Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium -опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные белки

Таким образом, проведенный поиск нуклеотидных последовательностей, которые могут позитивно влиять на уровень транскрипции, трансляции и стабильности целевых белков в растениях с использованием биоинформационного анализа созданной базы данных и анализа литературы позволяет сделать следующие заключения: 5’-область гена AT1G67090, имеющего наивысший уровень экспрессии в растении в целом, и в листьях, в частности, может быть использована как регуляторный элемент, позитивно влияющий на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях; промоторы вирусов могут быть тестированы в качестве потенциальных регуляторных элементов, способных в значительной степени увеличить уровень транскрипции целевых генов в растениях; GC-богатые области, ассоциированные с генами растений, характеризующимися высоким уровнем экспрессии, могут быть потенциальными регуляторными элементами, позитивно влияющими на уровень транскрипции гетерологичных генов в растениях; нуклеотид А в –3 и нуклеотид G в +4 положениях из окружения инициирующего кодона могут играть ключевую роль в увеличении эффективности трансляции генов растений; свойства второго кодона в последовательности белка могут в значительной степени повлиять на стабильность белкового продукта в растениях. 3.2. Создание модульных векторов для апробации регуляторных элементов c использованием бирепортерных генов 3.2.1. Конструирование бифункциональных репортерных генов licB::rfp и egfp::licB и их апробация в бактериальных клетках В качестве репортерных генов нами предложены бирепортерные гены, имеющие транскрипционно-трансляционное слияние гена, кодирующего термостабильную лихеназу с геном, кодирующим красный флуоресцентный белок (licB::rfp), и с геном зеленого флуоресцентного белка (egfp::licB). Для создания бирепортерных генов первоначально была проведена ПЦР. В качестве матрицы для создания плазмид, несущих бирепортерные гены, были использованы плазмиды pQE30-LicBM3 (из коллекции лаборатории), pQE30-EGFP (из коллекции лаборатории) и Gateway® TagRFP-AS-C (ЗАО «Евроген», Россия), а также специально подобранные олигонуклеотидные последовательности. Методами молекулярного клонирования были полученные бактериальные вектора pQE30-EGFP-LicBM3 и pQE30-LicBM3-RFP, которые затем были апробированы в бактериальных клетках на функциональность всех репортерных генов. Корректность сборки бактериальных векторов была подтверждена рестрикционным анализом. Первоначально, бактериальные трансформанты, несущие плазмидные вектора, были проанализированы методом чашечного теста для того чтобы показать, что лихеназа в составе гибридных белков сохраняет свои основные свойства (рис. 1). Рисунок 1. Чашечный тест бактериальных трансформантов: pQE30-LicBM3-RFP, pQE30-EGFP-LicBM3, pQE30-RFP, pQE30-EGFP, K+ - положительный контроль (pQE30-LicBM3), K- - отрицательный контроль (pQE30). Для того чтобы показать, что красный флуоресцентный белок в составе гибридного белка сохраняет свои основные свойства, бактериальные трансформанты, несущие плазмидный вектор pQE-LicBM3-RFP, были проанализированы методом флуоресцентной микроскопии (рис. 2). Рисунок 2. Флуоресцентная микроскопия бактериальных трансформантов: pQE30-LicBM3-RFP – сконструированный плазмидный вектор; K+ - положительный контроль (pQE30-RFP); K- - отрицательный контроль (pQE30-LicBM3). Для того чтобы показать, что зеленый флуоресцентный белок в составе гибридного белка сохраняет свои основные свойства, бактериальные трансформанты, несущие плазмидный вектор pQE-EGFP-LicBM3, были проанализированы методом чашечного теста (данные в автореферате не приводятся). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в составе гибридных белков сохраняют свои основные свойства как лихеназа, так и красный флуоресцентный белок и зеленый флуоресцентный белок – активность, термостабильность и способность к флуоресценции, соответственно. Для того, чтобы доказать, что в клетках прокариот происходит образование гибридных белков, белковые бесклеточные лизаты были проанализированы методом энзимограмм (рис. 3). Рисунок 3. Энзимограмма белковых бесклеточных лизатов: RL – pQE30-EGFP-LicBM3, LR – pQE30-LicBM3-RFP, K – pQE30-LicBM3, M – маркер белкового веса (kDa). Как видно из представленных данных (рис. 3), в клетках бактерий образуются гибридные белки, молекулярная масса которых соответствует теоретически рассчитанной – около 52 кДа. (LicBM3 – 25 кДа, RFP – 27 кДа, EGFP – 27 кДа). 3.2.2 Описание и создание модульных векторов серии pPGG и pVIG-S Первоначально, на основе данные анализа литературных источников, а также с учетом недостатков экспрессионных векторов, которые предложены и используются в настоящее время, нами разработаны и сконструированы две серии модульных экспрессионных векторов. В первой серии векторов, обозначенной нами как pPGG, предлагается учесть большинство факторов, способных обеспечить эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях, а именно: окружение инициирующего ATG кодона целевого гена; последовательности, кодирующие стабилизирующие аминокислоты во втором положении после инициирующего кодона; локализация и состав кодонов, терминирующих транскрипцию; оптимальный состав области полиаденилирования. Базовый вектор этой серии имеет небольшой размер и предназначен для клонирования целевых генов и регуляторных элементов, поскольку модульная структура вектора позволят легко проводить замену регуляторных элементов, контролирующих экспрессию гетерологичного гена в растениях, таких как промоторы, последовательности лидерных пептидов, последовательности 3'- и 5'-НТО, важных для эффективной экспрессии трансгена, а также целевых генов (рис. 4). Рисунок 4. Модульные экспрессионные вектора pPGG (A), pVIG-S (B). R1 – SacI; R2 – SpeI; R3 – SphI; R4 – KpnI; R5 – ApaI; R6, R13 – BamHI; R7 – EcoRI; R8 – SmaI; R9 – XbaI; R10 – HpaI; R11 – XhoI; R12 – SalI; LB и RB – левая и правая граница Т-ДНК области; oriV – точка начала репликации для агробактерий; Ampr – кассета устойчивости к ампицилину; Kanr – кассета устойчивости к канамицину; pUC ori – точка начала репликации для E.coli; 35S – CaMV 35S промотор; polyA – сигнал полиаденирования; Nos – промотор нопалин синтетазы; NOS T – терминирующая последовательность гена нопалин синтетазы. На основе базового вектора этой серии сконструированы модульные вектора серии pPGG, в которых клонированы последовательности разных бирепортерных генов (gfp::licB, licB::rfp), а также регуляторных элементов, такие как лидерные последовательности экстенсина Lex (обеспечивает вынос белка в апопласт растительной клетки) [Piruzian E.S. et al., 2002.; Э.С.Пирузян и др., 2000; Jouzani G. S., Goldenkova I. V., 2008], малой субъединицы РБФК\О Lch (обеспечивает транспорт белка в хлоропласты) [Э.С.Пирузян и др., 2000] и последовательности, обеспечивающие транспорт белка и его удержание в эндоплазматическом ретикулуме LeB4 и SRKDEL [Alanen H. I. et al., 2011]. Помимо этого, в 5’-НТО была клонирована (GC)n-обогащенная последовательность (рис. 5). Следует подчеркнуть, что между последовательностями репортерных генов включен сайт рестрикции, что дает возможность использовать любой репортерный ген для трансрипкционно-трансляционного слияния с последовательностями целевых генов. Рисунок 5. Серия модульных векторов на основе вектора pPGG. R1 – SacI; R2 – SpeI; R3 – SphI; R4 – KpnI; R5 – ApaI; R6 – BamHI; R7 – EcoRI; R8 – SmaI; R9 – XbaI; R10 – HpaI; R11 – XhoI; R14 – SalI; R15 – PstI; R16 – HindIII; LicBM3 – ген, кодирующий термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum; RFP – ген tagRFP, кодирующий красный флуоресцентный белок; GFP – ген egfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок; LeB4 – лидерный сигнал гена LeB4 (легумина типа B4) гороха Vicia faba; KDEL – последовательность в 3’-концевой области целевого гена, кодирующая аминокислоты С-концевой области белка; lex – лидерный сигнал гена экстенсина моркови; lch – лидерный сигнал, способный направлять продукт целевого гена в хлоропласты; (CG)n - последовательность, обогащенная CG нуклеотидами; 35S – CaMV 35S промотор; polyA – сигнал полиаденирования. Вторая серия векторов, обозначенная нами pVIG-S (рис. 6), предназначена для клонирования экспрессионных модулей векторов серии pPGG и для изучения стабильной экспрессии гетерологичных генов в растениях. Вектор pVIG-S сконструирован на основе плазмиды pICH6692. Этот вектор имеет размер 6342 п.н. В Т-ДНК область вектора включены следующие последовательности: селективный ген nptII, экспрессия которого контролируется Pnos промотором и nos терминатором; последовательность полилинкера, включающая уникальные сайты с интегрированным между ними случайной последовательности ДНК, для простой процедуры переноса экспрессионного модуля из вектора pPGG. На основе базового вектора pVIG-S были сконструированы вектора для изучения исследуемых регуляторных элементов (рис. 6). Рисунок 6. Серия модульных векторов на основе вектора pVIG-S для стабильной экспрессии трансгена. R1 – SacI; R2 – SpeI; R4 – KpnI; R5 – ApaI; R6 – BamHI; R7 – EcoRI; R8 – SmaI; R9 – XbaI; R10 – HpaI; R11 – XhoI; R14 – SalI; R15 – PstI; R16 – HindIII; LicBM3 – ген, кодирующий термостабильную лихеназу Clostridium thermocellum; RFP – ген tagRFP, кодирующий красный флуоресцентный белок; GFP – ген egfp, кодирующий зеленый флуоресцентный белок; LeB4 – лидерный сигнал гена LeB4 (легумина типа B4) гороха Vicia faba; KDEL – последовательность в 3’-концевой области целевого гена, кодирующая аминокислоты С-концевой области белка; lex – лидерный сигнал гена экстенсина моркови; lch – лидерный сигнал, способный направлять продукт целевого гена в хлоропласты; (CG)400, (GC)2000 - последовательности, обогащенные CG нуклеотидами разной длины и композиции; 35S – CaMV 35S промотор; polyA – сигнал полиаденирования; LB и RB – левая и правая граница Т-ДНК области; oriV – точка начала репликации для агробактерий; Ampr – кассета устойчивости к ампицилину; Kanr – кассета устойчивости к канамицину; pUC ori – точка начала репликации в E.coli; Nos – промотор нопалин синтетазы; NOS T – терминирующая последовательность гена нопалин синтетазы. 3.3. Апробации модульных векторов с репортерными генами и различными регуляторными элементами Для того чтобы продемонстрировать обеспечение экспрессии бирепортерных генов в составе сконструированных векторов серии pVIG-S, полученными экспрессионными векторами проведена трансформация агробактериального штамма GV3101 и далее полученными агробактериальными трансформантами была проведена агробактериальная инфильтрация растений табака N. benthamiana. Эффективность процесса агроинфильтрации оценивали по флуоресценции зеленого флуоресцентного белка, который экспрессируется в составе бирепортерного белка (GFP::LicB) (рис.7). Рисунок 7. Флуоресценция зеленого флуоресцентного белка в листьях растений табака Nicotiana benthamiana через 4 дня после агроинфильтрации. Через 4 суток после агроинфильтрации из зараженных частей листьев готовили белковые экстракты. Первоначально белковые экстракты были проанализированы методом чашечного теста на наличие лихеназной активности (рис. 8). Рисунок 8. Чашечный тест на активность лихеназы в белковых листьях растений табака Nicotiana benthamiana через 4 дня после агроинфильтрации. Ряд А – лунка А1 – белковый лизат бактериального трансформанта, экспрессирующего термостабильную лихеназу (положительный контроль); Ряд Б - белковые лизаты контрольных растений; ряд В – белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 35S-Lch-G-L; ряд Г – белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 35S-Lex-G-L; ряд Д – белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 35S-LeB4-G-L-KDEL; ряд Е – белковые лизаты растений с агроинфильтрацией вектором 35S-S1-G-L и 35S-S2-G-L. Как видно из результатов, представленных на рисунке 8, активность лихеназы выявлена в белковых лизатах, полученных из листьев растений табака после агроинфильтрации. Для доказательства синтеза в растениях белковых продуктов бирепортерного гена, белковые лизаты, полученных из листьев растений табака после агроинфильтрации, проанализированы методом энзимограмм (рис. 9). 1 2 3 Р 52 кДа 25 кДа исунок 9. Пример энзимограмм на активность лихеназы в белковых лизатах, полученных из листьев растений табака Nicotiana benthamiana через 4 дня после агроинфильтрации. 1, 2 и 3 – белковые лизаты растений после агроинфильтрации векторами 35S-LicB, 35S-G-L и 35S-LeB4-G-L-KDEL. Как видно из результатов, представленных на рисунке 8, в листьях растений табака Nicotiana benthamiana происходит образование белкового продукта бирепортерного гена. Для сравнительного анализа эффективности тестируемых регуляторных элементов был определен уровень накопления бирепортерного белка в листьях растений табака Nicotiana benthamiana при агроинфильтрации. Оценку уровня накопления рассчитывали по активности лихеназы, как части бирепортерного белка, в перерасчете на суммарный растворимый белок. На рисунке 10 представлены суммируемые результаты тестирования эффективности регуляторных элементов. Рисунок 10. Сравнительный анализ эффективности регуляторных элементов, тестированных в растениях табака Nicotiana benthamiana при агроинфильтрации Как видно из результатов, представленных на рисунке 10, все тестированные регуляторные элементы обеспечивают более высокий уровень накопления белкового продукта бирепортерного гена в растительных клетках по сравнению с контролем. При этом уровень накопления белкового продукта бирепортерного гена при использовании лидерного сигнала, обеспечивающего транспорт и удержание белкового продукта в эндоплазматическом ретикулуме (35S-LeB4-G-L-KDEL), превышает такой контроля (35S-G-L) приблизительно в 2,5 раз, при использовании лидерных сигналов для локализации в хлоропласты (35S-lch-G-L) и межклеточном пространстве растительных клеток (35S-lex-G-L) – на 0,2 и 0,5 раза. При тестировании 5’-нетранслируемых GC-богатых областей разной доины и композиции (35S-S1-G-L (размер 405 п.н., GC-содержание 62,0) и 35S-S1-G-L (размер 2025 п.н., GC-содержание 62,5) в отношении их эффективности обеспечивать высокоэффективную экспрессию, и, как следствие, накопление белкового продукта показано, что эти регуляторные последовательности обеспечивают высокий уровень накопления белкового продукта бирепортерного гена, который в 2,5 и 3,5 раза, превышает таковой для контроля.

Похожие:

	Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птиц		Особенности хромосомной организации протеин-кодирующих генов у allium... Работа выполнена в научно-образовательном Центре молекулярной биотехнологии Российского государственного аграрного университета –...
	Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия)		Сергей Кириакович завриев Рнк-полимераза может выполнять механическую функцию транспорта фаговой ДНК в бактериальную клетку при инфекции, выявлен принципиально...
	Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Каскадная регуляция экспрессии генов вируса осповакцины модулируется многоступенчатыми промоторами. Yang Z, Maruri-Avidal L, Sisler...		Рнп 2 16050 “Изучение экспрессии гена sup35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae” реферат Рнп 2 16050 “Изучение экспрессии гена sup35 дрожжей Sacchoromyces cerevisiae”
	Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,...		Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,...
	Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,...		Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,...
	Программа дисциплины «сравнительное правоведение: сравнительное конституционное... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов специальности 030900. 68 «Юриспруденция»,...		Реферат Понимание младшими подростками невербального проявления эмоциональной экспрессии Практическое значение. Данная работа может быть практическим пособием для психологов, учителей, родителей при изучении проявления...
	Сравнительное изучение роста, развития и декоративных качеств сортов... Сравнительное изучение роста, развития и декоративных качеств сортов розы (rosa L.) Различных садовых групп в условиях московской...		Изучение особенностей селекции аутореактивных т-клеток Охватывает и широчайший спектр т-клеток, специфичных к стадио- и органоспецифическим антигенам, включая «забарьерные» антигены тестиса,...
	Progesterone, Thyroid Hormone and Relaxin in the Regulation of the... Апоптоз – важный определяющий элемент, регулирующий рост плаценты. Процесс апоптоза более активен в инвазивных evts, чем в их пролиферативных...		«сравнительное правоведение» Сравнительное правоведение как учебная дисциплина относится к базовой части профессионального цикла магистерской программы 521401...