепями TCR V8.3, V3, V11,V5.1/5.2. В тимусе трансгенных мышей выявлено значительно сниженное количество клеток на стадии DP и повышенное количество тимоцитов DN по сравнению с мышами дикого типа C57BL/6 (рис. 5).
В периферическом пуле СD3+ Т-клеток трансгенных мышей обнаруживаются двоекратное снижение Т-клеток CD8+ и CD4+ и 10 кратное увеличение популяции Т-клеток DN (рис.5). Повышенное количество тимоцитов DN не связано с неэффективной позитивной селекцией, так как больших различий в уровне экспрессии маркеров зрелости лимфоцитов HSA и CD69 между трансгенными и мышами дикого типа не наблюдается. Повышенное количество тимоцитов DN не связано с усиленной негативной селекцией Т-клеток на основе линии C57BL/6, так как окрашивание клеток тимуса Annexin V не выявило увеличения количества апоптозирующих клеток в тимусе мышей 7a1tg(H-2b) по сравнению с мышами C57BL/6. Цитофлуориметрический анализ показал накопление тимоцитов на стадии DN3 и снижение количества клеток на стадии DN4 у мышей 7A1tg(H-2b). На стадии DN3 тимоциты начинают экспрессировать реаранжированную -цепь TCR в комплексе с сурогатной -цепью pT. У мышей с трансгенной экспрессией -цепи TCR, комплекс пре-TCR замещается на TCR. Повышенное количество клеток в стадии DN3 у мышей 7A1tg(H-2b) наводит на мысль о том, что эти DN тимоциты, экспрессирующие полностью реаранжированный TCR, могут связываться с внутритимусными лигандами и дифференцироваться в зрелые Т-клетки без перехода в стадию DP.
Одним из механизмов подавления активации аутореактивных Т-клеток является экспрессия ингибиторных рецепторов CTLA-4 и PD-1, которые активируются на Т-лимфоцитах в ответ на активацию. В мышах, дефицитных по экспрессии CTLA-4 и PD-1наблюдается массивная аккумуляция Т-клеток реактивных к «своему» в периферических лимфоидных и нелимфоидных органах, что приводит к гибели в течении 3-4 недель жизни. Окрашивание клеток тимуса и лимфатических узлов на молекулы CTLA-4 и PD-1 выявило повышенную экспрессию молекул PD-1 и CTLA-4 на тимоцитах CD4+ и в периферических Т-клетках CD4+ трансгенных животных 7A1tg(H-2b). У мышей 7A1tgbm12, которые отличаются от мышей 7A1tg(H-2b) тремя точечными мутациями в молекуле -цепи Ab (аминокислотные остатки 67, 70, 71) и у которых селекция трансгенных Т-клеток в тимусе мышей bm12 происходит в отсутствие делетирующего лиганда в виде молекул Ab МНС класса, экспрессия молекул CTLA-4 и PD-1 на тимоцитах и Т-клетках мышей схожа с экспрессией этих же молекул на тимоцитах и Т-клетках мышей C57BL/6(рис. 7).
Молекула CD5 функционирует как негативный регулятор сигнала через TCR. У мышей с трансгенной экспрессией TCR, в отсутствие экспрессии молекулы CD5, наблюдается усиленная негативная селекция тимоцитов. Окрашивание клеток тимуса и лимфатических узлов молекулу CD5 выявило повышенную экспрессию данной молекулы в клетках на всех стадиях развития тимоцитов, за исключением стадии DN, а также на периферических Т-клетках CD4+ у мышей 7A1tg(H-2b) (рис.6). Это свидетельствует о том, что селектирующиеся тимоциты, экспрессируют TCR, включающий в себя трансгенную -цепь Va11, обладающий высокой авидностью к сингенной молекуле Ab МНС.
Таким образом, у мышей 7a1tg(H-2b) с трансгенной экспрессией только -цепи аутореактивного TCR наблюдается селекция Т-клеток CD4 с фенотипом клеток высокоафинных к собственным лигандам.
Функциональность Т-клеток трансгенных мышей. Двумя независимыми группами ученых было показано, что TCR обладает врожденной способностью распознавать молекулы МНС. Это сродство определяется CDR1 и CDR2 районами (районы, определяющие комплементарность) вариабельных участков альфа- и бета-цепей TCR, кодированных в геноме. До сих пор остается неизвестным какой вклад в распознавание молекул МНС вносят CDR районы альфа- и бета-цепей в отдельности. Полученные в нашей лаборатории животные с трансгенной экспрессией -цепи TCR служат удобной моделью для изучения вклада -цепей в распознавание молекул МНС. Поэтому, мы решили оценить ответ Т-лимфоцитов трансгенных мышей в реакции MLR на аллогенные молекулы МНС классов I и II. Удобной системой для исследования данного вопроса служит панель линий мышей-мутантов, отличающих от мышей С57BL/6 точечными мутация в молекулах МНС класса I и II. Т-клетки трансгенных мышей активировали в присутствие сингенных спленоцитов мышей C57BL/6, а также аллогенных стимуляторов- мышей C57BL/6J-H2bm1/ER(H-2bm1), C57BL/6J-H-2bm3 (Kbm3I-AbDb), экспрессирующих аллогенные молекулы МНС класса I-Kbm1, Kbm3 мышей C57BL/6J-H2bm12/ER(H-2bm12), экспрессирующих аллогенные молекулы МНС класса II-Abm12, и мышей B10.D2(R101), экспрессирующих аллогенные молекулы МНС класса I(Kd) и II(Ad, Ed). Т-клетки трансгенных мышей как не способны пролиферировать в ответ на сингенные молекулы МНС мышей C57BL/6 и на аллогенные молекулы МНС класса I- Kbm1 и Kbm3, ответ на аллогенные молекулы МНС класса II- Abm12 значительно снижен, в то время как ответ на спленоциты мышей B10.D2(R101)(KdDbId) превышает ответ Т-клеток мышей дикого типа в 2-4 раза (рис.7). Цитофлуориметрический анализ клеток, пролиферирующих в MLR, показал, что в ответ на спленоциты мышей B10.D2(R101) усиленно пролиферируют трансгенные Т-клетки c фенотипом V11+CD8+ и V11+DN, тогда как активации Т-клеток CD4+ не наблюдается (рис.8). Усиленный ответ Т-лимфоцитов трансгенных мышей на молекулы Kd может быть связан с преобладанием в периферическом пуле Т-клеток 7А1tg клонов Т-клеток, специфичных к данной молекуле. Так как каждый клон Т-клеток у трансгенов 7А1, экспрессирует TCR, состоящий из одной и той же -цепи Va11, ассоциированной с разнообразными -цепями, можно заключить, что -цепь существенно влияет на специфичность TCR к аллельным вариантам молекул МНС. Более того, Т-клетки мышей трансгеннов 7А1tg способны проявлять цитотоксическую функцию против мастоцитомы Р815, экспрессирующей аллогенные молекулы МНС класса I KdDd, а также формировать Т-клетки памяти.
Чтобы выяснить формируется ли специфичность репертуара к молекулам МНС во время позитивной селекции или же она является врожденной, мы скрестили мышей 7А1tg(С57BL/6) с мышами линии С57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3) с целью оценки ответа трансгенных Т-клеток, прошедших селекцию в присутствии молекул МНС класса I. Линия мышей С57BL/6J-H2bm3/ER(H-2bm3) отличается от линии мышей С57BL/6 двумя точечными мутациями в аминокислотных остатках 77 и 89 -цепи молекулы Kb МНС класса I.
Пролиферативный ответ Т-клеток трансгенных животных 7A1tg(H-2bm3) и 7A1tg(H-2b), 7A1(tgbl6/bm3) схож, активации на аллогенные спленоциты мышей bm3, bm1 не наблюдается, тогда как ответ на спленоциты мышей B10.D2(R101) неизменно высок. Таким образом, вне зависимости от вида позитивно селектирующих молекул трансгенный TCR распознает аллогенные молекулы МНС сходным образом, что прямо подтверждает гипотезу Ерне о том, что специфичность TCR к молекулам МНС заложена в структуре V-генов, а не формируется во время позитивной селекции в тимусе, как это предполагалось ранее.
Распознавание молекул Ab МНС класса II Т-клетками трансгенных мышей 7А1tg. Трансгенные мыши 7А1tg были сделаны на основе линии C57BL/6, которая несет молекулы МНС класса II-Ab, являющиеся делетирующим лигандом для TCR, в состав которого входит V11 цепь. В силу негативной селекции, которой подвергаются трансгенные V11+ клетки, нам не удается увидеть ответ на сингенные молекулы МНС класса II и выяснить какие Т-клетки активируются в данном ответе. С этой целью мы перевели трансгены 7А1tg(С57BL/6) на линию мышей bm12, что позволит трансгенным Т-клеткам селектироваться в отсутствие делетирующего лиганда в виде молекул Ab МНС класса II.
Как видно из рис.9 Т-клетки мышей 7A1(H-2bm12) пролиферируют в ответ на спленоциты мышей C57BL/6, bm3, bm1 и B10.D2(R101). Чтобы проверить, в ответе на какие молекулы МНС-класса I или II- активируются Т-клетки мышей 7A1(H-2bm12), в качестве стимуляторов использовали спленоциты мышей TAP-/-(H-2b) и 2m-/-(H-2b), дефицитных по молекулам МНС класса I. Как видно трансгенные Т-клетки пролиферируют в ответ на спленоциты мышей TAP-/- и 2m-/-, следовательно, Т-клетки 7A1(H-2bm12) активируются в ответе на молекулы Ab МНС класса II. Цитофлуориметрический анализ клеток, пролиферирующих MLR, показал, что в ответ на спленоциты мышей C57BL/6 и TAP-/- практически вдвое увиличивается количество Va11+CD4+ Т-клеток, в 3 раза Va11+CD8+ и в 1.5 раза- Va11+DN Т-клеток. (рис.10).
Таким образом, Т-лимфоциты мышей 7А1tgbm12, селектированные в отсутствие делетирующего лиганда в виде молекул Ab МНС класса II сохраняют способность к активации в ответ на спленоциты, экспрессирующие данные молекулы МНС класса II.
|
